《园艺基础实验Ⅱ》教案12园艺.doc

园艺基础实验课程教案（12园艺，2013.9.11胡志辉）课程编号：1202118课程英文名称：horticultural base experiment 学时学分：48学时1.5学分开课学期（春、秋、全年）：全年先修课程：植物生理学、生物化学、遗传学适用专业：园艺专业（本科）一、课程简介园艺基础实验是园艺专业学生必修的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合植物生理生化和遗传学的教学而开设的一门实验课程,本课程由验证性、操作性、综合性和设计性等多层次实验内容构成。课程主要内容包括：植物组织水势的测定，不良环境对植物生理生化的影响，植物呼吸速率的测定，抗坏血酸含量的测定，植物种子蛋白质组分的分析，高等植物DNA的提纯与检测，植物多倍体的诱导与鉴定，植物染色体组型分析。通过本课程的实验教学，使学生掌握植物细胞遗传学和植物生理生化研究的基本方法、基本技能，培养其独立工作和创新能力，为今后学习和工作打下良好的基础。二、教学目的本课程由验证性、操作性、综合性和设计性等多层次实验内容构成，目的在于巩固和加深学生对植物生理生化和遗传学知识的理解，验证植物生理生化和遗传学理论，并初步掌握植物生理生化和遗传学研究所必需的基本实验技术。在此基础上，进行一定比例的综合性、设计性实验，将实验理论和实验技能融为一体，从而培养学生的基本实验思想、实验方法、实验技能和综合应用能力。本课程的任务是从个体、细胞、分子三个水平揭示植物生理生化和遗传学的基本现象与规律，培养学生牢固掌握植物生理生化和经典遗传学研究方法与技术，并初步掌握现代植物生理生化和遗传学实验分析方法，同时要求学生初步具备进行植物生理生化和遗传学创新性研究的基本能力与素质。三、教学要求本课程应在植物学实验、无机及分析化学实验、有机化学实验等课程之后开设的课程。本实验课内容包括验证性实验、操作性实验、综合性实验、自行设计性实验四个部分，验证性实验主要通过演示方法进行教学，操作性和综合性实验在教师指导下由学生自己动手完成，同时要求学生根据所掌握的理论基础和实验技能，设计性实验经教师认可后独立完成实验操作，并撰写书面报告。 1、注意理论与实践结合，增加联系生产实际的内容。 2、关注植物生命科学的发展前沿，将植物生命科学实验先进手段纳入教学内容。 3、通过对学生植物生理生化及遗传等生命活动的基本实验技能的训练，加强对学生动手能力的培养，同时力求理论联系实际地培养学生独立思考、综合分析能力、科学思维能力、创新意识，全面提高学生素质。四、教学重点与难点教学重点：植物组织中可溶性蛋白质含量的测定，植物多倍体的诱导与鉴定。教学难点：植物种子蛋白质组分的分析和植物染色体组型分析。五、教学内容（含教学时间分配表）： 教 学 时 间 分 配 表章节 内 容学时备注1实验1.小液流法测定植物组织水势4操作性实验2实验2. 不良环境对植物生理生化的影响8设计性实验3实验3. 植物呼吸速率的测定4操作性实验4实验4. 抗坏血酸含量的测定4操作性实验5实验5. 植物种子蛋白质组分的分析 16综合性实验6实验6. 植物多倍体的诱导与鉴定8综合性实验7实验7.植物染色体组型分析4验证性实验总学时48教学 48学时 辅导 学时 机动 学时共48学时 六、考核内容及办法1.平时成绩：包括考勤、作业、课堂提问等，占综合考核成绩10% 2.