PGC-1α激动剂ZLN005减轻蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎.pdf

DOI：10.19893/ki.ydyxb.2023-0065第 21 卷第 2 期2023 年 6 月延安大学学报（医学科学版）Journal of Yanan University(Medical Science Edition)Vol.21 No.2Jun.2023PGC-1激动剂ZLN005减轻蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎钟敏萱1，蒋泞蔓2，刘浩2，万敬员2，王璐1*（1.延安大学基础医学院，陕西 延安 716000；2.重庆医科大学重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，重庆，400016）摘要：目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子-1（peroxisome proliferator activating receptor coactivator-1，PGC-1）激动剂2-（4-叔丁基苯基）苯并咪唑（2-（4-tert-butylphenyl）benzimidazole，ZLN005）对蛋氨酸胆碱缺乏饮食（choline methionine deficient diet，MCD）诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的作用及机制。方法用MCD饲料喂养小鼠构建NASH模型，给小鼠每日口服15 mg/mL的ZLN005，8周后检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平，对小鼠肝组织进行HE和油红O染色，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性分析，RT-PCR 检测肝组织白介素-1（leucoides-1）mRNA 和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor alpha，TNF-）mRNA 的表达，Western blot检测小鼠肝组织内PGC-1、血红素氧合酶1（heme oxygenase，HO-1）的蛋白表达。结果ZLN005处理，显著降低了血清ALT、AST水平，减轻了MCD诱导的NASH小鼠肝损伤、脂肪变性；减少了小鼠肝组织炎性细胞浸润；同时，ZLN005降低了IL-1和TNF-的mRNA水平；降低了肝脏MDA的含量，提高了SOD活性；上调了PGC-1/HO-1的表达。结论ZLN005可缓解MCD诱导的NASH，其机制可能与激活PGC-1/HO-1通路，发挥抗氧化应激和抗炎作用有关。关键词：ZLN005；非酒精性脂肪性肝病；PGC-1/HO-1中图分类号：R362 文献标识码：A 文章编号：1672-2639（2023）02-0020-06ZLN005，a PGC-1 agonist，attenuated MCD-induced non-alcoholic steatohepatitis in miceZHONG Minxuan1，JIANG Ningman2，LIU Hao2，WAN Jingyuan2，WANG Lu1*（1.School of Basic Medicine，Yanan University，Yanan 716000，China；2.Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400000，China）Abstract：Objective To investigate the peroxisome proliferator activating receptor coactivator-1（PGC-1）of 2-（4-tert-Butylphenyl）benzimidazole（ZLN005）on non-alcoholic steatohepatitis（NASH）induced by choline methionine deficient diet（MCD）in mice.Methods NASH model was established by feeding mice with MCD diet，and the mice were orally given 15 mg/mL ZLN005.Eight weeks later，the serum levels of alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）were detected，the liver tissues of mice were stained with HE and oil red O，and the activities of malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（SOD）were analyzed.The expression of mRNA of leucoides-1 and tumor necrosis factor-（TNF-）in liver tissue were detected by RT-PCR.The protein expression of PGC-1 and heme oxygenase 1（HO-1）in mouse liver tissue were detected by western blot.Results ZLN005 treatment significantly reduced serum ALT and AST levels，reduced MCD induced liver injury and steatosis in NASH mice，and reduced inflammatory cell infiltration in liver tissue of mice.At the same time，ZLN005 decreased the 作者简介：钟敏萱（1997），女，湖北云梦人，在读硕士研究生。