医学病毒形态识别中的假象.pdf

基于透射电子显微镜负染技术和超薄切片技术的病毒形态识别是病毒鉴定的重要手段，病毒的形态识别在病毒相关的科研工作及重大疫情、生物恐怖事件的病原体鉴定中均发挥重要的作用。但是，无论负染样本中还是超薄切片上有时存在类似病毒结构的假象，往往导致误判。本文对负染样本、超薄切片样本中常见的医学病毒类似结构的假象结构进行列举，包括噬菌体、球形杂质颗粒、线粒体成分、支原体、网格蛋白及非网格蛋白包被囊泡、多泡体、高尔基体运输囊泡、糖原颗粒、微管、染色质周围颗粒、核孔、微绒毛、分泌泡和胶原原纤维等结构，期望为医学病毒形态判定提供一定的思路。关键词 透射电子显微镜技术；医学病毒；形态；假象；鉴别中图分类号：；文献标识码：收稿日期：；修订日期：基金项目：国家重点研发计划（）作者简介：宋敬东（），男（汉族），山东人，研究员：病毒是一类尺寸极其微小的微生物，大小通常为 ，囿于常规的光学显微镜分辨率（通常为 ），无法通过光学显微镜直接观测到病毒的结构细节，透射电子显微镜（简称透射电镜）具有亚纳米级的高分辨率性能，因此能够清晰分辨病毒的形态细节。形态是病毒的重要生物学特征之一，在病毒科（）水平，以及部分病毒属（）水平不同种类的病毒有较为显著的形态差异。因此，基于透射电镜技术的病毒形态识别在病毒的发现、鉴定中能够发挥重要的作用。历史上通过透射电镜技术发现过许多病毒，其中包括重要的人类致病病毒。虽然当今分子生物学技术等已有长足发展，但是透射电镜技术在病原体的快速鉴定中仍具有其独特的技术优势。在重大疫情病原体的鉴定及生物反恐事件中仍然能够发挥重要作用，并仍是病毒鉴定的一线（）技术之一。无论是负染样本，还是超薄切片样本中常常出现类似病毒结构的假象，尤其对于病毒形态的初学者或者非病毒形态研究的从业者往往将这些假象误判为病毒结构。本文对负染和超薄切片样本中常见的容易误判为病毒结构的假象进行举例及综述，文中所有图片均为作者多年积累，并首次发表，期望为读者进行病毒形态鉴定时提供一定的参考。医学病毒的形态简述 根据病毒是否有包膜可将病毒分为无包膜病毒和包膜病毒，通常无包膜病毒由二十面体立体对称的衣壳（）和其包裹的病毒基因组构成。衣壳由蛋白质构成，能够保护病毒基因组，并可与受体结合介导病毒感染，病毒基因组则携带病毒的遗传信息。包膜病毒通常由最外层的脂质包膜、内部的病毒衣壳及基因组构成（二者统称为核衣壳，呈二十面体立体对称或螺旋对称）。病毒包膜为来自于细胞质膜或细胞器的脂膜，其上有蛋白质构成的刺突（），可与受体结合。通过负染色或超薄切片制样观察，同一类型的无包膜病毒成熟病毒颗粒（）形态通常相对均一，即病毒的大小及形状基本相同，且病毒颗粒往往呈现球形或六边形轮廓（图）。对于包膜病毒，负染时往往可呈现出刺突结构（图），切片上则通常可见病毒的膜结构（图）。无论是无包膜病毒还是包膜病毒，在切片上往往可见中心位置呈高电子密度的核酸成分（图，）。非细胞结构的病毒假象举例 粪便内的噬菌体头部及杂质颗粒 哺乳动物肠道内均存在大量细菌及噬菌体，通常噬菌体由头部及尾部构成，其头部多呈二十面体立体对称，噬菌体的头部和尾部分开合成，最后 第 期宋敬东：医学病毒形态识别中的假象 图 病毒的负染和超薄切片形态举例。脊髓灰质炎病毒负染形态，病毒颗粒呈基本均一的球形；流感病毒负染形态，病毒刺突结构清晰可辨；腺病毒在超薄切片上的形态，病毒颗粒轮廓呈六边形，可见相对低电子密度衣壳和高电子密度核心；汉滩 病毒在超薄切片上的形态，病毒包膜清晰可辨，刺突附着其上，病毒核心可见高电子密度颗粒状核酸成分。，；，；，二者结合形成成熟的噬菌体。粪便样本负染检测时常见噬菌体，当样本中含有游离的噬菌体头部或短尾噬菌体时（尤其是其尾部被头部遮蔽时），易被误认为腺病毒。