百里香酚微囊的制备与评价.pdf

第 7 卷第 2 期2023 年 6 月现 代 牧 业MODERN ANIMAL HUSBANDRYVol.7 No.2Jun.2023收稿日期:2023-02-25基金项目:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(212102110366);河南牧业经济学院博士科研启动资金项目(M4030140)。作者简介:李宇伟(1976),男,河南汝州人,副教授,硕士。通信作者:张桂枝(1970),女,河南新乡人,副教授,硕士。百里香酚微囊的制备与评价李宇伟1,连瑞丽1,马梦菲1,张桂枝2,3,娄 飞1,曲书昊1(1.河南牧业经济学院 动物医药学院,河南 郑州 450046;2.河南牧业经济学院 动物科技学院,河南 郑州 450046;3.河南省家禽疾病防控工程技术研究中心,河南 郑州 450046)摘要:试验旨在优化百里香酚微囊的制备工艺,提高其稳定性。通过百里香酚微囊包被技术,以阿拉伯胶和壳聚糖为壁材、50%戊二醛为固化剂,在 40、450 r/min 的条件下,采用单因素试验与正交试验相结合的方法对微囊制备工艺进行优化,筛选最佳的制备工艺,通过溶出度和形态分布对微囊进行质量评价。正交试验结果表明,最佳制备条件为百里香酚与壁材之比 15、壳聚糖与阿拉伯胶之比 1139、壁材浓度 0.0208 g/mL。溶出度实验表明,百里香酚微囊的形成,能够提高百里香酚的稳定性。显微镜下可观察到,百里香酚微囊呈圆形、表面光滑。试验确定了百里香酚微囊的最佳制备工艺,百里香酚微囊的稳定性较高。关键词:百里香酚;微囊;工艺优化;质量评价中图分类号:S816.7 文献标识码:A 文章编号:2096-2975(2023)02-0027-08Preparation and evaluation of thymol microcapsulesLI Yvwei1,LIAN Ruili1,MA Mengfei1,ZHANG Guizhi2,3,LOU Fei1,QU Shuhao1(1.College of Veterinary Medicine,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou Henan 450046;2.College of Animal Science and Technology,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou Henan 450046;3.Henan Poultry Disease Prevention and Control Engineering Technology Research Center,Zhengzhou Henan 450046)Abstract:The purpose of this experiment was to optimize the preparation technology of thymol microcapsules and improve its stability.Thymol microcapsules were coated with arabic gum and chitosan as wall materials and 50%glutaraldehyde as curing agent.Under the conditions of 40,450 r/min,single factor test and orthogonal test were used to optimize the preparation process of microcapsules,and the quality of microcapsules was evaluated by dissolution and morphology distribution.The results of orthogonal test showed that the optimum preparation conditions were as follows:the ratio