胶原的水解方法及其水解状况的检测.pdf

第15卷第1期 皮 革 科 学 与 工 程 Vol115,No112005年2月LEATHER SCIENCE AND ENGINEERINGFeb12005文章编号:1004-7964(2005)01-0035-06收稿日期:2004207208基金项目:2002年度陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室重点科研项目(项目编号:02JS41)第一作者简介:侯小东,男,1980年生,研究生,研究方向:动植物纤维复合材料的制备研究。3 通讯联系人胶原的水解方法及其水解状况的检测侯小东,章川波3(陕西科技大学资源与环境学院,陕西咸阳712081)摘 要:综述了当前比较常用的几种胶原水解方法,并针对它们各自的特点进行了比较.总结了实践中能够用来检测胶原水解状况的几种手段,并分析了各种手段的优缺点及适用范围,能对正在从事相关工作的科研人员起借鉴作用。关键词:胶原;水解产物;检测手段中图分类号:TS512;TQ947 文献标识码:AMethods of H ydrolyzing Collagen and Measuring the State of H ydrolysisHOU Xiao2dong,Z HA N G Chuan2bo(Resource and Environment College,S haanxi Universityof Science and Technology,Xian yang712081,China)Abstract:The common methods of hydrolysising collagen were summarized and contrasted in theterms of their individual characterizations with the author owns experiences.According to ad2vantages,shortcomings and range of application,some measures meet to check the state of hy2drolysising collagen were summarized,which can give an example for the people engaged in thesimilar research.Key words:collagen;hydrolyze product;measurement前言近年来,一方面由于人们对废弃物污染问题的重视,另一方面由于胶原作为一种天然高分子化合物,具有无可比拟的特性1,从制革固体废弃物中回收利用胶原一直是制革界人士关注的热点,与此相关的胶原水解方法的报道非常多,但是关于胶原水解状况如何检测的问题,却缺少系统的总结。本文作者一直在从事胶原纤维/植物纤维复合材料制备方面的工作,为此探索过许多从制革固体废弃物中提取胶原的方法及检测手段,下面就将自己的成果,结合他人经验作一小结,以期为正从事相关工作的科研人员提供借鉴。1 胶原水解方法从制革固体废弃物中提取胶原在国外已经有很长的历史,而国内同类研究起步比较晚,但在最近20年来,相关的报道大量出现。根据提取胶原采用的手段不同,大致可分为以下几类:1.1 酸法使用盐酸、硫酸等强酸作用皮块,水解作用强烈,迅速而彻底,分子量分布广,而且胶原提取率高于碱法与酶法2。根据酸浓度、水解温度、水解时间等条件的不同,可以得到平均分子量不等的胶原水解物,甚至彻底水解得混合氨基酸,但是在水解过程中色氨酸全部被破坏,丝氨酸和酪氨酸部分破坏,氨基酸得率较低,设备腐蚀严重,并产生二次污染。温州大学路亮等人,用8N HCl(原料重:酸用量=11.2w/v),在105110 下水解牛灰皮下脚料11 h,经脱酸、脱色、中和、浓缩、结晶得到氨基酸总量为:35.54%,人体必需氨基酸11.58%的混合氨基酸3。笔者曾用硫酸水解牛皮削匀铬革屑,当硫酸用量为8%时,90 下水解23 h,瓶底皮渣极少,蓝色较深,冷却静置后为均匀粘稠液,水解液中无颗粒,以下是不同用量(质量比)硫酸水解胶原状况的MDI照片。