噬菌体头部的形态特征主要包括：其轮廓多呈六边形，衣壳厚度较薄而锐利，通常不见清晰的壳粒结构，有时头部可呈空心状，而腺病毒通常可见清晰的壳粒。另外，粪便样本内还可见脂滴样球形颗粒，此类结构大小不等，需要与小 病毒、杯状病毒、星状病毒等进行鉴别（图）。细胞培养上清、鸡胚尿囊液、血清样本中的脂滴样或蛋白颗粒样结构 细胞培养和鸡胚接种是常见的病毒分离、培养技术。病毒的细胞培养上清、鸡胚尿囊液（或羊水）亦是常见的负染检测样本。此类样本检测时往往可见脂滴样或蛋白颗粒样结构，易与病毒颗粒混淆。尤其是样本经过超速离心沉淀或超滤富集后，此类颗粒往往亦被富集，而导致较为易见。另外，当细胞培养体系中含有牛血清，或者直接检测血清样本时此类颗粒更多见。此类颗粒通常大小不均一，形态多变化，亦无刺突结构，可与病毒颗粒区别（图）。支原体（）支原体污染是细胞培养过程中质控不严时经常遇到的问题。在世界范围内实验室培养细胞的支原体污染（特别是传代细胞）其污染率为 。在细胞培养中已发现的支原体多达 种，样本污染是由以下 种支原体引起的：精氨酸支原 体（）、发 酵 支 原 体（）、人支原体（）、猪鼻支原体（）、口腔支原体（）和莱氏无胆甾原体（）。支原体呈多形性，某些种类的支原体表面披覆由脂蛋白形成表层（）结构，负染时呈现与病毒刺突类似的形态。但与病毒刺突相比，支原体表面的突起呈细小绒毛状，结构不甚清晰。在超薄切片上，有的 电子显微学报 第 卷图 粪便样本内病毒假象结构。：空心状噬菌体头部；：实心状噬菌体头部，噬菌体头部呈六边形，壳粒无法清晰辨别；：大小不等的球形脂滴样 颗粒；：轮状病毒；：腺病毒，壳粒清晰可辨；三角示细菌鞭毛。：；：，；：；：；：，；图 细胞培养上清（），鸡胚尿囊液（），人血清（）样本中病毒假象结构。（），（）（）结构致密的支原体横断面呈圆形，最外层为高电子密度结构，其内为低电子密度脂质包膜，中心为高电子密度菌体，其形态易与披膜病毒、黄病毒等包膜病毒混淆。结构疏松的支原体切面则与包膜病毒形态相似，但其表面常常缺少明确的刺突结构（图）。第 期宋敬东：医学病毒形态识别中的假象 图 支原体形态。具有刺突样结构的多形性支原体负染形态。插图示圆形支原体，箭头示支原体表面刺突样结构；支原体在超薄切片上的形态。箭头和三角分别示疏松和致密的支原体，插图示支原体切面呈圆 形，包膜结构清晰，形态易与病毒结构混淆。（）；，细胞结构中的病毒假象举例 细胞的某些正常结构，尤其是呈球形的结构易与病毒形态混淆，以下举例简要说明超薄切片上易与病毒混淆的结构。培养细胞样本中的线粒体成分 细胞培养样本（如细胞培养上清、细胞培养体系冻融离心后上清）中可见细胞崩解后的线粒体碎片，在这些结构的表面上分布刺突样结构，此结构实为线粒体基粒（）。基粒是位于线粒体内膜上的 合成酶，其球状头部直径为 ，茎部长 ，直径 ，间隔约，其形似病毒刺突。故带有基粒的线粒体碎片易与包膜病毒（如流感病毒、副黏病毒、丝状病毒等）混淆，但病毒的刺突通常排列更为紧密、有序（图）。网 格 蛋 白 包 被 囊 泡（）细胞与外界可以通过多种方式进行物质交换，其中网格蛋白包被囊泡的内吞作用便是之一。网格蛋白包被囊泡通常游离于细胞质内，呈球形，大小 。网格蛋白包被囊泡形成时，细胞质膜凹陷进入细胞质，凹陷处的细胞质膜内侧包被网格蛋白，凹陷处最终脱离细胞膜形成球形囊泡进入细胞质。囊泡表面的网格蛋白通常呈高电子密度，有时呈刺突状，因此网格蛋白包被囊泡易与包膜病毒混淆（如冠状病毒、布尼亚病毒等）。包膜病毒往往在细胞质表面向细胞外出芽，或者向细胞器腔内出芽（如内质网腔、高尔基体腔、核周隙等）获得脂质包膜和刺突，因而成熟的包膜病毒颗粒不会呈游离状存在于细胞质内。