艳山姜挥发油对四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损伤保护作用及机制.pdf

基础研究艳山姜挥发油对四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损伤保护作用及机制文波，罗芳，付凌云，徐旖旎，陶玲，张甜，林浩恒，沈祥春（贵州医科大学 药学院 天然药物资源优效利用重点实验室 贵州省高等学校天然药理与成药性评价重点实验室，贵州 贵阳 ；贵州医科大学附属医院 神经内科，贵州 贵阳 ）摘要目的探讨艳山姜挥发油（）对四氧嘧啶诱导大鼠胰岛细胞（）损伤的保护作用及机制。方法体外培养 细胞至对数生长期，测定不同浓度四氧嘧啶（、及 ）下细胞存活率，取存活率较高的浓度进行后续实验；细胞分为对照组、模型组、低、中、高剂量组（分别为 、及 ），采用 法检测各组细胞存活率，生化法检测丙二醛（）、超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽过氧化物酶（）含量，法检测乳酸脱氢酶（）含量和胰岛素分泌量，法检测 淋巴细胞瘤 （）、关联 蛋白（）以及半胱氨酸 天冬氨酸特异性蛋白酶 （）蛋白的表达；机制研究进一步设置 组（）、组（）以及 组（），采用 法检测 蛋白的表达。结果选择 四氧嘧啶（存活率 ）作为诱导细胞最佳损伤浓度，并复制 细胞损伤模型；与对照组比较，模型组细胞存活率降低、和 释放量增加、释放和胰岛素分泌量减少、蛋白表达下调、和 蛋白表达上调（）；与模型组比较，各剂量组细胞存活率升高、胰岛素分泌增加（），中、高剂量组 和 释放降低、和 释放量增加、蛋白表达上调、和 蛋白表达下调、降低（）；与 组、组比较，组 蛋白表达均下调（）。结论 可改善四氧嘧啶诱导的 胰岛细胞损伤，其机制与抑制细胞凋亡有关。关键词艳山姜挥发油；四氧嘧啶；糖尿病；胰岛细胞；细胞凋亡 中图分类号 文献标识码 文章编号 （）：，（，；，）（）（），（，）第 卷第 期 年 月贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目 贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题项目（）；国家自然科学基金项目（）；国家自然科学基金委 贵州喀斯特中心项目子课题（）；贵州省科技计划项目（黔科合基础 一般 ）；贵州省科技计划项目（黔科合基础 ）通信作者 ：引用本文：文波，罗芳，付凌云，等 艳山姜挥发油对四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损伤保护作用及机制 贵州医科大学学报，（）：，（），（）（）（），（）（）（）（），（）（），（），（）（），（），（），（），（），；糖尿病（，）是一种在全球范围内广泛流行的体内胰岛素的相对或绝对分泌不足引起的糖、脂及蛋白质代谢紊乱，伴有多种并发症且尚无法根治的内分泌疾病 ，其中 型糖尿病占 总发病率的 。的病理生理机制主要包括胰岛细胞受损和胰岛素抵抗两个方面。细胞是胰岛细胞的一种，通过分泌胰岛素调节机体血糖，在 的形成中发挥关键性作用。胰岛功能受损是 型糖尿病的主要特征之一 ，四氧嘧啶通过产生超氧自由基选择性地破坏 细胞，使其数目减少、功能受损，从而胰岛素分泌减少，进一步导致 的产生。因此，抑制胰岛细胞数量减少和恢复胰岛正常功能对治疗 及减少并发症的发生有着重要作用。艳山姜源于姜科植物艳山姜 （）的干燥成熟果实，主要含有挥发油类、黄酮类和二萜类等成分 。