实验成绩：包括实验操作、实验报告和自行设计实验，占综合考核成绩30%3.考试成绩：期末闭卷笔试，占综合考核成绩60%4.综合考核成绩：100%七、教材与主要参考书 （一）、教材 生命科学基础实验教程，江汉大学生命科学实验中心编，江汉大学教材科印 （二）、参考书 植物生理生化实验原理和技术，李合生主编，高等教育出版社遗传学实验教程，王建波等编，武汉大学出版社实验记录及实验报告要求一、 实验记录实验前应认真预习，把实验名称、目的要求、原理、实验内容、操作方法以及实验和数据的记录表格简要地列于记录本中。实验记录本应标上页数，不能随意撕去任何一页，不要擦抹及修改。写错时可准确地划去重写。实验中观察到的现象、数据，应及时并正确地记录于记录本上，切忌夹杂任何主观因素。定量的数据，如称量物的重量、滴定管读数和分光光度计读数等，应根据仪器的精确度准确记录有效数字。每一结果最少要重复观测两次，重复观测数据即使完全相同也应如实记录下来，因为每个数据都是一次观测的结果。数据的计算也应写在记录本上。总之，实验结果的原始积累记录应做到准确、清楚、详尽、简练。实验中使用的仪器型号和试剂的规格、化学式、分子量、准确浓度都应记录清楚，以便总结实验时核对和作为查找失败原因的参考依据。如果认为记录的结果可疑或发现记录遗漏和丢失，应重做实验，决不能把不可靠的结果当作正确记录，造成实际工作中难以估计的损失。二 、实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验的结果，写出实验报告，一般实验报告内容包括：（1） 实验名称（题目）（2） 原理（3） 试剂和仪器（4） 操作方法（5） 实验结果（6） 分析讨论（7） 参考文献一份实验报告就相当于一篇小论文。在报告中，应写清楚实验名称，做实验的目的和实验设计的基本原理：操作方法可采用工艺流程图的方式或自行设计表格来扼要明了表示；试剂名称、纯度和配制要求以及仪器和仪器装置图应写清楚或附上；结果应根据实验条件下观察到的现象和获得的数据进行归纳、整理，总结成各种图表，同时针对图表的结果进行必要的说明和分析；分析讨论可包括对实验方法和实验结果的探讨及疑难问题的分析，对实验设计的认识、体会和建议，以及对实验的改进意见等。当然，不同实验的实验报告的侧重点应有所不同。制备实验应重点集中于制备方法、装置的设计和讨论；定量实验较着重与对结果和数据的总结和分析；定性实验往往内容较多，可根据实验内容分别写原理、方法、结果和讨论。实验报告并非要求定式，但应该让人们清楚了解实验的设计、目的和意义。希望学生们课前做好预习工作，课上多动脑筋、动手，课后写好实验报告，你们本学期的实验成绩是预习情况、平时课堂表现、实验报告的综合评分。真诚地希望通过一个学期实验课的学习与训练，能够提高大家的而是眼操作技能，并培养你们严谨求实、积极进取的科学态度及优秀品格。实验1 小液流法测定植物组织水势（操作性实验，4学时）一、实验目的 测定植物组织水势的方法教多，小液流法是其中一种。本法是将植物组织置于不同浓度（也即不同水势）的蔗糖溶液中，寻找到一种浓度的蔗糖溶，其水势与植物组织的水势相等，然后计算该浓度蔗糖溶液的水势，从而知道植物组织的水势。植物组织和外界溶液组成的体系处在恒温恒压下，整个体系的水势由植物组织的水势和溶液的渗透势组成，它们之间的水势差为： sw （） s是溶液的渗透势，w是植物组织的水势（water potential）。如果两部分达到平衡，则 ws （）即植物组织的水势等于溶液的渗透势。