研究方向：肝脏代谢疾病。通信作者：王璐（1970），男，陕西淳化人，教授，硕士。研究方向：脑缺血损伤。E-mail： 基础研究 20PGC-1激动剂ZLN005减轻蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎mRNA levels of IL-1 and TNF.The content of MDA in liver was decreased，and the activity of SOD was increased.Conclusion ZLN005 can alleviate MCD induced NASH，and its mechanism may be related to the activation of PGC-1/HO-1 pathway which associated with antioxidant stress and anti-inflammatory effects.Key words：ZLN005；Non-alcoholic fatty liver disease；PGC-1/HO-1非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种慢性肝脏疾病，单纯的肝细胞内过量脂质积累导致脂肪变性被称为非酒精性脂肪肝，而非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatosis hepatitis，NASH）是一种更严重的肝脏疾病，其病理特征包括肝细胞气球样变、脂肪变性、炎症、细胞外纤维化，并可能发展为肝硬化1，并且增加了患 2 型糖尿病和心血管疾病的风险2。有研究表明，当线粒体脂肪酸-氧化或甘油三酯合成负担过重时，脂肪酸有助于产生脂毒性分子，这些分子导致氧化应激和炎症小体激活，而NASH的表型就是由这些事件引起的3。因此，减少脂质积累从而抑制氧化应激和炎症反应，对调控NASH至关重要。线粒体功能受损和过量活性氧（active oxygen，ROS）的产生已被证明介导NASH的病理过程4，而过氧化物酶体增殖物激活受体-共激活因子（peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1，PGC-1）是一个调控线粒体生物发生的关键因子，PGC-1信号通过激活线粒体转录因子（mitochondrial transcription factor，TFAM），增加线粒体DNA转录，进而增强线粒体功能5。在脑缺血损伤中，PGC-1水平的上调显著保护神经元免受氧化应激的刺激而死亡，而其活性降低导致线粒体源性ROS产生增加6。PGC-1在减轻炎症反应中也发挥积极的作用，小胶质细胞中过表达PGC-1抑制了含NLR家族Pyrin域蛋白3（recombinant NLR Family，pyrin domain containing protein 3，NLRP3）炎症小体的激活，使IL-1，IL-6等炎症细胞因子的表达减少，从而发挥神经保护作用，减轻急性缺血性脑损伤7。2-（4-叔 丁 基 苯 基）苯 并 咪 唑（2-（4-tert-Butylphenyl）benzimidazole，ZLN005）是 PGC-1 的激动剂，研究发现ZLN005处理增加了糖尿病db/db小鼠的脂肪氧化，改善葡萄糖耐量、丙酮酸耐量和胰岛素敏感性。ZLN005处理后降低了小鼠血糖和血脂水平8。在本研究中，我们推测ZLN005可通过增加PGC-1活性，增强其抗氧化和抗炎作用来保护MCD（choline methionine deficient diet）诱导的NASH。本文欲探究ZLN005对NASH小鼠的肝损伤、脂质代谢、氧化应激和炎症的影响，并讨论其作用机制。1材料与方法1.1动物及实验材料SPF级雄性C57小鼠24只，体重1822 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，ZLN005购自MedChemExpress公司、蛋氨酸胆碱缺乏饮食饲料购自南京特洛菲公司、油红O染液购自Sigma公司、苏木精购自美国Amresco公司、逆转录试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。BCA定量蛋白试剂购自Bioss公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔购自Cell signaling Technology公司。兔PGC-1抗体购自Abcam公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒，过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。1.2模型及干预将24只6周龄，体重1822 g的雄性C57小鼠分为空白组（blank），ZLN005 药物对照组（15 mg/kg，ZLN005），模 型 组（MCD），ZLN005 药 物 干 预 组（ZLN005 15 mg/kg+MCD），每组6只。