另外，病毒核心因含有核酸等物质往往呈高电子密度。如上两点通常可以区分网格蛋白包被囊泡与包膜病毒颗粒（图）。非网格蛋白包被囊泡（）细胞除了网格蛋白包被囊泡与外界进行物质交换的方式外，还有多种其他物质交换的方式，如陷窝蛋白包被囊泡（）的内吞作用，陷窝蛋白包被囊泡直径约 ，位于细胞质内。与网格蛋白包被囊泡类似，某些非网格蛋白包被囊泡也通过细胞质膜内陷方式进入细胞质，形成球状囊泡。此类囊泡表面通常没有刺突样结构，通常也缺乏高电子密度核心（图）。电子显微学报 第 卷图 附着基粒的线粒体碎片与呼吸道合胞病毒负染形态。箭头示丝状线粒体碎片上的基粒，插图示带有基粒的多形性线粒体碎片；呼吸道合胞病毒。，；图 网格蛋白包被囊泡形态。插图示细胞质膜上正在内吞形成的囊泡，箭头示细胞质内游离状的囊泡，其表面呈刺突状，核心呈低电子密度。，第 期宋敬东：医学病毒形态识别中的假象 图 非网格蛋白包被囊泡形态。插图内三角示正在形成的囊泡，箭头示细胞质内的非网格蛋白包被囊泡。，多泡体（）多泡体是细胞内吞途径中生成的独特细胞器，在其腔内含有囊泡。多泡体整体直径 ，腔内小泡（）直径约 ，多泡体功能曾被认为是一种特殊形式的次级溶酶体。多泡体腔内小泡易与病毒颗粒混淆，尤其是在细胞器腔内出现的聚集的病毒颗粒，如冠状病毒、布尼亚病毒、黄病毒、披膜病毒等。其与病毒颗粒的形态鉴别要点为，病毒颗粒多呈高电子密度球形，而腔内小泡电子密度往往并不高，有时还具有一定的多形性（图）。图 多泡体与冠状病毒包涵体形态比较。多泡体；在内质网中聚集形成的包涵体。；电子显微学报 第 卷 高尔基体运输泡 高尔基体附近往往存在许多囊泡，多数为由内质网运输进入高尔基体进行加工的或由高尔基体加工完成释放的物质运输泡，其位于细胞质内，在超薄切片上呈大小不等的球形，其中心多呈低电子密度。病毒颗粒多位于高尔基体腔内，呈高电子密度，二者在形态上可以鉴别（图）。图 高尔基体运输泡形态。箭头示高尔基体运输泡，插图示高尔基体囊泡内的大别班达病毒颗粒。，糖原（）颗粒 糖原是动物细胞内碳水化合物储存形式的多糖，通常存在于细胞质内。形态上可分为两种：一种为 颗粒，一种为 颗粒。颗粒是分散存在的糖原颗粒，直径 ，大小不等，呈高电子密度；颗粒为 颗粒的聚集形式，呈花簇状，大小不一。糖原颗粒大小、形态不均一，而出现在细胞质内的 病 毒 颗 粒 如 小 病 毒、细 小 病 毒（）等，其形态大小基本均一，可与糖原颗粒鉴别（图）。细胞微管（）微管是细胞骨架的重要组成成分，呈中空管状，外径 ，内径 ，管壁厚度约，微管长可达数微米，且无分支。微管纵切面则易与副黏病毒（如麻疹病毒、腮腺炎病毒）、呼肠孤病毒的核衣壳结构混淆。与病毒核衣壳相比，微管较长且直，通常病毒核衣壳短而弯曲，且可聚集。微管横断面呈中空圆形且直径基本一致，故而易与细小病毒（直径 ）、小 病毒（直径约）形态混淆。其鉴别要点在于微管横断面呈环形，内部呈低电子密度，而病毒颗粒切面则往往呈实心且为高电子密度（图）。线 粒 体 基 质 颗 粒（）线粒体基质颗粒通常随机分布在线粒体内膜所包围的空间内，近似球形，直径为 ，因嗜锇而呈高电子密度。线粒体基质颗粒在基质中可能游离，但常与嵴膜密切相关。在高倍镜下，在非常薄的切片上，线粒体基质颗粒似乎被薄膜状间隔细分为微小的腔室，且这些膜状轮廓也可以是同心的，出现基质颗粒的线粒体可无病理表现。线粒体内极少出现病毒颗粒，出现病毒颗粒的线粒体往往呈现线粒体嵴肿胀，线粒体变形等病理改变（图）。染色质周围颗粒（）染色质周围颗粒是位于细胞核的直径 的球形高电子密度颗粒，形态不均一，其周围围绕 的低电子密度晕。染色质周围颗粒数量在细胞分裂期间期增多，在肿瘤细胞中含量较高。