of thymol to wall material was 15,the ratio of chitosan to Arabic gum was 1139,and the wall material concentration was 0.0208 g/ml.Dissolution test showed that the formation of thymol microcapsules can improve the stability of thymol.Microscopically,thymol microcapsules are round and smooth.The best preparation technology of thymol microcapsules was determined,and the stability of thymol microcapsules was higher.Key words:Thymol,microcapsules,pross optimization,quality evaluation 规模化养殖中抗生素的滥用,使得药物残留超标,严重影响食品安全,威胁人类健康。植物精油来源于天然植物,具有抗菌、抗氧化、调节免疫力等多种作用1,2,植物精油作为替抗功能性添加剂产72李宇伟,等:百里香酚微囊的制备与评价品之一,引起了国内外学者的广泛关注。百里香酚具有促进生长3、抑菌消炎4,5、抗氧化6,7、提高免疫力等药理作用6-8,但其稳定性差、易挥发,直接应用于畜禽疾病防控存在很大的局限性,不能达到预期的效果。微囊是固态或液态药物被壁材包裹成圆球形,使药物到达靶细胞后缓慢释放药物,减少药物对胃肠道的损伤,减少毒副作用,使药物稳定性增强等9-11。本试验通过百里香酚的微囊包被技术,采用单因素试验与正交试验优化百里香酚微囊的制备工艺,并对微囊进行质量评价,为植物精油“替抗”产品的进一步开发利用奠定基础。1 材料与方法1.1 试验材料百里香酚购自天津市科密欧化学试剂有限公司;壳聚糖、50%戊二醛、阿拉伯胶购自天津市科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇购自德州曼巴商贸有限公司;10%氢氧化钠溶液购自西陇科学股份有限公司;10%醋酸溶液购自成都市科隆化学品有限公司。1.2 主要试验仪器101-3A 型电热鼓风干燥箱购自天津市泰斯特仪器有限公司;85-2A 型磁力搅拌器购自常州润滑有限公司;SHB-III 型循环水式多用真空泵购自郑州长城科工贸有限公司;SQP 型万分之一电子天平购自 赛 多 利 斯 科 学 仪 器 北 京 有 限 公 司;TU-1810SPC 型紫外-可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司;CKX53 型倒置相差荧光显微镜购自奥林巴斯公司中国公司;ZRS-8G 型溶出度测定仪购自天津市精拓仪器科技有限公司。1.3 试验方法1.3.1 百里香酚微囊的制备采用复凝聚法制备百里香酚微囊12,13,称量0.5 g 壳聚糖置于烧杯中,加入 10%的醋酸溶液搅拌至充分溶解;再称量 2 g 阿拉伯胶于烧杯中,加入40 的纯水稀释使其完全溶解。准确称取0.5 g 百里香酚,倒入阿拉伯胶溶液中,不断搅拌直至初乳形成。取上述阿拉伯胶和百里香酚乳剂置于烧杯中,加入壳聚糖溶液混合均匀后水浴加热。用 10%的氢氧化钠,调节 pH 至 4.0,显微镜下观察是否有百里香酚微囊生成。搅拌 5 min,加入适量 50%的戊二醛,再用 10%氢氧化钠调节 pH 至 7.0,继续搅拌0.5 h。微囊静置过夜,弃去上清液,抽滤,并用纯水洗涤至微囊表面无戊二醇气味,在 40 烘箱中干燥16 h,得到百里香酚微囊,称量后计算收率和包封率。1.3.2 微囊中百里香酚的包封率及收率的测定分别取 3 mg、3.5 mg、4 mg、4.5 mg、5 mg 百里香酚置于 100 mL 容量瓶,定容至刻度线并摇匀,测定吸光度,计算百里香酚的含量。因壳聚糖和阿拉伯胶均不溶于乙醇,也不溶于水,可通过测定微囊样品上清液中百里香酚的含量,得到微囊的包封率14,15。