溶液的渗透势依据范特荷夫公式计算： siCRT（MPa） （）其中是范特荷夫系数或等渗系数、解离常数（蔗糖=1，CaCl2=2.60），是溶液的摩尔浓度（mol/Kg），是理想气体常数（即0.008314LMPa/（molK），是绝对温度，K，即273+t（测定时摄氏温度），s为渗透势，单位为MPa（1大气压=1.013105Pa）。如何知道那一浓度蔗糖溶液的水势相等呢？我们知道，水势的高低决定了水分的流动方向。若将植物细胞浸于蔗糖溶液中，当植物细胞的水势大于外界蔗糖溶液的水势时，细胞失水，外界溶液相对密度变小；当植物细胞的水势小于外界蔗糖溶液的水势时，细胞吸水，外界溶液的相对密度变大；只有当植物细胞的水势与外界蔗糖溶液的水势相等时，植物细胞将既不吸水又不失水（实际情况应是吸水和失水达到动态平衡），而蔗糖溶液的相对密度将不发生变化。因此，测定外界蔗糖溶液的相对密度变化就可确定那一浓度的蔗糖溶液的水势与植物细胞的水势相等。测定蔗糖溶液相度密度的变化，可采用如下简便的方法：即利用毛细管吸取已浸过植物组织的蔗糖溶液（为便于观察，可用甲烯蓝先染上颜色），放一小滴到与其对应的相同浓度的蔗糖溶液中，然后观察滴出的小液滴（蓝色）的移动方向，即可知道浸过植物细胞的蔗糖溶液相对密度的变化（“小液流法”即由此而来）。若小液滴向上移动，这表示浸过植物组织的蔗糖溶液的相对密度变小；相反，向下移动，这表示相对密度变大；若静止不动，这表示相对密度未变化，说明该浓度蔗糖溶液的水势与植物组织的水势相等。二、实验材料 马铃薯块，小白菜或其他植物的叶片。三、实验用品1、仪器设备试管架，5ml带塞试管8支、10ml带塞试管8支、毛细管8支移液管（1 0 l）8 支，吸球1个，带有橡皮管的注射针头（或毛细管）8支 打孔器（内径1cm ） 1 只 解剖针1 支，小镊子1 把， 2、药剂（1）配制1mol/Kg蔗糖溶液（称取预先在6080下烘干的蔗糖34.23g,溶于100g蒸馏水中，即为1质量摩尔浓度的蔗糖溶液），然后稀释成一系列浓度递增的蔗糖溶液（0.1mol/Kg，0.2mol/Kg，0.3mol/Kg，0.4mol/Kg，0.5mol/Kg，0.6mol/Kg，0.7mol/Kg，0.8mol/Kg）。（2）甲烯蓝粉末。四、实验内容小液流法测定马铃薯块茎的水势。五、实验步骤取8支10ml的带塞试管，顺序编上号，依次分别加入5ml浓度递增的蔗糖溶液，盖上塞子，顺序放在试管架上，作为观察组。所用试管一定要干燥。2另取8支10ml的带塞试管对应于观察组各管编号， 并加入对应于观察组的浓度递增蔗糖溶液5ml，盖上塞子，顺序放在试管架上作为试验组。打孔器将马铃薯块茎打取长条（41cm），用蒸馏水迅速冲洗，然后用滤纸吸干表面水分。将马铃薯块茎长条分别放入试验组各管，盖上塞子，经过一定时间（约在30分钟以上），分别用解剖针取出马铃薯块茎条，再用解剖针尖沾少许次甲基蓝粉末（不可加多）放入溶液，轻微摇动，使次甲基蓝溶解，溶液呈浅蓝色即可。 或2用移液管从10ml试管中，取出不同浓度的蔗糖溶液1ml，分别装入相对应的5ml试管中，立即加塞。移液管与浓度一一对应。取生长状态一致的植物叶片数片（擦干表面水分），在叶片的相同部位（应避免叶脉）用打孔器打取小圆片，用镊子向5ml试管中各投入10片，使溶液浸没小圆片，加色放置约30min，其间经常摇动小试管，并保持小圆片浸没于溶液中。打取小圆片及投入试管中时，动作应尽量快速。