染色质周围颗粒形态不规则、且周围有晕的形态特点易与细胞核内病毒颗粒鉴别（如疱疹病毒、第 期宋敬东：医学病毒形态识别中的假象 图 糖原颗粒形态。箭头示糖原颗粒，插图示细胞质内 病毒颗粒包涵体。，图 微管形态。箭头示微管横切面形态，插图示细小病毒颗粒；三角示微管纵切面形态，插图示麻疹病毒核衣壳包涵体。，；，电子显微学报 第 卷图 线粒体基质颗粒形态。细箭头示散布在线粒体内的基质颗粒，插图内粗箭头示病变线粒体内的病毒颗粒；三角示基质颗粒内可见同心圆状膜性间隔。；腺病毒、细小病毒、乳头瘤病毒、多瘤病毒等）（图）。细胞核孔（）核孔是细胞核的重要结构，参与细胞核内外的物质运输、信号传递等。核孔横切面呈圆形，通常形态规则，直径为 ，核孔总面积占核表面积的。有时核孔横切面密集排列，易被误认为聚集的病毒颗粒。通常此区域内或多或少可见细胞核染色质成分，若切面上仅有核孔而少有染色质成分，此时需要谨慎鉴定，需与疱疹病毒、腺病毒等鉴别（图）。细胞微绒毛（）微绒毛是细胞游离面伸出的细小指状突起，直径约 ，长度因细胞种类或细胞生理状态不同而有所差异，可长达 。微绒毛几乎存在于各种细胞，数量不定，有的细胞微绒毛长短不一、排列不整齐，有的细胞微绒毛长度几乎一致且排列规律（如肠道上皮细胞刷状缘）。微绒毛纵切面与丝状的包膜病毒颗粒（如流感病毒、副粘病毒、丝状病毒等）纵切面形态相似。通常包膜病毒表面可见刺突结构，病毒核心可见高电子密度核衣壳。微绒毛往往较病毒颗粒长，直径也较病毒颗粒粗，上述几点为病毒颗粒与微绒毛形态鉴别的重点。另外，微绒毛根部通常与细胞质膜融合为一体，而病毒颗粒则可能仅与细胞质膜有小部分接触或无接触。有时微绒毛横切面上由外向内可呈现糖衣、脂质膜、轴心的微丝，其形态类似病毒结构。通过细致分辨糖衣结构，可见其在脂质膜外形成的高电子密度结构呈层状，而无相对独立的，且长度、形态相对均一的刺突样的结构（图）。细胞分泌泡 在消化道内上皮细胞表面或消化道腔内有时可见来源于细胞分泌的囊泡或食物消化后的球形颗粒，直径数十纳米，有时数量比较多，但多数颗粒缺少刺突及高电子密度的核心，且大小不一，据此可与病毒颗粒鉴别（图）。胶原原纤维（）胶原纤维是结缔组织的重要组成成分，可见于 第 期宋敬东：医学病毒形态识别中的假象 图 染色质周围颗粒形态。箭头示染色质周围颗粒，周围有明显的晕状结构，插图示细胞核内的腺病毒颗粒。，图 核孔横断面形态。箭头示核孔横切面，插图示细胞核内的 病毒。，多种组织。胶原纤维是由直径 的胶原原纤维粘合而成。在电镜下，胶原原纤维呈现明暗交替的周期性横纹，横纹周期约 。当超薄切片足够薄时，在切片上也可看到节律性的间隔，但当切片厚时则无法清晰分辨其间隔，而呈现为粗细、长短不等的条索结构。某些病毒（如疱疹病毒、电子显微学报 第 卷图 细胞微绒毛形态。箭头示微绒毛，其基底部与细胞质膜融合为一体，三角示流感病毒颗粒，病毒颗粒仅与细胞 质膜有少许接触或无接触；微绒毛横断面形态；微绒毛纵切面形态。；埃博拉病毒、呼肠孤病毒等）的核衣壳或病毒成分可在细胞内形成条索状结构，且可聚集形成包涵体。上述两种结构的鉴别点为，胶原原纤维存在于细胞外，直径可有变化，其横断面为实心样。而病毒成分形成的条索状结构，通常仅出现在细胞内（如细胞核、细胞质内），且其直径通常较为均一，其横断面因病毒结构可呈现有不同的层次（图）。医学病毒假象识别的建议 电镜检测的病毒样本种类多样，病毒形态的假象结构众多，本文仅列举了常见的结构。为避免病毒形态鉴定时出现误判，笔者提出如下建议与读者探讨：（）熟悉病毒的分类学，并熟练掌握不同类型病毒的形态特征。