微囊包封率=投药量-囊外药量投药量100%微囊收率=微囊的实际质量总量100%1.3.3 单因素试验优化百里香酚微囊的制备工艺以包封率为评价指标,壳聚糖和阿拉伯胶为囊材16,百里香酚为囊芯,戊二醛为固化剂,选择芯壁比、壁材比和壁材浓度三个因素,进行单因素试验。1.3.3.1 最佳芯壁比 分别添加 0.3 g、0.35 g、0.4 g、0.45 g、0.5 g 百里香酚(芯壁比为 325、750、425、950、15)、进行试验,并计算包封率,选择最优的芯壁比进行下一个单因素试验。1.3.3.2 最佳壁材比 根据 1.3.3.1 所得最佳芯壁比,以壳聚糖和阿拉伯胶的比例为 4 21、941、14、1139、619 进行试验,计算包封率,选择最优的壁材比进行下一个单因素实试验。1.3.3.3 最佳壁材浓度 根据 1.3.3.1 和 1.3.3.2 所得最佳芯壁比、壁材比使用量,以壁材的浓度为 0.0125 g/mL、0.0139 g/mL、0.0156 g/mL、0.0179 g/mL、0.0208 g/mL 进行试验,计算包封率,选择最优的壁材浓度。1.3.4 正交试验优化百里香酚微囊的制备工艺以包封率为评价标准,通过单因素试验筛选出最优的芯壁比、壁材比、壁材浓度,设计三因素三水82李宇伟,等:百里香酚微囊的制备与评价平的正交试验,并对百里香酚微囊正交试验结果进行综合评价,从而得出制备百里香酚微囊的最佳工艺条件。百里香酚微囊正交试验因素水平见表 1。综合评价=(包封率包封率 max0.6+收率收率 max0.4)100%表 1 正交试验因素水平表因素名称A:芯壁比B:壳聚糖:阿拉伯胶C:壁材浓度/(g/mL)水平 11 51 40.0208水平 29 5011 390.0179水平 34 256 190.01561.3.5 百里香酚微囊最佳制备工艺的验证试验对 1.3.4 正交试验所得最优工艺参数进行三组平行试验,对结果进行验证。1.3.6 百里香酚微囊的质量评价1.3.6.1 百里香酚微囊的溶出度评价 根据中华人民共和国药典中测量溶出度的方法17,量取 9 mL 浓盐酸置于含有纯水的烧杯中,边到浓盐酸边搅拌,并加水至 1000 mL,将稀盐酸超声脱气 0.5 h,倒于溶出度测定仪中,相同方法配制5 份稀盐酸备用。分别称取 1 g 百里香酚微囊两份、0.3935 g 百 里 香 酚、芯 材 和 壁 材 物 理 混 合 物(0.5664 g 壳聚糖、1.7946 g 阿拉伯胶、0.3935 g 百里香酚),对应地置于 2、3、4、5 号稀盐酸溶液中,1 号稀盐酸溶液设为空白对照。溶出度测定仪温度为 37,转速为 100 r/min。分别测定其在 0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、60 min、90 min、135 min 时的吸光度。溶出度 X=AnA100%累积溶出度 Y=Xn+(Xn-1+Xn-2+Xn)VV1式中:An-不同时间点溶液对应的吸光度;A-加入总药物的吸光度;V-溶出介质的总体积;V1-各时间点所取溶液的体积。1.3.6.2 百里香酚微囊的形态分布评价 分别取少量百里香酚微囊、阿拉伯胶、壳聚糖、百里香酚、芯材和壁材混合物置于光学显微镜下观察各组的形态,判断是否有微囊形成。2 结果与分析2.1 百里香酚标准曲线的确定对百里香酚在波长为 200400 nm 的范围进行扫描,紫外光谱图如图 1 所示,百里香酚原料药的最大吸收波长均为 274 nm。通过紫外测得各浓度的吸光度分别是 0.394、0.440、0.528、0.591、0.646,得到回归方程:y=0.0131x-0.0042(相关系数 R2=0.9918),如图 2 所示,说明百里香酚在 3050 g/mL浓度范围内有较好的线性关系。图 1 百里香酚的紫外吸收波长图92李宇伟,等:百里香酚微囊的制备与评价图 2 百里香酚的标准曲线图2.2 百里香酚微囊的单因素试验结果2.2.1 芯壁比对百里香酚微囊的影响因素 A 是芯壁比、因素 B 是壁材比、因素 C 是壁材浓度,固定搅拌速度为 450 r/min、温度为40、固化剂用量为 1 mL、壁材比为 14、壁材浓度为 0.0156 g/mL,芯壁比为 325、750、425、950、1 5 进行试验。