质粒电泳的条带.doc

质粒DNA电泳的三条带
2008-11-11 16:38
    质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：
1、培养细菌使质粒扩增
2、收集和裂解细菌
3、分离和纯化质粒DNA
    碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是得率高，适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。此法采取酸碱度高达Ph12.6的碱溶液使DNA发生变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完全变性分，甚至出现断裂。因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性水平，此时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体DNA则无法复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。
   在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数 质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：
共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋
开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子
线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子

质粒DNA的分子构型

质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图
(a)松弛线性的DNA；
(b)松弛开环的OC构型；
(c)超螺旋的SC构型
由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。
(a)道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；
(b)道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间
三、材料、试剂及器具
1、材料
E.coliDH 5α（pUC 19 vector）
2、试剂
1)LB培养基
2)TE缓冲液
3)裂解液：溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ
4)酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）
5)无水乙醇
6)70%乙醇
7)氨苄青霉素50mg/mL
器具
离心机、离心管、吸嘴
四、操作步骤

以1%比例把E.coliDH5α(含PUC18)接种于含氨苄青霉素（Amp）100μg/ml)的LB培养基中37℃振摇过夜（12-18h）
↓
取1.5ml培养物置离心管中
↓
10000rpm,离心1min，或4000rpm，离心5-10min
↓
去上清，倒扣干净吸收纸上吸干
↓
沉淀+100μL溶液Ⅰ
↓
加或不加入少量溶菌酶粉末；混匀，室温放置10min
↓
+加200μL溶液Ⅱ（新鲜配置）
↓
温和颠倒数次，混匀，冰上放置5min
↓
+150μl溶液Ⅲ→颠倒混匀，冰上放置15min
↓
离心12000rpm,15min
↓
上清液+等体积酚：氯仿：异戊醇振匀，12000rpm,离心5min
↓
小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质
↓
上清液+2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10min
↓
12000rpm,5min-15min
      ↓弃上清
沉淀+1mL70%乙醇
↓
12000rpm离心5min-15min
↓
弃上清；并倒扣离心管使液体流干
↓+
自然干燥或真空抽干（看不到液滴为宜）
↓
加50μlTE缓冲液（20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗取物
↓
-20℃保存
六、实验报告
检查、保存提取的质粒，要求记录实验现象并说明原因。
七、思考题
分析以下试剂的作用原理：
溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖
5mmol/Ltris HCL (Ph 8.0)
10mmol/L EDTA(PH8.0)
溶液Ⅱ:0.4mol/L NaOH
2% SDS
使用前新鲜配制
溶液Ⅲ：5mol/L Kac 60 mL
冰醋酸11.5 mL
水28.5 mL
RNase A酶：将粉末溶于10mmol/L tris HCL (Ph7.5)、15mmol/L NACL中，配成10 mg/mL
浓度的酶液，于100℃水浴加热15 min，缓慢冷却至室温，-20℃保存
氯仿
无水乙醇