用注射针头分别吸取试验组各管的蓝色溶液放入对照组同样浓度溶液的中部，轻轻放出一滴蓝液，轻轻取出针头，观察蓝色液滴移动的方向，是向上，向下还是不动（每次测定均要用待测浓度的甲烯蓝蔗糖溶液清洗几次注射针头）。如此方法检查各管中液滴的升降动向。若液滴上升，说明浸过小圆片的蔗糖溶液浓度变小（即植物组织失水），表明叶片组织的水势高于该浓度溶液的渗透势；若蓝色液滴下降，这说明叶片组织的水势低于该浓度溶液的渗透势；若蓝色液滴静止不动，则说明叶片组织的水势等于该浓度溶液的渗透势；如果在前一浓度溶液中下降，而在后一浓度溶液中上升，则叶片组织的水势即为二种浓度溶液的渗透势的平均值。将蓝色小液滴移动方向填入下表中。按i1.0计算溶液的渗透势和马铃薯块茎的水势。表1 小液流法现象观察记载表蔗糖浓度（mol/L）0.10.20.30.40.50.60.70.8小液流移动方向 7记录实验时的温度。六、综合分析1用小液流法测定植物组织水势时，如何根据小液流的方向判断水势？原理是什么？2用注射针头将试验组的蓝色液滴放入观察组时，为什么要轻轻放出一滴蓝液，然后又轻轻取出注射针头？实验2 不良环境对植物生理生化的影响（设计性实验，8学时）一、实验目的1掌握温度和水分逆境与植物生理生化变化的基本原理 2学会基质栽培植物的常规管理方法 4掌握温度和水分逆境的处理方法 5掌握逆境处理后相关生理生化指标的测定方法二、基本要求1每2位学生一组，分工明确，互相协作 2每组实验材料由学生确定 3每组学生必须完成1种植物的基质栽培、2种逆境处理并测定2项生理生化指标 4正式实验前一周，每组交实验可行性报告一份，经指导教师审阅批准后，方可开始实验。可行性报告必须包括以下内容。 （1）实验原理 （2）确定的实验材料：包括植物材料，所需仪器、药品等。 （3）实验步骤 （4）实验预期结果 5本次实验要求在6周内完成。实验完成后，每位学生必须交实验报告一份。实验报告的基本格式如下： （1）实验题目：组员姓名，班级，指导教师姓名 （2）实验原理 （3）材料与方法 （4）实验结果与分析 （5）讨论 （6）参考文献三、实验学时 8学时四、实验内容(一) 温度逆境对植物的影响（1）取植物材料，用蒸馏水漂洗，分三组，每组1g，分别装入三角烧瓶中。第一组放在45温箱中，第二组放在冰箱中，第三组放在室温条件下。（2）一小时后，取出三组三角烧瓶，用电导率仪测量每一组三角烧瓶中溶液的电导度。（实验指导书实验28）（3）用蒽酮试剂测定可溶性糖渗出量。（实验指导书实验22）(二) 水分逆境对植物的影响（1）绘制脯氨酸标准曲线。配0、5.0、10、15、20、25、30ug/ml的脯氨酸梯度溶液各2ml，分别加冰醋酸2ml，茚三酮试剂2ml加入试管中，用橡皮塞塞紧，于沸水浴中15分钟，515nm下比色。（2）植株样品液的提取，分别提取不同水分条件下的植株样品中的脯氨酸。（3）游离脯氨酸含量的测定。（实验指导书实验28）（4）过氧化物酶活性和过氧化氢酶活性的测定。（实验指导书实验24、实验25）五、综合分析 1、比较不同条件对植物伤害状况。2、比较不同水分条件下植物体内脯氨酸含量和酶活性的变化。 3、简述蒽酮比色法进行植物组织中可溶性糖含量测定的实验原理。 4、如何用蒽酮比色法测定植物组织中的可溶性糖含量？5、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？6、过氧化物酶与哪些生化过程有关？