结果如表 2 所示,在该芯壁比范围内,包封率随着芯材量的增加而提高,百里香酚为0.5 g 时包封率最高,故芯壁比选择 15。表 2 芯壁比对百里香酚微囊的影响序号ABC/(g/mL)包封率/%收率/%综合评价13 251 40.0156 38.90 81.83 97.4427 501 40.0156 38.99 82.51 97.8934 251 40.0156 39.10 82.55 98.0849 501 40.0156 39.32 84.36 99.2651 51 40.0156 39.35 100 1002.2.2 壁材比对百里香酚微囊的影响芯壁比为 15、壁材比分别为 421、941、14、11 39、619 进行试验。结果如表 3 所示,在此范围内,随着壁材比的增加包封率、收率也随之增加,当壁材比为 619 时包封率和收率又降低,可能由于乳剂的黏度太高使得囊壳的结构不稳定,易被破坏,故最佳壁材比是 1139。表 3 壁材比对百里香酚微囊的影响 序号ABC/(g/mL)包封率/%收率/%综合评价11 54 210.0156 33.3356.96 81.3121 59 410.0156 33.34 67.31 86.8731 51 40.0156 33.27 71.02 88.7541 511 390.0156 39.36 74.69 10051 56 190.0156 39.33 69.53 97.1903李宇伟,等:百里香酚微囊的制备与评价2.2.3 壁材浓度对百里香酚微囊的影响芯壁比为 15、壁材比为 1139,壁材浓度分别为 0.0125 g/mL、0.0139 g/mL、0.0156 g/mL、0.0179 g/mL、0.0208 g/mL 进行试验,结果如表 4所示,最佳壁材浓度为 0.0208 g/mL。表 4 壁材浓度对百里香酚微囊的影响 序号ABC/(g/mL)包封率/%收率/%综合评价11 511 390.0125 33.23 74.33 96.1721 511 390.0139 33.30 78.67 98.2231 511 390.0156 33.28 79.67 98.7541 511 390.0179 33.36 81.67 99.9251 511 390.0208 33.41 81.53 99.952.3 百里香酚微囊的正交试验结果因素 A 是芯壁比(A1:1 5,A2:9 50,A3:4 25,)、因素 B 是壁材比(B1:1 4,B2:11 39,B3:6 19)、因素 C 是壁材浓度(C1:0.0208 g/mL,C2:0.0179 g/mL,C3:0.0156 g/mL),以综合评价为指标可得出各个因素下的 k 值大小,表 5 的试验结果表明,因素 A 的最大 k 值是 k1(98.47)、因素 B 的最大 k 值是 k2(99.36)、因素 C 的最大 k 值是 k1(98.68),通过极差可知,对微囊的综合评价影响最大的是因素 B,影响最小的是因素 C。方差分析结果如表 6 所示,因素 A 的 P 值是 0.057954、因素 B的 P 值是 0.059238、因素 C 的 P 值是 0.102978,因素 A 和因素 B 的 P 值都大于 0.05 且小于 0.1,故百里香酚的投药量、百里香酚与阿拉伯胶和壳聚糖的投药比对百里香酚微囊的包封率有一定的影响,但是壁材的浓度对百里香酚微囊的包封率无影响。通过正交试验和方差分析综合考虑,认为制备百里香酚微囊的最佳条件为芯壁比 15、壁材比 11 39、壁材浓度 0.0208 g/mL。