过氧化氢酶的活力和动力学常数测定.docx

一、酶活力测定
（一）原始数据
1.样品原始质量：嫩豆芽5.010g
2.标定数据：
（1）KMnO4质量数及配制：0.02mol/L高锰酸钾标准液配制：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL ，临用前用草酸钠标定。
（2）Na2C2O4质量数：称取优级纯Na2C2O4 13.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
（3）标定数据：取5mL0.1mol/L的草酸和3mL10% H2SO4溶液于锥形瓶中，加热至（75～85）℃（见冒热气），趁热用KMnO4标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4（此时生成的Mn2+起催化作用）。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。
2KMnO4+5Na2C2O4+8H2SO4=2MnSO4+5Na2SO4+K2SO4+10CO2↑+8H2O
（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L
3.样品滴定数据
编号
活酶
死酶
1
2
1
2
加入酶液体积(mL)
2.5
2.5
2.5
2.5
加入10%H2SO4体积(mL)
2.5
2.5
2.5
2.5
加入0.1ml/LH2O2体积(mL)
2.5
2.5
2.5
2.5
加入KMnO4体积(mL)
0.23
0.24
1.90
1.94

（二）结果计算
1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）
2KMnO4+5H2O2+2H2SO4=K2SO4+MnSO4+5O2↑+2H2O
2 5 2 1 1 5 2
1.9*10-5 4.75*10-5
m(H2O2)=4.75*10-5*34*1000=1.615mg
2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g•min）
酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示
酶活(mgH2O2/g·min)=
式中：
A—对照KMnO4滴定毫升数；
B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）；
V1—反应所用酶液量（ml）；
F W—样品鲜重（g）；
1.7—1ml 0.02mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2
酶活(mgH2O2/g·min)
=0.235*50*1.7/(5.010*2.5*10)=0.159(mgH2O2/g·min)

二、动力学常数的测定
（一）原始数据

编号
1
2
3
4
5
消耗的KMnO4（mL）
0.28
0.35
0.41
0.72
1.33
（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0

编号
1
2
3
4
5
[S]0 （mol/L）
5.000*10-3
6.700*10-3
8.700*10-3
1.250*10-2
2.500*10-2
V0 （mmol/min）
7.340*10-3
1.008*10-2
1.351*10-2
2.391*10-2
3.737*10-2
（三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）

（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）
求得线性关系为y=1.3921x+0.0111
所以Vmax=1/0.0111=8.654*10-2
KM=1.205*10-1

第四部分：课后研讨题
1.总结本实验操作过程的注意事项。
(1)每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。
(2)各反应瓶的滴定终点微红色应为同一标准。
(3)使用前，应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。
2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?
温度，pH值和底物浓度
3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧分子，在此过程中起传递电子的作用。
4.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？
提供反应所需的酸性条件，并作为反应物参与反应
5.米氏方程中的Km有何实际应用？
(1)鉴定酶：通过测定Km,可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状态下催化相同反应的酶是否是属于同一种酶。
(2)判断酶的最适底物（天然底物）。
(3)计算一定速度下底物浓度。
(4)了解酶的底物在体内具有的浓度水平。
(5)判断反应方向或趋势。
(6)判断抑制类型。
6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？
Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。因此，当底物、PH、温度和离子强度等条件相同时Km值为常数，对一酶促反应而言，在一定的条件下都有特定的Km值，可用来鉴别酶。
7.测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行？
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的反应速度下降。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
8.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。
过氧化氢酶的活力测定——紫外吸收法（参考百度文库）
一。原理：H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。
二。材料、仪器与试剂
（一）、材料：小麦叶片
（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
（三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
三、实验操作：
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号 S0 S1 S2
粗酶液(ml) 0.2（煮死酶液） 0.2 0.2
pH7.8磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5
蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活力。
五、计算
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。
过氧化氢酶活力(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。”