革兰氏染色法.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,一 目的要求：,1,、学习并初步掌握革兰氏染色法。,2,、了解革兰氏染色法的原理极其在细菌分类,鉴定中的重要性。,二 基本原理：,革兰氏染色法是,1884,年由丹麦病理学家,Christain Gran,创立的，基本步骤是：,1,、初染：结晶紫染色,2,、媒染：碘液媒染,3,、脱色：乙醇脱色,4,、复染：番红复染,经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。,Gram stain of Gram-,Gram stain of Gram+,实验原理：,细菌对革兰氏染色的不同反应是由于它们,细胞壁,的成分和结构不同而造成的。初染后，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫,碘的复合物，增强染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔经缩小，透性降低，从而使结晶紫,碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂质含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫,碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,Structure of a Gram-Negative Cell Wall Structure of a Gram-Positive Cell Wall,三、器材：,大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，革兰氏染色液，,载玻片，显微镜等,四、操作步骤：,1,、涂片：将大肠杆菌（,24h,）和金黄色葡萄球菌（,24h,）分别涂片、干燥、固定。,2,、染色：,（,1,）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗,（,2,）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖一分钟，水洗,（,3,）脱色：将水甩净，并衬以白背景，用,95%,乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，约,2030,秒，立即用水冲净乙醇,（,4,）复染：用番红液染,1-2,分钟，水洗,3,、镜检：干燥后，油镜观察。以分散开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。,4,、混合制片观察：一载玻片上两种菌混合制片，对比观察。,步骤,1,：涂片,步骤,2,：干燥,步骤四 染色,步骤三 固定,crystal violet stain,wash with water,结晶紫染色 水洗,Stain with,grams iodine solution,碘液复染,Decolorize by adding,95%alcohol,95%,酒精脱色,Counterstain with Safranin,沙黄复染,Results of stain,染色结果,五 注意事项,1,）注意涂片不宜过。,2,）火焰固定温度要适宜。,3,）注意控制好脱色程度。,六、实验报告：,1,、结果：列表简述,2,株细菌的染色观察结果（形状、颜色、革兰氏染色反应）。,2,、思考题：,1,）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键步骤是什么？,2,）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？,3,）造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？,