虽然假象结构有多种变化，但病毒的形态在构成成分（包膜、刺突、衣壳、基因组）上具有形态特征，其中包括病毒结构构成、形状、尺寸，因而掌握病毒的形态是鉴定病毒的基础和核心，也是排除病毒假象的重要依据。（）了解病毒的形态发生学知识。对于不同类型的病毒其在细胞内的复制过程及形态发生表现有所差异，如有的病毒在细胞核内包装，有的在细胞质内包装，有的在细胞质膜出芽，有的在细胞器内出芽等。如成熟的包膜病毒通常不会游离存在于细胞质内，从而可排除细胞的运输泡等假象结构。（）必要时设立相应对照。尤其在鉴定未知病毒或重大疫情相关的样本时，设立对照十分必要，如此可确定或排除可疑结构的误判。（）充分了解电镜样本的背景信息。如病毒的滴度、培养基中血清的情况、是否经过冻融或匀浆及研磨处理、是否经过了富集处理、样本的类型（粪便、尿液、培养物、分泌物等）、是否已经过其它检测确证，在充分了解样本背景信息的基础上，可以为电镜检测结果提供证据或为可能的疑似结构提供证据。（）掌握一定的临床、疾病知识。对于医学病毒的形态检测，有时了解样本来源的病例疾病信息（如呼吸系统疾病、皮肤病、消化系统疾病等）、样本采集部位或类型（如呼吸道、消化道、皮肤、粘膜、血液、尿液等）、采集时患者的病程阶段（如急性期、恢复期）等。掌握如上信息，不仅为病毒的鉴定提供佐证，也可为病毒假象的判定提供依据，如呼吸系统的病毒性疾病患者样本中检测到消化系统病毒或疑似的病毒结构，此时则需要对疑似结构进行细致的鉴别、确认。（）掌握一定的 第 期宋敬东：医学病毒形态识别中的假象 图 小鼠小肠内的球形颗粒。箭头示分泌的囊泡，星号示分泌细胞；肠腔内的球形颗粒，插图示粪便切片内的轮状病毒颗粒。（）；，图 胶原原纤维形态和埃博拉病毒核衣壳形态。肺组织胶原原纤维纵切面形态，插图示胶原原纤维负染形态，可见周期性横纹；埃博拉病毒核衣壳在细胞质内形成的包涵体。，；电子显微学报 第 卷细胞生物学知识。病毒是严格细胞内寄生生物，其生命周期离不开细胞，而病毒形态的许多假象即来自于细胞的正常或异常结构。因此，掌握一定的细胞生物学知识有利于病毒形态及其假象的识别。另外，若在病毒抗体可及的情况下，利用免疫负染技术和超薄切片免疫电镜技术可对病毒及病毒相关抗原形成的结构进行特异性标记，从而排除假象结构。但笔者认为，熟练掌握免疫电镜技术，尤其是超薄切片的免疫标记技术（如基于胶体金标记抗体的穿透标记、表面标记、包埋后标记等）有一定的技术难度，且通常在穿透标记或基于水溶性树脂的包埋后标记等处理的样本，无论是病毒形态还是细胞结构形态的细节往往有损失。因而，免疫电镜技术用于病毒假象的识别，往往是基于常规电镜技术不能实现的情况下再使用。总之，病毒的假象在病毒的电镜检测过程中经常出现，但掌握了病毒形态学、形态发生学及相关理论和知识，结合病毒形态检测的实践过程，病毒的假象通常是可以鉴别的。参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：陈德蕙，杨怡 在可能的生物恐怖袭击中病毒的电镜诊断附：微波和数码图像技术应用于快速电镜诊断简介 电子显微学报，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：洪涛，王健伟 医学病毒图谱 北京：科学出版社，：，：第 期宋敬东：医学病毒形态识别中的假象 ，：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，：，：，：王春梅，黄晓峰，杨家骥 细胞超微结构与超微结构病理 基 础 上 海：第 四 军 医 大 学 出 版 社，：，：，：？，（）：，：，（）：高英茂 组织学与胚胎学 北京：人民卫生出版社，：成令忠 组织学与胚胎学 北京：人民卫生出版社，：（，），（），：，；