0%酸水解胶原纤维状态The condition of collagen hydrolyzed by sulfuric acid free2%酸水解胶原纤维状态The condition of collagen hydrolyzed by 2%sulfuricacid4%酸水解胶原纤维状态The condition of collagen hydrolyzed by 4%sulfuricacid1.2 碱法有报道称4,目前国内80%以上明胶都采用碱6%酸水解胶原纤维状态The condition of collagen hydrolyzed by 6%sulfuric acid8%酸水解胶原纤维状态The condition of collagen hydrolyzed by 8%sulfuric acid图1不同用量硫酸水解胶原状况的MDI照片Fig.1 MDI photos of hydrolyzed collagen with differentsulfuric acid法生产,世界各国也普遍采用碱法生产明胶.蒋挺大等人5用CaO、MgO、NaOH等处理,认为CaO更好,成本低。穆畅道6也认为用Ca(OH)2处理铬革屑,过滤容易,得率高。S.Tahiri和M.Azzi7从皮革废物中提取胶原蛋白,他们采用成本低、毒性少的20%Ca(OH)2,10倍水,加热15 min,其得率可达60%。碱法制明胶的突出的缺点是周期长、污染严重、石灰耗量惊人,为湿原料皮质量的15%18%,浸灰废液中含有砷、铅等有害元素,对水资源、土壤及空气都造成了严重污染,且耗水量大,生产1 t明胶至少需要700 t水,生产1 t高级明胶则需要1000t左右的水。与酸法一样,碱法处理得到的水解胶原分子量也呈连续分布,这使水解胶原蛋白的高附加值转化受到了限制13。1.3 酶法蛋白酶水解胶原作用条件温和、所需设备简单,但反应速率很快,同时还可以大大减少环境污染。提取的水解胶原蛋白纯度高、水溶性好、理化性质稳定。另外,蛋白酶对胶原的作用一般具有选择性,产品分子量不是连续分布,因此选择适当酶及工艺条63皮革科学与工程 第15卷件,理论上可以得到预期分子量的水解胶原。四川大学的胡胜8采用一步法、不抑活两步法、抑活两步法3种不同的工艺,对提取猪皮胶原的生物酶法进行了研究,发现猪皮的酶水解产物分子量呈不连续分布,主要集中在某些分子量处,与碱法工艺明胶分子量的分布明显不同,而且酶处理条件不同,水解得率与产物分子量的分布也不同。北京大学赵胜年9用国产胰酶水解新鲜猪皮,提取水解胶原蛋白,总蛋白质提取率 80%,工艺条件:反应温度5052,起始p H=9,反应时间23 h,原料 水=12,酶用量约为50001100001。1.4 联合处理法由于单用一种方法提取胶原存在许多不足,国内外学者通常将两种或者更多手段结合起来,其中比较有名的是碱-酶两步处理法、酸碱交替法。1.4.1 碱-酶两步处理法美国M.M Taylor等9曾经用碱和碱性蛋白酶联合处理铬鞣牛革屑,取得了较好的效果。四川大学的陈武勇10用碱-酶两步法处理铬革屑,他们的工艺是:第一步,碱处理:将0.1%的平平加和6%氧化镁用500%的水分散开,然后加入铬革屑,72 下搅拌反应6 h,趁热过滤,滤液、滤渣密封常温保存;第二步,酶处理:将0.1%的平平加、2%的氧化镁、0.0156%的Alcalase酶在200%的水中散开,再加入滤渣,60 下反应1.5 h,趁热过滤得水解蛋白质和铬饼。研究结果表明:Cr2O3在明胶和水解蛋白质中含量在110-61010-6之间,明胶黏度可达16.2813CP,颜 色 为 淡 黄 色,符 合 国 家 明 胶QB581-1981标准中的一级标准;水解蛋白质可作饲料;蛋白质总回收率为80%左右。1.4.2 酸碱交替法这种方法提取得到的胶原产物的稳定性和质量都要比碱处理法高。国内的邵泽恩11等采用这种方法来提取胶原蛋白制作宠物饲料,工艺:石灰乳浸渍脱铬72 h 过滤、水洗至p H为8 稀硫酸浸渍至p H为0.20.4停止加酸继续搅拌4 h过滤,水洗至p H 67 氢氧化钠浸渍2 h水洗至p H为8 双氧水氧化时间为1 h 过滤水洗 低温汽流干燥 包装 宠物饲料的基础原料)1.4.3 机械-酸、碱、酶联合法笔者实验室采用上海标本模型厂生产的DS-1高速组织捣碎机和FJ-200高速分散均质机作为胶原分散的主要手段,而以酸、碱、酶作为辅助手段。DS-1型高速组织捣碎机具有如下特点:转速1000012000 r/min,高速转矩大,高、低二级调速,运转稳定捣碎效率高,试验直观清楚。FJ-200高速分散均质机特点是:转速30023000 r/min连续可调,运转稳定,噪音小,功率大,分散均质效果好等特性,并兼有搅拌、捣碎、乳化等多种功能,本机配备两支不同规格的刀具(10 mm、18 mm),用户可根据容器直径的大小自由选择,且装拆十分方便。