紫草素对乳腺恶性肿瘤细胞凋...3K_AKT信号通路的影响_赖瑞.pdf

基金项目：湖北省陈孝平科技发展基金项目（）三阴性乳腺癌病人术后应用槐耳颗粒的疗效及机制研究作者简介：赖瑞（.），女，硕士，住院医师，研究方向：中西医结合临床外科学，：.紫草素对乳腺恶性肿瘤细胞凋亡及 信号通路的影响赖 瑞 史晓光 左禧萌 汪唐顺 刘洁丽 杨臻瑞 冯 雪 王玉坤 高 爽 孙 萍（北京中医药大学东直门医院，北京，）摘要 目的：探讨紫草素对乳腺恶性肿瘤 和 细胞凋亡以及 信号通路表达的影响。方法：将 及 细胞系用含不同浓度紫草素的完全培养基（分组为、.、.、.、.）进行培养，法检测细胞活性，染色后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，蛋白质印迹法测定细胞内 表达情况。结果：与空白对照组（）比较，紫草素浓度为.以上时对乳腺癌 及 细胞生长具有显著抑制作用，最佳作用浓度为.；与空白对照组比较，及 细胞的凋亡水平随紫草素浓度增加而增加，且差异有统计学意义（.）；与空白对照组比较，经紫草素处理的 及 细胞 表达均出现不同程度下降，差异有统计学意义（.）。结论：紫草素具有针对 及 乳腺癌细胞系的抗肿瘤作用，其机制可能与其抑制 信号通路有关。关键词 紫草素；乳腺恶性肿瘤；细胞凋亡；高转移恶性乳腺癌细胞系；原位雌激素受体阳性乳腺癌细胞系；磷脂酰肌醇 激酶 ，（，）：（）（）：（，.，.，.，.），：（），.，.（.），（.）：；中图分类号：；文献标识码：目前乳腺恶性肿瘤的治疗日趋成熟，主要治疗包括手术治疗、化学药物治疗、靶向药物治疗、内分泌药物治疗等，但上述治疗失效后的挽救措施仍不完善，免疫治疗及中医药治疗在个体化治疗中存在一定优势。紫草味甘、咸，性寒；归心、肝经；有凉血，活血，解毒透疹之功效，常用于治疗乳岩瘀毒互结之证，证见胸胁胀满，走窜疼痛，乳房包块，刺痛固定，胸闷，情志抑郁或易怒，善太息，脘腹胀满，面色晦暗。其主要成分紫草素具有广泛的药物活性，包括抗瘤作用、抗炎作用及条件免疫作用。研究表明，紫草素对多种恶性肿瘤细胞均有明显的抗肿瘤活性，能够抑制乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌等癌症的发生发展。本研究主要探讨紫草素对乳腺恶性肿瘤 及 细胞的促凋亡作用，为进一步发掘其作用机制提供研究基础。材料与方法.材料.细胞三阴性乳腺癌 细胞购自北京协和医院细胞库，细胞购自武汉普诺赛生物公司。细胞系经短串联重复序列（，）鉴定且无支原体。，的加湿培养箱环境下培养传代。，.试剂 紫草素对照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批号：），用二甲亚砜充分溶解，制成终浓度为 的母液，.滤膜过滤 次，短期（周内）保存。胆囊收缩素（，）检测试剂盒（兰杰柯科技有限公司，批号：）；凋亡检测试剂盒（兰杰柯科技有限公司，批号：）；蛋白酶抑制剂 （北京索莱宝科技有限公司，批号：）；细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号：）；磷脂酰肌醇 激酶（，）抗体（，美国，批号：）；蛋白激酶（，）抗体（，）；甘油醛磷酸脱氢 酶（，）（，美国，批号：）；山羊抗兔二抗（）（）（，美国，批号：）；杜尔贝科改良伊格尔培养基（，）高糖溶液（兰杰柯科技有限公司，批号：）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：）；青霉素链霉素（）溶液（兰杰柯科技有限公司，批号：）。.仪 器 手 持 式 超 声 波 细 胞 裂 解 仪（，德 国，型 号：）；流 式 细 胞 仪（，美国，型号：）；化学发光成像仪（上海天能科技有限公司，型号：）；酶联免疫检测仪（，美国，型号：）。.方法.分组与模型制备.测细胞活性 孔板种植密度为 个的 细胞或 细胞。待细胞贴壁后，加入含不同浓度（、.、.、.）紫草素的培养基，并设置含.二甲基亚砜（，）培养基的对照组。.