植物RNA聚合酶V的染色质滞留机制_杜璇.pdf

植物RNA聚合酶V的染色质滞留机制杜璇1,杜嘉木2*1.深圳大学医学部,深圳 518060;2.南方科技大学生命科学学院,深圳 518055*联系人,E-mail:Mechanistic insight into the chromatin retention of plant RNApolymerase VXuan Du1&Jiamu Du2*1Shenzhen University Medical School,Shenzhen 518060,China;2School of Life Sciences,Southern University of Science and Technology,Shenzhen 518055,China*Corresponding author,E-mail:doi:10.1360/TB-2023-0269生命体遗传信息从DNA到RNA的传递需要由一类多亚基的RNA聚合酶来完成.在真核生物中,有3种保守的RNA聚合酶,即Pol I(RNA Polymerase I,RNA聚合酶I)、Pol II和PolIII,分别负责核糖体RNA、信使RNA以及转运RNA的合成1.近年来,人们在植物中发现了另外两种植物特有的RNA聚合酶,Pol IV和Pol V,丰富并扩展了人们对RNA聚合酶的认知2,3.Pol IV和Pol V均由Pol II进化而来,共同作为核心组分参与了植物RdRM(RNA-directed DNA methylation,RNA指导的DNA甲基化)通路介导DNA甲基化的发生:在通路上游,Pol IV起始转录产生的单链RNA被RDR2转化为双链,再被DCL3切割成为24-nt的siRNA加载到AGO4上形成复合物3,4;在下游,Pol V与其转录生成的lncRNA(long noncoding RNA,长非编码RNA)共同作为支架与AGO4-siRNA复合物相互作用,进一步招募DRM2介导DNA的甲基化5,6.因此,Pol V在常规地转录生成产物RNA之外,更需要滞留在染色质上起到定位的作用,其动态转录的生化功能与染色质滞留的生理功能之间形成了鲜明的对比.过去几十年,人们已经陆续对酵母和哺乳动物中不同的RNA聚合酶成员在结构和功能方面进行了系统深入的研究7.但是由于Pol IV和Pol V在植物体内的含量较低,对两者的研究,尤其是结构解析的工作一直以来都进展缓慢.近年来,随着Pol IV的结构被报道8,Pol V作为真核RNA聚合酶家族最后一个成员,对其结构与功能的研究仍然是领域内极具挑战的重要工作.近期,我们解析了植物Pol V的高分辨率结构,并结合体外生化实验,阐明了Pol V的染色质滞留机制,相关工作发表于Science9.为了得到Pol V样品,我们首先筛选并获取了与Pol V大亚基NRPE1高亲和力结合的单克隆抗体,通过抗体富集并纯化了花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)花序中的Pol V,最终利用冷冻电子显微镜技术解析了Pol V及其转录延伸复合物(Pol V-EC)的结构(图1(a).整体上,Pol V呈现出典型的RNA聚合酶家族的复合物构象.与家族中其他成员相比,PolV在亚基组成以及关键元件上都表现出了显著区别.首先,Pol V缺失了经典Pol II相关转录因子的结合区域;NRPE9亚基的位置和构象与在Pol II中明显不同;此外,Pol V的TriggerLoop相对于Pol II来讲更加紧凑而缺乏摆动性,可能是Pol V较低转录活性的因素之一.尽管Pol V是由Pol II进化而来,但是它的转录活性相对减弱,而保真性则显著增强,其分子机制仍然不清楚.在Pol V转录延伸复合物结构中,非模板链DNA被Pol V NRPE2亚基的Lobe和Fork结构域紧紧抓住(图1(b).其中Fork结构域的Tyr495伸入到双链DNA下游的分叉处,并与即将打开的碱基对形成疏水的堆积作用,同时与模板链的磷酸基团形成氢键(图1(c),增强了Pol V对转录泡的稳定作用.体外转录实验表明,Pol V相对于Pol II的转录活性明显降低,并在双链DNA下游分叉处有显著的转录停顿现象.转录停顿现象是RNA聚合酶在转录中引起回溯(backtracking)从而引发RNA产物3-5切割进行校对(proof-reading)的关键步骤.相应地,我们在Pol V的体外转录实验中观测到高强度3-5切割现象,提示了Pol V具有更强保真性的机制.除此之外,我们进一步证明NRPE2与非模板链之 2023中国科学杂志社2023 年第 68 卷第 14 期:1723 1724悦读科学间的相互作用是导致转录回溯增强的主要原因.有意思的是,NRPE2亚基只在Pol IV和Pol V中共享,与Pol V通过减弱延伸和提升回溯来增强其染色质滞留以作为支架招募下游因子类似,Pol IV产生的单链RNA需要通过源源不断的转录回溯来传递给RDR28,9.因此,我们推测这种由NRPE2导致的转录回溯是Pol IV/V在RdDM通路中为合成ncRNA进化出的新机制.总体来讲,本项研究揭示了Pol V通过其NRPE2亚基引起转录停顿和转录回溯增强的分子机制,这样的性质使其能够在前进和后退之间取得平衡,从而建立了Pol V在RdDM通路中通过滞留在染色质上作为支架蛋白对下游作用因子进行招募,从而引起基因沉默的工作模型.本项工作同时也对揭示NRPE2在Pol IV中的关键作用起到了一定的提示作用.致谢感谢深圳市科技创新委员会(RCJC20221008092720004)资助.推荐阅读文献1Haag J R,Pikaard C S.Multisubunit RNA polymerases IVand V:Purveyors of non-coding RNA for plant gene silencing.Nat Rev Mol Cell Biol,2011,12:4834922Herr A J,Jensen M B,Dalmay T,et al.RNA polymerase IV directs silencing of endogenous DNA.Science,2005,308:1181203Matzke M A,Mosher R A.RNA-directed DNA methylation:an epigenetic pathway of increasing complexity.Nat Rev Genet,2014,15:3944084Onodera Y,Haag J R,Ream T,et al.Plant nuclear RNA polymerase IV mediates siRNA and DNA methylation-dependent heterochromatinformation.Cell,2005,120:6136225Wierzbicki AT,Ream T S,Haag J R,et al.RNA polymerase V transcription guides ARGONAUTE4 to chromatin.Nat Genet,2009,41:6306346Zhong X,Du J,Hale C J,et al.Molecular mechanism of action of plant DRM de novo DNA methyltransferases.Cell,2014,157:105010607Girbig M,Misiaszek A D,Mller C W.Structural insights into nuclear transcription by eukaryotic DNA-dependent RNA polymerases.Nat RevMol Cell Biol,2022,23:6036228Huang K,Wu X X,Fang C L,et al.Pol IVand RDR2:A two-RNA-polymerase machine that produces double-stranded RNA.Science,2021,374:157915869Xie G,Du X,Hu H,et al.Structure and mechanism of the plant RNA polymerase V.Science,2023,379:12091213图 1(网络版彩色)植物Pol V-EC复合物及细节图9.(a)植物Pol V-EC的高分辨率冷冻电子显微镜结构.(b)非模板链DNA与NRPE2的互作图.(c)Tyr495与DNA双链的相互作用示意图Figure 1(Color online)The structure of Pol V-EC complex9.(a)The high resolution cryo-EM structure of the plant Pol V-EC complex.(b)Theinteractions between the non-template DNA strand and Pol V NRPE2.(c)Tyr495 specifically interacts with the dsDNA branching site2023 年 5 月第 68 卷第 14 期1724