表1几种胶原分散方法的效果比较(表中酸法、碱法工艺见本文1.1和1.2)Tab.1 A contrast of the conditions of collagen dispersed by different methods(Acid and alkali processes in the table can be saw also in 1.1 and 1.2 of this paper)前处理酸碱用量浓度/液比温度/时间结果酸法灰皮脱脂中和剪成皮块皮 酸11.2(W/V)8N10511011 h经脱酸、脱色、中和、浓缩、结晶得到氨基酸总量为:35.54%机械-酸法灰皮剪成0.5 cm0.5 cm皮块皮 酸481(W/V)12N35452 h白色糊状水解液,不明显分层,少量小颗粒沉积碱法20%Ca(OH)210不明15 min胶原蛋白产率60%机械-碱法灰皮剪成0.5 cm0.5 cm皮块Ca(OH)2饱和溶液58406023 h基本水解成絮状,颗粒极细,不明显分层 从表1可以清楚地看到,通过机械作用,酸碱处理的各种条件比纯酸碱处理要求将低,而且水解时间大大缩短。关于胶原水解的方法还有一些,如高温蒸煮法,热喷法12,由于对设备要求比较高,不太常用,本文就不再赘述。2 水解状况的检测不同的实际用途,对胶原及水解物的分子量有不同的要求:在化妆品中,单纯用作营养性护肤类原73第1期 侯小东,等:胶原的水解方法及其水解状况的检测料通常要求分子量在2kDa以下,以让水解胶原能渗透入皮肤内,护发类化妆品除要求水解胶原具有保湿性外,通常还应具有一定的成膜性,因此水解胶原的分子量一般要求更高;在组织工程中,胶原形成的薄膜、海绵、凝胶、管状物等人工组织,既要保持一定的力学机械性能,又要避免在体内被胶原酶降解过快,除了用醛交联胶原外,通常使胶原的分子量尽可能大;用于制作食品胶原膜的水解胶原,为了让胶原膜具有一定的强度,同样要求水解胶原保持较大的分子量;为了使其具有更有效的生理功能,用作保健制品原料则要求胶原有一定程度的降解13。为了检测胶原水解的程度是否达到预计的标准,通常采用的检测手段与检测指标有以下几种:2.1 黏度由于水解胶原的粘度不仅受水解程度的影响,而且与水解液的温度、p H值、浓度、储存时间等有很大的关系,因此除非严格按照国家标准操作,否则不同状态下测得的粘度值,相互之间比较没有太大的实际意义,但是对于相同条件的试验来说,黏度还是具有检测水解程度的价值。由于它的测定相对简单,许多人采用它作为一个控制水解程度的依据,粘度的检测方法很多,通常用来检测胶原水解液的有以下两种:2.1.1 毛细管黏度计液体在毛细管黏度计内因重力作用的流动,当毛细管半径比较细,溶剂流出时间大于100 s,可以忽略动能液体流出速度的影响,粘度正比于流出时间和密度。常用毛细管粘度计有两种:乌氏黏度计和奥氏粘度计,它们的装置大致相同。实际应用中可以根据所测黏度的范围,选择合适的毛细管。它们区别在于乌氏粘度计常用来测线性高分子的特性黏数或者相对黏度,并且利用其黏度值与平均分子量有关,来测定高分子的分子量。四川大学陈武勇等10人就曾用奥氏黏度计测量一定温度下明胶液的绝对黏度。其计算公式:1=1t1/2t2 21 明胶液的密度(g/cm3),2 水的密度(g/cm3),1 明胶液的绝对黏度(CP),2 的绝对黏度(CP)t1 明胶液面自黏度计的上刻度降至下刻度所经历的时间(min)t2 水自黏度计的上刻度降至下刻度所经历的时间(min)2.1.2 旋转黏度计旋转粘度计是一种测量各种牛顿型液体的绝对粘度和非牛顿型液体的表观粘度的精密仪器。原理如下:同步电机以稳定的速度旋转,连接刻度圆盘,再通过游丝和转轴带动转子旋转。如果转子未受到液体的阻力,则游丝、指针与刻度圆盘同速旋转,指针在刻度盘上指出的读数为“0”。反之,如果转子受到液体的粘滞阻力,则游丝产生扭矩,与粘滞阻力抗衡最后达平衡,这时与游丝连接的指针在刻度圆盘上指示一定的读数(即游丝的扭转角),常用于胶原水解物粘度的旋转黏度计NDJ-1/7/79等型号,其测量范围:2107mPa.s,此仪器可以通过橡胶管与恒温水槽连接,保持测定时温度恒定。2.2相对分子质量分布由于分子量胶原水解物的成分比较复杂,既有大分子的蛋白质,也有小分子的多肽、氨基酸,分子量的分布比较广,通常采用的办法都是生物化学中的经典方法,比如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶过滤色谱等。2.2.1 渗透压法渗透压法14是一种比较简单的测分子量的方法,利用的原理就是党南平衡,稀溶液中渗透压与分子量的关系为:=RTC/M,C为稀溶液溶度,M为分子量,T为温度,R为气体普适常数。渗透压法测分子量的适用范围(10,00015,000)比较窄,所以它的应用受到限制。