BCA蛋白浓度测定-酶标仪法.doc

BCA法测定蛋白浓度-酶标仪
一、药品
1. BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，500次酶标仪，碧云天），含以下成分：
a) BCA试剂A（P0012-1，100ml，碧云天），室温保存
b) BCA试剂B（P0012-2，3ml，碧云天），室温保存
c) 蛋白标准（5mg/ml BSA）（P0012-3，1ml，碧云天），-20度保存
二、仪器和试剂
1. 酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm最佳），水浴锅
2. 96孔单条可拆酶标板（平底）
3. 15 ml 离心管1个（准备BCA工作液用）
4. 1.5 ml 离心管1个（准备蛋白标准品工作液用）
5. 单道移液器和枪头，8道移液器（排枪）和枪头
6. PBS
三、操作步骤
1. 水浴锅调至37℃。
2. 蛋白标准品工作液（1 mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20℃冰箱中取出，完全溶解并混匀。取60μl 蛋白标准品（5mg/ml），加入240μl PBS，即稀释5倍，即配成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。
3. 计算BCA工作液总量= 0.2 ml×（样本数+8）×2×1.1（标准品和样本均需测复孔）。BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1），需充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

样本数(n)
1~5
6~7
8~10
11~12
13~14
15~16
17~19
20~21
22~23
24~26
A（ml）
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
B（ml）
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0.22
0.24
0.26
0.28
0.3
总量(ml)
6.12
7.14
8.16
9.18
10.2
11.22
12.24
13.26
14.28
15.3

4. 按下表配制8个蛋白标准液（S0~S7），充分摇匀。

单条酶标板

蛋白标准品工作液
（1 mg/ml）(ml)
PBS
(ml)
蛋白标准品终浓度
(mg/ml)
A

S0
0
100
0
B

S1
5
95
0.05
C

S2
10
90
0.1
D

S3
20
80
0.2
E

S4
30
70
0.3
F

S5
40
60
0.4
G

S6
50
50
0.5
H

S7
100
0
1.0
5. 将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。
（1） 先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N 1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl，使总量达到20μl。（此时蛋白样本的稀释比为10，适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml时。如预计蛋白浓度太高或太低，可适当调整稀释比例）
（2） 再在第1~2条酶标板的蛋白标准品孔（S0~S7）中加入上面配制的8个蛋白标准液各20μl。

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
S0
S0
N1
N1

B
S1
S1
N2
N2

C
S2
S2
N3
N3

D
S3
S3
N4
N4

E
S4
S4
N5
N5

F
S5
S5
N6
N6

G
S6
S6
N7
N7

H
S7
S7
N8
N8

6. 用排枪在各孔中加入200μl BCA工作液，轻轻摇匀，37℃放置30分钟或室温放置2小时。（注意：①每次测定时必须都做标准曲线。因为BCA法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，且显色反应的速度和温度有关，所以除非精确控制显色反应的时间和温度，否则每次都做标准曲线。②如果浓度较低，可适当地延长孵育时间或在较高温度孵育。）

7. 用酶标仪测定562nm下标准品和样本的吸光度。
8. 用标准蛋白质量为横座标，用吸光度值A562为纵座标，做标准曲线，用线形回归计算公式Y=A ´ X + B。根据样本的吸光度，计算待测样本的蛋白浓度（注意待测样本的稀释倍数）。
9. 按WB实验的要求，稀释为2.5mg/ml，分装为每支100μl。
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