本实验室以往研究证实，艳山姜挥发油（，）具有广泛的抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗炎镇痛、抗氧化、抗高尿酸等心血管药理活性 。本研究在前期研究的基础上，结合 发生过程中关键细胞的病变特征，探讨 对四氧嘧啶诱导 胰岛细胞凋亡的保护作用及可能的机制，以期为贵州民族药艳山姜的进一步开发应用提供实验基础。材料与方法 实验材料 细胞株大鼠胰岛细胞（）株购自于美国 公司。药物利用水蒸气蒸馏法提取 后，精密称取 （约 ），加二甲基亚砜 溶解，配制成 的母液，微孔滤膜除菌，放置备用。实验时用无血清培养基稀释成不同浓度给药。主要试剂 （美国 ），四氧嘧啶（美国 ），丙二醛（，）、超氧化物歧化酶（，）、谷胱甘肽过氧化物酶（，）、乳酸脱氢酶（，）以及胰岛素检测试剂盒（南京建成），培养基、胰蛋白酶以及 裂解贵 州 医 科 大 学 学 报 卷液（美国 ），淋巴细胞瘤 （，）、关联 蛋白（，）以及半胱氨酸 天冬氨酸特异性蛋白酶 （，）抗体（美国 ），羊抗鼠、羊抗兔 抗体（美国 ），抑制剂（上海碧云天），发光液（美国 ）。主要仪器 双人单面净化工作台（浙江孚夏），立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯），垂直电泳系统、凝胶成像系统（美国 ），酶联免疫检测仪（美国伯腾），低温冷冻离心机（德国 ），倒置相差显微镜（日本 ），超低温冰箱（美国 ），细胞培养箱（苏州净化），制冰机（常熟市雪科电器），型纯水机（武汉天恒）。研究方法 细胞培养液氮中取出 细胞立即放入 水浴中以迅速解冻。随后接种于培养瓶中，加入含 胎牛血清的 培养基，于 ，饱和湿度条件的培养箱中培养，隔夜换液。待其生长约 ，用 的胰酶消化，培养基中和后离心弃上清，计数后加新鲜培养基完成传代。取对数生长期细胞用于后续实验。四氧嘧啶诱导 细胞损伤浓度的筛选将处于对数生长期的 细胞以 个 密度接种到 孔板中，每孔 。培养后 换液，待其长满后，加入浓度分别为 、的四氧嘧啶，每种浓度设 个复孔，培养 后进行 检测。各孔加入 ，继续孵育 ，弃上清，每孔加 溶液 ，于低速摇床上震荡 ，使蓝色结晶完全溶解。在酶标仪 波长处测定各孔 值，根据每孔 值计算各组细胞存活率，确定造模浓度。实验重复 次。计算公式如下：细胞存活率 （给药组 值 空白调零组 值）（对照组 值 空白调零组 值）。分组与给药根据实验室前期研究结果确定 的给药剂量 ，。实验分为 组：对照组（无血清培养基）、模型组（四氧嘧啶）、低剂量组（四氧嘧啶）、中剂量组（四 氧 嘧 啶）以 及 高 剂 量 组（四氧嘧啶）。机制研究分为 组：对照组（无血清培养基）、模型组（四氧嘧啶）、组（四 氧 嘧 啶）、组（四氧嘧啶）、组（四氧嘧啶）。按照对应分组给药，进行后续指标检测。法检测细胞存活率将细胞接种于 孔 板 中，待 生 长 密 度 约 时，按 照 方 法“”项处理，每组 个复孔；随后按“”项下 检测步骤测定细胞存活率。生化法检测 、和 的含量将细胞接种于 孔板中，按照方法“”项处理。收集细胞上清液后，根据试剂盒说明书检测细胞上清液中 、的含量。法检测 和胰岛素分泌量将细胞接种于 孔板中，按照方法“”项处理。收集细胞上清液后，根据试剂盒说明书检测细胞上清液中 的外漏量和胰岛素的分泌量。检测分析 、以及 蛋白的表达将细胞接种于 孔板中，按照“”项处理后，润洗 次弃去孔内液体，加入细胞裂解液与 蛋白抑制剂裂解细胞，离心后收集上清，法定量，变性分装后采用 法进行电泳。充分分离蛋白转移至 膜，封闭 ，加入稀释比为 的 、抗体冰箱孵育过夜。