2.2.2凝胶过滤色谱法(Gel Filtration Chroma2tography GFC)凝胶过滤色谱法15,也称排斥色谱(ExclusionChromatography)或分子筛(Molecular Sieve Chro2matography),属于液相色谱中的一种。其基本原理是:色谱柱内填充凝胶,凝胶内具有一定大小的孔隙,当样品进入时,体积大的分子不能渗透到凝胶孔隙中而受到排斥,保留时间短,中等体积分子产生部分渗透,小分子可渗透到凝胶中,样品分子基本按分子大小由柱中流出完成分离,由洗脱体积可得知分子量大小,通常是分子量大的分子在前,小分子在后,同样分子量的分子,则是线状分子在前,球状分子在后。选用不同的凝胶,可以测定不同范围的分子量,总的适用范围可以从几千到几千万,四川大学的林炜16等人就曾用此法测胶原水解物的分子量。2.2.3SDS(十二烷基硫酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳法1583皮革科学与工程 第15卷在电泳体系中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate简称SDS),当其浓度大于1 mmolL-1时,以1.4 gSDS与1g蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷,这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别,从而降低或消除了各种蛋白质天然电荷差别。不同蛋白质-SDS复合物的短轴相同,约1.8 nm,而长轴改变与蛋白质的分子量成正比。所以,各种SDS-蛋白质复合物在电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响,而只是按照分子的大小由凝胶的分子筛效应进行分离,当蛋白质分子量在11,700165,000之间时,其有效迁移率与分子量的对数成线性关系:lgM=-bx+k其中M为蛋白质分子量,x为电泳迁移率,k和b为常数这样就可以根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线得出末知样品蛋白质的分子量。此法由于所需设备简单,操作方便易行,被许多人所采用16-18。2.2.4高效液相色谱与电喷雾-质谱联用技术(HPLC-ESI-MS)16电喷雾质谱法是目前测定蛋白质分子量最准确的方法之一。如牛胰蛋白酶的实际分子量是23290Da,质谱的测定结果为23293Da,系统误差在0.02%以内,但是质谱仪价格昂贵,不宜做常规分析手段18。ESI/MS谱峰的积分强度正比于样品在溶液中的浓度,所以从质谱图上也可以获得各组分相对含量的信息。电喷雾质谱适于测10200 kDa分子量范围的蛋白质,而且只需10-12mol量的蛋白质样品。2.3 颗粒性状2.3.1 离心沉降法:离心沉降法是一种比较传统的粒径分布测定方法,因其结果可靠、重复性好、操作简便而应用广泛,当胶原未被完全水解时,或者水解物中存在小颗粒时,可以使用此法分析其粒径分布,笔者在所作课题中就采用了此方法。光度测定法是一种合乎需要的检测方法,它不需与待测粒子直接接触,且沉降系统不受干扰。在此方面应用比较广泛的是岛津SA-CP3型离心粒度分析仪(Centrifugal Particle SizeAnalyzer)应用沉降法检测粒子光度上的浓度值。此分析仪配备了一个旋转装置产生离心力以加速沉降,减少样品分析时间。利用本仪器可以直接得出粒度积分图、粒度微分图(即粒度分布图)、中间粒径、常见粒径、比表面积及两个任意百分数下的粒径值。它的主要技术参数:测量粒度范围0.02500m;测量方式:重力沉降(GRAV)、离心沉降(CENT)、复合沉降(MU TI)、上浮离心(LIFT);最高转速5000 r/min;悬浮液浓度 0.1wt%2.3.2 多媒体显微镜(MDI)多媒体显微镜原理跟普通光学显微镜相同,只在普通显微镜基础上装一个光电放大器,将显微镜下看到的图象放大到计算机的荧屏上,利用辅助软件(也具备放大功能,但分辨率并不提高)将显微镜下的观察到的图像直接保存到计算机里,一般总放大倍数为10010000倍。本文1.1所示图片就是利用MDI获得。2.3.3 扫描电子显微镜(SEM)SEM用途广泛应用于研究不同领域中的各种样品的表面形貌。如:生物学、植物学、古生物学、地质学、冶金学等等。观察对象可以是样品的表面,也可以是一个切开的面,或是一个断面。它的分辨率可达60埃,放大倍数为025万倍,样品可为金属的或非金属的;生物的或非生物的,粉状的或颗粒状的。