蛋白质免疫印迹法 培养瓶中种植密度为.或 细胞 瓶。.凋亡检测六孔板种植密度为.或 细胞 孔。.干预方法.测细胞活性每组分别培养 、后，弃培养基，每孔中加入 及 全培养基，孵育 。.蛋白质免疫印迹法待细胞贴壁后加入含不同浓度（、.、.、.、.）紫草素的培养基 培养 。.凋亡检测贴壁后加入含不同浓度（、.、.、.、.）紫草素的培养基 培养 。.检测指标与方法.细胞计数试剂（）法测定细胞活性 用酶标仪在 处测定吸光度（，）值。根据公式计算细胞活性：抑制率（）（观察 组 值 阴 性 对 照 值）（对 照 组 值 阴性对照 值），孵育时间为横坐标，纵坐标为细胞活性，绘制抑制曲线图。.蛋白质免疫印迹法检测 表达用磷酸盐缓冲液（，）洗涤 次，加入适量胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，离心（转速为 ，离心半径 ），弃上清，使用预冷的 清洗 次，离心（转速为 ，离心半径 ）后收集细胞沉淀，每组细胞沉淀加入含蛋白酶抑制剂 的 裂解液，在冰上裂解细胞，手持式超声仪超声 。裂解后离心（转速为 ，离心半径.）收集上清，二奎啉甲酸（，）法 蛋 白 定 量 后 将 蛋 白 浓 度 调 至.，加 ，沸水煮 。用 聚丙烯酰胺凝胶电泳（，），转膜（，），封闭 ，一抗（，）孵育过夜。洗涤缓冲液（，）洗涤后加入二抗（）孵育，洗涤，配制 发光液与膜共同孵育 ，化学发光成像仪自动曝光，摄 片，分析量化条带灰度值，计算相对蛋白含量。.凋亡检测用 洗涤 次，加入适量胰蛋白酶消化，收集细胞悬液，离心，弃上清，使用预冷的 重悬，离心后将细胞重悬于 ；加入 以及 碘化丙啶染色（，）轻轻混匀，使用流式细胞仪检测凋亡程度。.统计学方法采用 .统计软件进行数据统计分析，分析前检验数据服从正态分布检测，计量数据符合正态分布且方差齐性，以均数 标准差（?）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两世界中医药 年 月第 卷第 期两比较采用 进行分析，以 .为差异有统计学意义。结果.紫草素对 及 细胞活性的影响用、.、.、.、.浓度的含紫草素培养基，分别作用于 与 细胞、及 ，紫草素浓度为.以上时对乳腺癌 及 细胞具有显著抑制作用，最佳作用浓度为.（.）。见图。图 紫草素对 及 细胞活性的影响 注：与浓度为 比较，.，.紫草素对 及 细胞凋亡的影响用、.、.、.、.浓度的含紫草素培养基，分别作用于 与 细胞，凋 亡 率 为：（.），.（.），.（.），.（.），.（.）。凋 亡 率 为：（.），.（.），.（.），.（.），.（.）。其凋亡水平随紫草素浓度增加而增加。见图。图 紫草素对 及 细胞凋亡率的影响 注：与浓度为 比较，.，.紫草素对 及 细胞蛋白表达的影响 与空白对照组比较，紫草素可下调 及 细胞的 水平，与作用浓度相关，对总 调控作用不明显。结果表明，紫草素抑制 及 增殖的主要靶点为，其最佳作用浓度为.。见图。图 紫草素对 及 细胞蛋白表达的影响 注：与浓度为 比较，.，.讨论尽管内分泌治疗及化疗技术日趋成熟，目前 型及三阴性乳腺癌晚期耐药解救治疗仍为乳腺恶性肿瘤的关注热点。针对乳腺恶性肿瘤的分子生物学诊断为靶向治疗的重要环节之一，依据患者个体不同基因位点的变异，乳腺恶性肿瘤治疗靶向药物趋向精确化及个体化。在既往研究中，紫草素被认为具有抗炎及抗肿瘤、调节免疫作用，在肿瘤治疗中的主要适应证为妇科恶性肿瘤、肝恶性肿瘤、消化道恶性肿瘤及睾丸恶性肿瘤等。研究表明，紫草素发挥抗肿瘤作用涉及到的通路包括 、（促分裂原活化的蛋白激酶）、（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）等，但主要还是通过调控 信号通路发挥抗肿瘤作用。本实验证实了紫草素对 及 细胞具有抑制活性及促凋亡作用，与此同时，及 细胞中 的表达也减少。是一种广泛存 ，在于细胞中，可以影响多种生理活动的信号通路，包括参与细胞存活、生长、代谢和血糖稳态等多种细胞功能。