次日回收一抗，清洗后加稀释比为 的二抗室温孵育 ，回收二抗，洗涤 次，显影，采用凝胶成像系统进行成像和数据分析。以 作为内参进行归一化处理，计算蛋白的表达量。实验重复 次。统计学分析采用软件 对数据进行统计学处理，实验数据以均数 标准差（）表示，组间比较采用 进行分析，以 表示差异具有统计学意义。结果 细胞损伤模型采用浓度为 、的四氧嘧啶分别作用于 细胞后，细胞存活率呈浓度依耐性降低。与 的四氧嘧啶组细胞比 较 比 较，从 四 氧 嘧 啶 浓 度 从期文波等艳山姜挥发油对四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损伤保护作用及机制 开始，之后各浓度组细胞存活率下降，差异有统计学意义（）。本实验选择 （存活率为 ）为诱导细胞最佳损伤浓度。见表 。表 不同浓度四氧嘧啶对 细胞存活率的影响（，）（，）组别四氧嘧啶浓度（）细胞存活率 对照组 四氧嘧啶组 （）（）（）（）（）（）（）注：（）与 的四氧嘧啶组比较，。对 细胞存活率的影响与对照组比较，模型组 细胞存活率降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，各剂量组 细胞存活率升高，差异有统计学意义（）。见图 。注：（）与对照组比较，；（）与模型组比较，。图 对四氧嘧啶诱导 存活率的影响 对 细胞 、和 水平的影响与对照组比较，模型组 细胞中 和 含量增加，和 含量降低，差异有统计学意义（）；与模型组比较，除 低剂量组 和 比较差异无统计学意义外（），其余剂量组 和 含量降低（），和 含量升高（）。见图 。注：（）与对照组比较，；（）与模型组比较，。图 对四氧嘧啶诱导 细胞上清液中 、以及 的影响 ，贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 对 细胞胰岛素分泌的影响与对照组比较，模型组胰岛素分泌减少（）；与模型组比较，各剂量组胰岛素分泌增多（）。见图 。对 细胞中 、和 蛋白表达的影响与对照组比较，模型组 和 蛋白表达上调（），蛋白表达下调（），升高（）；与模型组比较，除 低剂量组 蛋白表达比较差异无统计学 意 义 外（），其 余 剂 量 组 和 蛋白表达下调（），蛋白表达上调（），降低（）。见图 。注：（）与对照组比较，；（）与模型组比较，。图 对四氧嘧啶诱导 细胞上清胰岛素分泌的影响 注：为蛋白条带图，分别为 、及 蛋白的定量表达；（）与对照组比较，；（）与模型组比较，。图 对四氧嘧啶诱导 细胞中 、以及 蛋白表达的影响 ，期文波等艳山姜挥发油对四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损伤保护作用及机制 抑制剂作用下 对四氧嘧啶诱导 细胞 蛋白表达的影响与对照组比较，模型组 蛋白表达上调（）；与模型组比较，组 蛋白表达下调（）；与 组、组 分 别 比 较，组 蛋白表达均下调（）。见图 。注：为蛋白条带图，为 蛋白的定量表达；（）与对照组比较，；（）与模型组比较，；（）与 组比较，；（）与 比较，。图 作用下 对四氧嘧啶诱导 细胞中 蛋白表达的影响 讨论胰岛细胞损伤、胰岛素分泌不足是导致 的关键病理过程。各种因素如外界刺激（如高糖高脂）、炎症、氧化应激等均可引起胰岛细胞损伤，导致细胞膜通透性改变、细胞凋亡相关通路被激活，主要表现为细胞收缩、体积变小、胞质密集、细胞器和染色质联系更为紧密、胞核碎裂以及凋亡小体形成 。四氧嘧啶是自由基活性剂，主要通过产生超氧自由基破坏胰岛 细胞导致胰岛素合成减少，从而使机体血糖升高。