胶原水解产物如果要检测其颗粒性状,样品先要干燥,再进行表面喷金处理。2.3.4 原子力显微镜(AFM)原子 力 显 微 镜(Atomic Force Microscope,AFM)是扫描探针显微镜(Scanning Probe Micro2scope以下简称SPM)中的一种,基于探针对被测样品进行扫描成象的显微镜。SPM所具有的独特优点有:1、原子级高分辨率。如在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1 nm和0.01 nm,具有原子级的分辨率。2、可实时地得到实空间中表面的三维图像,可用于具有周期性或不具备周期性的表面结构研究。3、可以观察单个原子层的局部表面结构,而不是体相或整个表面的平均性质。4、可在真空、大气、常温等不同环境下工作,甚至可将样品浸在水和其它溶液中,不需要特别的制样技术,并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究生物样品和在不同试验条件下对样品表面的评价,当然也可以直观地观察到胶原水解液的颗粒状况。四川大学付丽红17就采用了这种手段检测胶原水解液的颗粒性状,发现她得到的胶原水解液大部分颗粒直径小于0.2m。93第1期 侯小东,等:胶原的水解方法及其水解状况的检测表2 扫描探针显微镜(SPM)与其他显微镜技术的各项性能指标比较Tab.2 A contrast of main performance index between SPM and other microscopic methods分辨率工作环境样品环境温度对样品破坏程度检测深度扫描探针显微镜(SPM)原子级(0.1 nm)实环境、大气、溶液、真空室温或低温无100m量级透射电镜(TEM)点分辨(0.30.5 nm)晶格分辨0.10.2 nm)高真空室温小接近SEM,但实际上为样品厚度所限,一般小于100 nm.扫描电镜(SEM)610 nm高真空室温小10 mm(10倍时)1m(10000倍时)结语总的来说,胶原水解的方法还有不少,以上所列举的只是笔者在试验中曾经使用或者借鉴过的。关于上述几种检测手段,原子力显微镜和HPLC-ESI-MS精度比较高,但价格太贵,用来分析普通用途的胶原水解物,显得大材小用。而渗透压法可测范围太窄,粘度法专门用来控制水解程度,又显得精度不够,所以比较实用的方法就是凝胶过滤色谱和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,但二者要求水解产物溶于水,否则无法在凝胶中通过,若水解产物含细小颗粒,也可以尝试采用离心沉降法,毛细管电泳法等。由于制革是一门实用性很强的技术,许多制革界人士都比较重视从制革固体废物中提取胶原的实际效果,往往忽视胶原水解物的检测方法,这方面的专门研究也很少。希望本文的发表能起一个抛砖引玉的作用。参考文献:1王碧,林炜,马春辉,等.皮革废弃物资源回用-胶原蛋白的利用基础、现状及前景J.皮革化工,2001,18(3).2潘志娟.铬革屑的资源化处理技术J.皮革科学与工程,2002,11(3):7-11.3路亮,张学俊,熊静,等.酸法水解制革下脚料提取混合氨基酸的工艺探讨J.2000,29(23):29-31.4徐润,梁庆华.明胶的生产和应用技术M.北京:轻工业出版社.1988.5蒋挺大.胶原蛋白M.化学工业出版社.2001.6穆畅道.利用革铬渣研制皮革复鞣剂和涂饰剂D.成都:四川大学,2001.7 Tahiri S,Azzi M.Processing of chrome-tanned solidwaste generated in leather industry:Recovery of proteinsand synthesis of a pigment for paint J.JALCA,2001(96):1-8.8胡胜,李志强,陈敏,等.猪皮胶原的酶法处理J ,中国皮革,2003,32(5):6-99Taylor M M,Cabeza L F,Dimaio G L,et al.Process2ing of leather waste:Pilot scale studies on chrome shav2ings.Part.Isolation and characterization of proteinproducts and separation of chrome cake J 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