ZLN005药物对照组小鼠从第5周开始，每天口服ZLN005（15 mg/kg）一次，持续4周；MCD模型组小鼠每天喂食MCD饲料，持续8周；ZLN005药物干预组小鼠每天喂食MCD饲料，从第5周开始，给小鼠口服ZLN005（15 mg/kg），每天连续，持续4周。造模结束后，同时收取模型组和干预组小鼠肝组织进行检测。1.3血清ALT、AST检测造模结束后 48 h 内麻醉小鼠（5%水合氯醛，10 mL/kg，成都市科隆化学品有限公司）摘眼球采集血液500 L，离心（4，3 600 rpm，10 min），分离血清，根据南京建成生物工程研究所的说明书来检测ALT、AST水平。1.4肝脏组织HE染色分析小鼠肝组织用4%多聚甲醛固定48 h后制备石蜡切片。苏木精染4 min，流水冲洗，饱和碳酸锂返蓝，伊红染3 min，流水冲洗，脱水、透明、中性树脂封片。在正置光学显微镜下观察各组小鼠肝组织病理变化。21第 21 卷 延安大学学报（医学科学版）第 2 期1.5肝脏组织油红O染色肝组织包埋剂（optimal cutting temperature，OCT）包埋，液氮速冻，-80 保存，置于冰冻切片机制作8 m冰冻切片，油红O染液染8 min，封片后正置光学显微镜下采集图片，对红色区域进行分析。1.6肝脏组织中氧应激相关分子检测：MDA 和SOD用电子天平称取0.1 g肝组织放入1.5 mL的无酶EP管中，按照10%的比例加入IP细胞裂解液（碧云天，货号：P0013）进行匀浆，用BCA蛋白测定试剂盒（美国赛默飞，货号UL294772）测定蛋白浓度。按南京建成 MDA 和 SOD 含量测定试剂盒说明书操作，检测肝组织中SOD和MDA含量。1.7逆转录荧光定量PCR按照试剂盒说明书，取各组小鼠肝组织50 mg，于液氮中迅速研磨后加入Trizol试剂提取总RNA，NanoDrop（微量分光光度计）测定纯度，逆转录合成cDNA。按试剂盒（上海生工生物，B532461）说明书配制相关反应体系并设置反应条件，以cDNA为模板进行扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。1.8免疫印迹分析称取适量肝组织，BCA法操作测定蛋白浓度。10的SDS凝胶，上样，电泳结束后将蛋白凝胶转移到PVDF膜上，封闭洗膜，将膜与PGC-1，HO-1一起过夜孵育，TBST清洗，孵育生物素标记山羊抗兔的二抗 1 h，TBST 清洗后孵育辣根过氧化物酶（HRP），用 TBST清洗后加显影液使用凝胶显影仪进行图像采集。1.9统计学方法所有数据均采用 GraphPad Prism 9 软件分析，数据以均数标准差（x s）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA），并用Tukey事后检验进行统计学分析。P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1ZLN005减轻MCD诱导的小鼠肝损伤血清ALT和AST是评价肝功能的重要指标，当两者比值偏低时提示肝细胞坏死。小鼠血清进行ALT、AST检测，与空白组相比，MCD模型组的血清ALT、AST水平显著升高（P0.001），而ZLN005药物干预组则较MCD模型组明显下降（P0.01，图1）。肝组织切片HE染色组织学分析和NAS评分显示，MCD模型组小鼠肝组织炎症细胞浸润、肝细胞坏死和脂肪变性增加（P0.001），而ZLN005药物干预组小鼠肝组织损伤、肝细胞坏死及脂肪变性明显减轻（P0.001，图1C、1D）。2.2ZLN005减轻MCD诱导的小鼠肝脂肪变性油红O染色反映肝细胞中脂滴分布情况，本研究对各组小鼠肝组织进行油红O染色，并对红色部分进行分析（图2），结果显示，MCD模型组小鼠肝组织 脂 滴 数 量 多 且 脂 滴 面 积 明 显 大 于 空 白 组（P0.001），而ZLN005药物干预组小鼠肝组织脂滴数量和面积显著减少（P0.01）。2.3ZLN005减轻MCD诱导的小鼠肝脏炎症和氧化应激细胞因子是重要的炎症介质，通过RT-PCR检测炎症细胞因子 IL-1 mRNA 和 TNF-mRNA 水平来评价NASH小鼠肝脏炎症反应。结果显示，与空白组相比（图3A），MCD模型组IL-1 mRNA的表达明显增加（P0.01），然而 ZLN005 药物干预组IL-1 mRNA 的 水 平 有 所 降 低（P0.05），表 明ZLN005的使IL-1的表达减少。如图3B所示，与空白组相比，MCD模型组TNF-mRNA水平显著升高（P0.001），而 ZLN005 药物干预组小鼠的 TNF-mRNA 水平明显下降（P0.01），提示 ZLN005 的处理抑制了促炎细胞因子TNF-的表达。MDA是脂质过氧化的终产物，SOD是一种可以清除自由基的抗氧化酶，用来评价氧化应激的严重程度。本研究结果显示（图3C、3D），MCD模型组的肝组织中MDA含量明显高于空白组，SOD活性明显低于空白组（P0.001），而ZLN005药物干预组小鼠肝组织中MDA含量显著降低，SOD活性显著增高（P0.01）。综合以上结果表明，PGC-1激动剂ZLN005的处理改善了MCD诱导的炎症和氧化应激。2.4ZLN005增强小鼠肝脏 PGC-1a/HO-1信号分子的表达为了进一步研究 ZLN005 减轻 MCD 诱导的NASH 小鼠的作用是否与 PGC-1/HO-1信号通路有关，本课题用免疫印迹实验评价各组小鼠肝组织中PGC-1/HO-1基因的表达。