腹腔给予四氧嘧啶构建糖尿病动物模型的成功率在 以上，因此可用于复制 型糖尿病模型 。机体通过维持氧化系统和抗氧化系统的平衡保证正常功能。可反应细胞损伤程度，当细胞损伤时，细胞内过氧化物质如 、增多，而抗氧化物质如 、等减少。本研究发现，干预后，含量和 外漏量具有不同程度减少，而 和 增多，提示 可通过加强细胞清除自由基的能力，减少细胞氧化应激损伤，从而发挥保护作用。此外，胰岛素检测结果表明，作用后，胰岛素分泌增多，提示其可通过减少损伤恢复胰岛细胞功能促进胰岛素的释放。在细胞凋亡过程中，凋亡蛋白分子发挥调控作用，蛋白的活化是导致细胞凋亡的中心环节。是内源性或线粒体凋亡途径的凋亡起始蛋白酶，也是 家族的重要代表，可启动和触发内在细胞凋亡信号然后传递到下游，诱导细胞级联损伤，引起细胞死亡 。与 属于同一家族，两者之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素 ，当细胞损伤或凋亡时，表达异常增多，表达异常减少，从而导致 与 的比值（）异常降低。本研究发现，经过 预处理后能明显增加细胞中抗凋亡蛋白 的表达水平，减少 和 凋亡蛋白的表达水平，且 与 的比值统计结果也证实了 能改善两者之间的异常表达状态。为进一步明确其作用与抑制凋亡是否相关，本实验继续采用了凋亡蛋白有效抑制剂 进行验证。结果显示，当采用 联用凋亡蛋白抑制剂后，表达进一步降低。提示 可协同 抑制 蛋白表达，证实 抑制四氧嘧啶诱导 的损伤与抑制细胞凋亡密切相关。尽管当前研究对于 保护 细胞损伤的作用和机制有了一定的认识，但仍不深入，是否通过其他信号通路发挥作用有待进一步研究，有望有更多发现其可能具备潜在的降血糖的功能。综上所述，对四氧嘧啶诱导的 细胞损伤具有保护作用，其机制与提高胰岛细清除自由基的能力和抑制细胞凋亡作用有关。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 参考文献 ，：，：，（）：，：，（）：侯清涛，李芸，李舍予，等全球糖尿病疾病负担现状 中国糖尿病杂志，（）：王倩膳食蛋白质摄入量及种类对 型糖尿病的影响 中国乳业，（）：刘娜，刘腾丽，王乐，等棕榈酸诱导人胰岛 细胞去特征化 中国病理生理杂志，（）：贵州省药品监督管理局 贵州省中药材民族药材质量标准第 册 北京：中国医药科技出版社，：张雯，张嫩玲，张彦燕，等基于 信号通路调控的艳山姜挥发油对高糖诱导血管内皮细胞损伤的保护作用 中国实验方剂学杂志，（）：文波，令狐克刚，徐旖旎，等艳山姜挥发油抑制 磷酸化对 诱导的 损伤的影响 中国实验方剂学杂志，（）：，：，：赵爽，何丽，黄梅，等艳山姜挥发油通过 信号通路抑制高糖诱导的内皮间质转分化 中国实验方剂学杂志，（）：吴林菁，张幸幸，蔡正伦，等 艳山姜挥发油对小鼠高尿酸血症的保护作用 贵州医科大学学报，（）：，（）：文波基于 与 信号 调控的 对 诱导 损伤保护作用实验研究 贵阳：贵州医科大学，任正肖，朱庆均，王彦芳，等中药调控细胞凋亡抗动脉粥样硬化研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：唐艺丹，王鲜忠，张姣姣型糖尿病动物模型构建的研究进展 中国实验动物学报，（）：崔淼，朱春江，刘向荣 糖尿病动物模型构建的研究进展 中国实验诊断学，（）：，（）：，（）：，（），（）：郑凯，杨梅桂，闫朝君，等线粒体动力学与细胞凋亡 中国细胞生物学学报，（）：（收稿，修回）中文编辑文箐颍英文编辑张启芳期文波等艳山姜挥发油对四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损伤保护作用及机制