7、如何用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶的活性？实验28 植物抗寒性的鉴定在低于生长适宜温度以下生长时，作物往往要遭受一定程度的危害。一般0以上低温对作物所造成的危害叫冷害（chilling injury)；冰点以下的低温引起的伤害叫冻害（freezing injury）。在低温的影响下，植物体内会发生光合作用减弱，呼吸代谢失调，细胞膜劝吸收能力下降，物质代谢失调等现象。通过对植物在低温下各种反应的研究，可以探明在低温不良环境下的受伤程度及生长发育规律，并加以人工调控，对农业高产具有稳定意义。如上所述，植物在低温下有许多不正常的表现，相应地也有很多对植物低温下受到伤害的测式方法，但最常见和较为简单的方法有植物细胞差别透性的测定和逆境下游离脯氨酸含量的测定两种方法。第一部分、植物细胞差别透性的测定 一、目的和要求控制物质出人细胞的性质就是细胞的差别透性，细胞差别透性主要取决于质膜的结构与功能。质膜不仅是分隔细胞质与胞外物质的屏障，而且是细胞与环境进行物质交换的主要通道，还是细胞感受环境胁迫最敏感的部位。各种逆境，如高温、低温、干旱、水涝、盐渍和大气污染（O3、SO2）等的伤害，往往首先作用于质膜上，造成质膜差别透性的改变与丧失，致使细胞内的物质（尤其是电解质）大量外渗，导致组织浸泡液的电导率增大。膜结构破坏的程度与低温的严重程度、待续的时间及作物品种的抗寒性等因素有关。通过测定外渗液电导率的变化即可反映出质膜受害程度和植物抗性的强弱。因此，测定植物细胞的差别透性对于研究植物的抗性具有重要意义。本测定采用电导仪法，其原理是：小分子或生物大分子的电解质水溶液均可导电，并服从欧姆定律，即在溶液中两电极外加V伏电压，流过的电流为A安培，则两极内的电阻为R欧姆（R=V/A）。若溶液的电阻大，电导能力就小，因此把溶液电阻的倒数定为溶液的电导，以S表示（S=1/R=A/V）。由此可见，测量电解质溶液的电导实际上是测其电阻。对电解质溶液而言，取面积1 cm2的两片电极，相距1 cm，中间的1 cm3溶液所表现出来的电导称该溶液的比电导，也叫电导率，用K表示（即K=QS），其单位为S/ cm，但实际应用时多采用uS/cm；式中的Q为电极常数，由厂家测定后标在电极上，使用时应加以注意，当不知道其值时可参照电导率仪使用说明书的附录进行测定。二、材料和用具1材料玉米、小麦、水稻、大豆或其他植物的叶片。2仪器电导仪、分析天平、真空泵、真空干燥器、恒温水浴、水浴锅、温箱、冰箱、振荡器、负压表，洗瓶、打孔器、剪刀、定距切割器、烧杯、具盖白瓷板、具塞三角瓶。3试剂洗液、去污粉、去离子水。三、实验内容1用具清洗由于电导变化极为敏感，因此所用玻璃器具必须干净，先用去污粉（或洗液）洗涤，再用自来去离子水冲洗，然后倒置于垫有滤纸的干净瓷盘中，用纱布盖好。2材料准备根据测定需要量，剪取相同叶龄，相同叶位、长势一致的叶片（或其他器官），用湿纱布包好带回室内。试材先用自来水再用去离子水冲洗，后用滤纸吸干外附水分，置于垫有湿润滤纸的瓷盘内。接着，将窄叶（小麦、水稻）剪成1 cm切段，将阔叶（大豆、向日葵）打成直径为0. 5-1.0cm叶圆片，并用去离子水冲洗（除去伤口外流物质）和吸干外附水分；而小叶（三叶草）即用完整侧叶，立即称重备用。 3电解质浸提 准确称取上述材料0. 1-1. 0 g装人具塞三角瓶或烧杯中，加去离子水10-30 mL，为使叶片完全浸人水中，可用真空泵抽气10-30 min，于室温下浸泡4-5 h, 4.