大肠杆菌的保存和培养.doc

大肠杆菌的保存和培养
1菌种的保存
菌种的保存通常采用甘油低温保存法
1.1基本原理：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌。
1.2使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后液氮速冻，然后放入-70度超低温冰箱贮存。
2菌种的复苏
复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或 0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。
切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。
3大肠杆菌培养
3.1培养基配制：培养基从形态上分为液体与固体培养基。根据有无抗生素和其他选择性药物分为普通与选择培养基，常用LB培养基。
3.1.1 LB（Luria-Bertain)液体培养基配制
蛋白胨 1.0%
酵母提取物 0.5%
氯化钠 1.0%
称重后搅拌使之完全溶解，用5M NaOH调pH至7.0，高压灭菌20min。
3.1.2含琼脂的固体培养基配制
（1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加 1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入 1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板
（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50℃时加抗生素，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。 (抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度 50μl/ml)。然后4℃保存备用。
3.2 液体细菌培养
3.2.1小量培养:
(1) 取灭菌 16 或 18mm 口径培养管，加 3-5mlLB 培养基，再加 50mg/ml 氨苄青霉素 3-5ul（宿主菌不加抗生素）
(2) 无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，或取菌液 5-10ul，转入培养液中，封好管口
(3) 37℃摇床培养 100-200r/min 至生长饱和，约 6-12 小时
3.2.2大量培养: 取500ml 培养瓶内装培养基 100-200ml，及相应抗生素。以 0.5-1%浓度接种菌液，37 度摇床培养100-200r/min至OD值0.6-0.8。
3.3 固体细菌培养: 用于单一菌落的挑选，转化后抗性菌落的筛选。
方法：采用划痕接种法。用接种环从菌种中沾取少量菌液，划线。