如图4所示，与空白表1逆转录荧光定量PCR引物序列GeneIL-1TNFPrimer sequence（5-3）Forward primer：GCA ACT GTT CCT GAA CTC AAC TReverse primer：ATC TTT TGG GGT CCG TCA ACTForward primer：CCC TCA CAC TCA GAT CAT CTT CTReverse primer：GCT ACG ACG TGG GCT ACA G22PGC-1激动剂ZLN005减轻蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎A：血清ALT活性；B：血清AST活性；C：肝脏HE染色（放大倍数：1010）；D：NAS评分；数据以x s形式表示；n=6；*P0.01，*P0.001图1ZLN005对MCD诱导的肝损伤的影响A：肝组织油红O染色（放大倍数：1010）；B：肝组织甘油三酯含量；数据以x s形式表示；n=6；*P0.01，*P0.001图2ZLN005对MCD诱导的肝脂肪变性的影响A：肝组织中IL-1 mRNA表达；B：肝组织中TNF-mRNA表达；C：肝组织中MDA含量；D：肝组织中SOD活性；数据以x s形式表示；n=6；*P0.05，*P0.01，*P0.001图3ZLN005对MCD诱导的肝脏炎症细胞因子和氧应激的影响23第 21 卷 延安大学学报（医学科学版）第 2 期组相比，MCD模型组中PGC-1和HO-1的表达水平增加（P0.05），而与 MCD 模型组相比，ZLN005药物干预组 PGC-1（P0.001）和 HO-1（P0.01）的表达水平显著增加。这说明ZLN005处理上调了PGC-1/HO-1信号分子的表达。3讨论ZLN005 作为 PGC-1 的激动剂，在治疗糖尿病db/db小鼠、脑缺血损伤、肾纤维化小鼠中通过抗氧化应激发挥保护作用9。ZLN005可降低MDA水平和 SOD 活性改善高糖诱导的心肌细胞内质网应激和氧化应激，增强心肌细胞活力9-10。然而，ZLN005在减轻NASH中的作用及其机制还需深入探究。在本课题中，MCD模型组小鼠的肝脏有大量脂质蓄积，表明MCD饮食导致小鼠肝脏脂质代谢紊乱。这是输送到肝细胞的脂质过多，导致肝细胞内甘油三酯和脂肪酸合成增加，极低密度脂蛋白合成减少。另外，HE染色发现，MCD模型组小鼠肝脏有大量的脂肪空泡，显示出小鼠肝脏脂肪变性严重，而ZLN005处理后，小鼠肝脏脂肪空泡数量明显变少，脂滴面积显著缩小，肝脏脂肪沉积减少。这表明，ZLN005通过减少NASH小鼠的脂质含量来改善肝脏脂肪变性。PGC-1已被证明是调节线粒体生物发生和功能的关键因子，包括氧化磷酸化和活性氧清除。PGC-1通过增加线粒体抗氧化基因的转录和脂肪酸氧化参与氧化应激和脂质代谢11。Cheng12等人发现在肝脏中过表达PGC-1增加了肝脏脂肪酸氧化，减少了体内和体外甘油三酯的储存和分泌。在本研究中发现，ZLN005处理明显增加了PGC-1表达，说明 ZLN005 通过增加脂肪酸氧化来改善MCD诱导的NASH。在NASH中，脂质过度积累增加了氧化的负担，使ROS水平上升。PPAR属于PPAR核受体家族，因其下游抗氧化分子 HO-1 和过氧化氢酶（CAT）的转录激活在抗氧化防御系统中起关键作用13。PGC-1作为PPAR的共激活因子，它的活化增强了PPAR抗氧化损伤的功能。MDA是线粒体脂质过氧化的标志物，是最常用来评价氧化应激的生化指标14。另外，SOD是一种抗氧化酶，它将超氧化物转化为过氧化氢（H2O2），H2O2被CAT进一步分解生成水和氧气15。在本研究中，MCD模型组小鼠肝脏MDA水平显著升高，SOD活力显著降低。ZLN005 处理后明显减少了 MDA 的产生并增强了SOD活性。血红素氧合酶-1（HO-1）催化血红素降解为胆绿素/胆红素发挥其抗氧化和抗炎的特性16。有证据表明，HO-1在炎症性肠病，肥胖，代谢综合症等疾病中通过减少炎症介质的表达和ROS的生成发挥保护作用17。本课题发现，MCD诱导小鼠肝脏IL-1和TNF-的分泌增多，HO-1表达下调，而ZLN005治疗显著抑制了IL-1和TNF-这些炎症细胞因子的释放，增加了小鼠肝脏 HO-1 的表达。因此，我们的研究表明，ZLN005治疗可以通过提高细胞抗炎和抗氧化活性来缓解 MCD诱导的 NASH小鼠炎症和氧化应激。表明 ZLN005 治疗通过调节 PGC-1 和 HO-1通路来参与氧化应激和炎症，从而减轻NASH。综上所述，本研究显示 ZLN005 对 NASH 发挥有益作用，是通过激活 PGC-1 和 HO-1信号来减轻氧化损伤和炎症实现的。A：免疫印迹分析；B：PGC1a蛋白定量；C：HO-1蛋白定量；数据以x s形式表示；n=3；*P0.05，*P0.01，*P0.001图4ZLN005对肝组织中PGC1a/HO-1蛋白表达的影响24PGC-1激动剂ZLN005减轻蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎参考文献：1 FRIEDMAN S L，NEUSCHWANDER-TETRI B A，RINELLA M，et al.Mechanisms of NAFLD development and therapeutic strategies J.Nature Medicine，2018，24（7）：908-9222 BYRNE C D，TARGHER G.NAFLD：A multisystem disease J.Journal of Hepatology，2015，62（1）：S47-S643 FRANCQUE S，SZABO G，ABDELMALEK M F，et al.Nonalcoholic steatohepatitis：The role of peroxisome proliferator-activated receptors J.Nature Reviews Gastroenterology&Hepatology，2021，18（1）：24-394 MANSOURI A，GATTOLLIAT C H，ASSELAH 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