目前 的活性异常增高被证实与多种恶性肿瘤相关，其中已知亚基中研究最为广泛的亚基为 ，作为 的调节亚基，通过磷酸化磷酸肌醇，二磷酸，与催化亚基 结合，产生磷酸肌醇，三磷酸。酸肌醇，三磷酸通过磷酸化方式激活，而磷酸化的 则激活，完成肿瘤的异常增殖过程。肿瘤耐药性相关热门基因 也介导 家族蛋白的表达。因此，能够调控 家族蛋白，某种角度上也可以拮抗内分泌治疗及靶向治疗的耐药。这一点在本研究的雌激素受体阳性乳腺癌 细胞系及三阴性乳腺癌 细胞系得到一定程度证实。是胰岛素信号转导和葡萄糖代谢中主要的调节分子，激活后主要通过磷酸化、激活己糖激酶、降解胱天蛋白酶 活性等多种途径来调控细胞生长；作用于细胞周期蛋白依赖激酶的抑制分子 和，间接影响细胞周期蛋白 和 的表达水平来调控细胞周期和细胞增殖。本实验结果表明，与空白对照比较，紫草素可下调 及 细胞的 水平，呈浓度依赖，但对总 调控作用不明显。而陈菊英等的研究则明确指出经紫草素处理后 细胞的总、以及、均减少。仔细对比实验步骤，未发现有关键不同。分析考虑，可能的情况如下：）的活化因子不仅包括 相关激酶家族成员，还包括受体酪氨酸激酶、整合素、细胞和 细胞受体、细胞因子受体、蛋白偶联受体等。例如 丝氨酸 位点被 磷酸化，可激发 的酶活性。因此，可能紫草素在抑制 及 的同时对其他能够激活 的因子产生了正向调控作用。）误差所致。本实验后期将继续此项研究，探讨紫草素对乳腺恶性肿瘤细胞 表达以及对 复合物、人第 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因等其他能够激活 信号的因子的影响。综上所述，本实验表明，紫草素可通过诱导乳腺癌细胞系 及 细胞的凋亡发挥抗肿瘤作用，其主要作用靶点包括 。本实验为紫草素应用于耐药性乳腺癌提供一定依据，为探索乳腺癌晚期解救治疗方案提供线索。利益冲突声明：无。参考文献中国中西医结合学会肿瘤专业委员会，北京乳腺病防治学会中西医结合专业委员会，北京中西医慢病防治促进会乳腺癌整合防治全国专家委员会 乳腺癌中西医结合诊疗共识 中国医学前沿杂志（连续型电子期刊），（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典 版 北京：中国医药科技出版社，：何莲花，汪倩倩，孙丛丛，等 紫草素对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞功能的影响 中国中药杂志，（）：高文雅，张盟，陶仕英，等 基于网络药理学研究紫草抗乳腺癌的作用机制并对紫草素在 细胞中进行验证 中国临床药理学杂志，（）：林思，秦慧真，邓玲玉，等 紫草素抗肿瘤作用研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：詹志来，胡峻，刘谈，等 紫草化学成分与药理活性研究进展中国中药杂志，（）：陈静，侯尧，伍春莲 紫草素及其衍生物抗妇科肿瘤作用研究进展 中草药，（）：，：王芳芳，燕飞虎，李伟，等 紫草素通过调节 信号通路对子宫肌瘤大鼠的影响 中国实验方剂学杂志，（）：孙艳华，李明，徐建立，等 紫草素通过激活自噬相关的 连接酶 信号通路诱导结肠癌细胞自噬 安徽医药，（）：，后插 姚越，张冲，韩兵，等 紫草素通过抑制人睾丸癌 和精原细胞瘤 糖酵解诱导细胞死亡 南方医科大学学报，（）：王洁，何振兴，赵菊花，等 紫草素对皮肤鳞状细胞癌细胞生长及 信号通路的影响 郑州大学学报：医学版，（）：，（）：赵莉，黄景荣，龚承先，等 紫草素对人食管癌 细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其可能的机制 中国肿瘤生物治疗杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，：（），（）：王如良，张少华 乳腺癌骨转移和骨相关疾病临床诊疗研究进展 中国医药，（）：陈菊英，刘朝纯，曾智，等 紫草素通过 通路促进人乳腺癌 细胞自噬 中国药理学通报，（）：（收稿 本文编辑：杨觉雄）世界中医药 年 月第 卷第 期