电导率测定 先将各管浸泡液上下搅拌或摇匀，然后再测电导率值。为了测定相对外渗电导率值，需将测过电导率的各管（浸泡液及材料）于沸水中煮沸1020 min，冷却至室温后再测一次总电导率值。 5结果计算、电解质外渗率有三种表示方法： K1K2 (1) 外渗电导率值 直接用电导率值表示，按照公式M=计算。 WV 式中：M一电解质外渗率，) uS/(cm。g。mL) ; K1一样品浸提液电导率值，uS/ cm; W一样品质量，g; K2一去离子水电导率值，uS/cm; V一样品浸提液体积，Ml。 (2)电解质相对渗出率为消除测定中的各种误差，并便于比较，可采用相对值表示： 浸泡液电导率值 电解质渗透= 100% 煮沸后电导率值 . 处理电导率值一本底电导率值 电解质相对渗出率= 100 % 对照电导率值一本底电导率值 处理电导率值一对照电导率值 伤害率 处理煮沸后电导率值对照电导率值 (3)电解质绝对渗出量按照公式M=AV/W 式中：M电解质渗出量，mg/g A一以样品电导率值与本底电导率值之差在标准曲线查得电解质，u.g/mL; W一样品质量，g； V一样品浸提液体积，mL, 标准曲线绘制方法：配制0. 01-10 mmol/L KCl(A. R）溶液，于25下测其电导率值，以电导率（uS/ cm）为纵坐标，以浓度（mg/mL）为横坐标，绘出一条标准曲线。四、注意事项 由于溶液的电导率受温度影响较大（据测定，温度每升高1电导约增加2%)。为此，可照公式XZ5 =Mt 1+0. 02(t-25)进行校正，式中：X25一校正至25时的电导率值； t一测定时溶液温度；Mt一于t下实测的电导率值；0.02-溶液升温I电导率增值。五、思考题1计算不同处理的植物样品的相对电导率。2分析温度对作物细胞膜结构的伤害作用，温度与细胞电解质相对外渗率的关系。3以电导或相对电导率作为抗寒性的指标，哪个更好些？为什么？第二部分、逆境下游离脯氨酸含量的测定 在正常条件下，植物体内游离脯氨酸的含量并不高200-700 ug/g(干重）约占游离氨基酸总量的百分之几。但当植物处于低温、高温、干旱、盐渍、大气污染等逆境下时组织内的游离脯氨的分子结构及理化性质，能够保护酶的空间结构、稳定膜系统，参与叶绿素合成，消除NH3的毒害，因而提高了植物的抗性。因此，测定植物体内游离氨基酸的含量，在一定程度上可了解植物受环境胁迫的情况，了解植物对低温等胁迫的忍耐和抵抗能力，在生产上和育种学上都有一定的意义。 一、原理 游离氨基酸与茚三酮共热时，能定量地生成二酮茚一二酮茚胺。该产物显示蓝紫色，称为Ruhemans紫。其吸收峰在570 nm，而且在一定范围内吸光度与游离氨基酸浓度成正比，因此可用分光光度法测定其含量。氨基酸与苟三酮的反应分两步进行，第一步：氨基酸被氧化形成CO2 ,NH3和醛，茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步：所形成的还原型茚三酮与另一分子茚三酮和一分子氨进行缩合脱水，生成二酮茚一二酮茚胺。反应式如下： 该反应有以下特点：1由于该反应的第一步是茚三酮的还原，而还原型茚三酮在含氧量高的情况下很容易再氧化，对反应有干扰，因此，常在反应体系中加人还原剂，以阻止还原型茚三酮的再氧化。曾被使用的还原剂有氯化亚锡、抗坏血酸及氰酸盐等。前两者显色反应不稳定，抗坏血酸溶液在空气中易被氧化，必须现用现配，还可与茚三酮发生颜色反应而干扰测定结果。