表 5 百里香酚微囊制备的正交试验结果试验号ABCD 空列误差包封率/%收率/%综合评价1111133.41 73.29 99.802122233.35 73.63 99.903133333.24 66.18 95.704212333.26 68.32 96.895223133.08 72.82 99.066231233.38 68.39 97.117313233.10 58.32 91.218321333.32 72.25 99.129332133.19 58.91 91.67K1295.40287.90296.03290.53K2293.06298.08288.46288.22K3282.00284.48285.97291.71k198.4798.6098.6896.84k297.6999.3696.1596.07k39494.8395.3297.24R4.474.533.361.1613李宇伟,等:百里香酚微囊的制备与评价表 6 百里香酚微囊的方差分析方差来源偏差平方和自由度均方F 值P 值显著度A34.151217.07616.2550.057954P0.1B33.365216.68315.8810.059238P0.1D(误差)2.10121.050 2.4 百里香酚微囊的验证试验结果以最优工艺 A1B2C1为条件进行验证性试验,即平行制作三组样品,进行三次重复试验,对样品的产率、包埋率与综合评分进行统计。结果如表 7所示,最佳工艺参数为芯壁比 15,壁材比 1139,壁材浓度 0.0208 g/mL,搅拌速度 450 r/min,温度40,50%戊二醛 1 mL。表 7 百里香酚微囊的验证试验结果因素序号包封率收率综合评价A1B2C2133.45%73.64%99.06233.98%73.61%99.98333.52%73.32%99.01平均值33.72%73.61%99.352.5 百里香酚微囊的质量评价2.5.1 百里香酚微囊的溶出度评价如表 8 结果所示,百里香酚、百里香酚微囊、芯材和壁材混合物的累积溶出度随着时间的延长而增加,但百里香酚、芯材和壁材混合物的累积溶出度都高于百里香酚微囊。因此,百里香酚微囊可以有效减小百里香酚的溶出、减缓释药速度、延长药效时间。表 8 百里香酚的溶出度测定结果时间/min百里香酚微囊 1 的累积溶出度/%百里香酚微囊 2 的累积溶出度/%百里香酚的累积溶出度/%芯材和壁材混合物的累积溶出度/%0000056.876.546.277.34109.407.009.918.331510.688.4013.0912.602011.598.9015.5212.883013.2210.0119.8413.184514.3211.1725.6914.796015.2512.7231.5819.449016.5414.7437.8329.78113517.6716.2143.5440.602.5.2 百里香酚微囊的形态分布评价将百里香酚微囊与阿拉伯胶、壳聚糖、芯材和壁材混合物、百里香酚进行形态对比(图 3-图 8),可发现并确定有新的物质生成。如图 8 所示,可观察到百里香酚微囊的表面光滑、呈球状。23李宇伟,等:百里香酚微囊的制备与评价图 3 壳聚糖的显微镜观察结果图 4 阿拉伯胶的显微镜观察结果图 5 百里香酚的显微镜观察结果图 6 芯材和壁材混合物的显微镜观察结果图 7 百里香酚微囊样品 1 的显微镜观察结果图 8 百里香酚微囊样品 2 的显微镜观察结果33李宇伟,等:百里香酚微囊的制备与评价3 结论 本试验以包封率和收率为评价指标,通过百里香酚的特殊微囊包被处理技术,以阿拉伯胶和壳聚糖为壁材、50%戊二醛为固化剂,在 40、450 r/min 的条件下采用单因素试验与正交试验相结合的方法,筛选出百里香酚微囊最佳的制备工艺为百里香酚与壁材比 15、壳聚糖与阿拉伯胶比 1139、壁材浓度 0.0208 g/mL。显微镜下观察可见,百里香酚被成功包被,即形成百里香酚微囊。溶出度实验表明,将药物微囊化可以减缓药物的释放速度、延长药效时间。本试验数据对于植物精油微囊制剂应用于畜禽疾病防控领域具有重要的现实意义。参考文献:1 赵楠楠.偃松松塔精油抑菌机理的研究及其微囊制备D.哈尔滨市:东北林业大学,2019:5-7.2 赵天成,刘钊,臧晓,等.百里香酚对冬毛期蓝狐生产性能与生化指标的影响J.饲料工业,2022,43(09):60-64.3 胡心怡,胡郁汉,潘振辉,等.百里香酚和肉桂醛联用对沙门氏菌的协同抑菌效应及其应用J.现代食品科技,2021,37(12):112-119.4 陈静.百里香酚、香芹酚和肉桂醛对鸡肉中沙门氏菌及其生物膜的抑制作用研究D.合肥:合肥工业大学,2021:20-80.5 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