三种还原剂中，以氰酸盐最理想，不但显色稳定，而且还可将它事先加人缓冲液中，以防止缓冲液发霉变质，延长使用时间，故本实验采用氰酸盐作还原剂。2该反应需要脱水缩合，反应介质中水的多少不但对终点产物的浓度有很大影响，而且还会影响终点产物的稳定性。所以，反应完毕后应在反应体系中定量加人有机溶剂，以稳定反应产物。 3反应中有氨基酸分解产生的氨参与茚三酮的缩合，所以氨能强烈干扰该反应。实验时应保证测定用水和各种试剂不被氨所污染。 4由于蛋白质和多肽中的游离氨基酸也会产生同样反应，因此，对于含大量蛋白质和多肽的样品，应先用蛋白质沉淀剂将其除去。常用的蛋白质沉淀剂有10乙酸、磺基水杨酸(SSA)、三氯乙酸（TCA)、过氯酸（PCA）等，其中以乙酸提取总氨基酸的效果较好。故为本实验所采用。 5该反应体系在有机溶剂系统中稳定性良好，且最适pH为4.5，此条件下其吸光度十几小时内无明显变化。故本实验选择在乙醇一乙酸钠缓冲液（pH 5. 4)中进行。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 各种植物组织。（二）仪器设备 722型分光光度计；分析天平（感量0. 01 g) ;研钵；容量瓶；试管；水浴锅；三角瓶；漏斗。 （三）试剂 1水合茚三酮试剂称取0. 6 g再结晶的茚三酮置烧杯中，加人15 mL正丙醇，搅拌使其溶解。再加人30 mL正丁醇及60 mL乙二醇，最后加人pH 5.4的乙醇一乙酸钠缓冲液9 mL，混匀，贮于棕色瓶，置于4下保存备用，10 d内有效。 2乙醇一乙酸钠缓冲液（pH 5. 4)称取乙酸钠54. 4 g加人100 mL无氨蒸馏水，在电炉上加热至沸腾，使体积蒸发至60 mL左右。冷却后转人100 mL容量瓶中加30 mL冰醋酸，再用无氨蒸馏水稀释至100 mLo 3.氨基酸标准液称取80下烘干的亮氨酸46. 8 mg，溶于少量10异丙醇中，用10异丙醇定容至100 mL，即为1 mmol/L的标准氨基酸储备液，置冰箱中保存。取此液5 mL，用蒸馏水稀释至50 mL，即为含5 ug/mL氨基氮之标准液。 4.氰化钠储备液称取490 mg NaCN，溶于1L无氨蒸馏水中，浓度为0.01 mol/Lo 5. 10乙酸。 6乙酸一氰酸盐缓冲液取0. 01 mol/L的NaCN储备液20 mL，用乙醇一乙酸钠缓冲液稀释至1 L，该缓冲液中NaCN 0. 000 2 mol/L，可在室温下保存数月。三、实验步骤 （一）样品制备 取新鲜植物样品，洗涤、擦干并剪碎、混匀后，迅速称取0.51.0 g，于研钵中加人5 mL10乙酸，研磨匀浆后，用蒸馏水稀释至100 mL。混匀，并用干滤纸过滤到三角瓶中备用。 （二）制作标准曲线 取6支20 mL刻度试管，按表1操作。 加完试剂后混匀，盖上大小合适的玻璃球，置沸水中加热15 min，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动，使加热时形成的红色被空气逐渐氧化而褪去，进而呈现蓝紫色时，用60乙醇定容至20 mL。混匀后用1 cm光径比色皿在570波长下测定吸光度（以1号空白管为参比），以氨基酸微摩尔数为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，并求出其直线回归方程。 表1 制作游离氮基酸标准曲线各试剂量及操作程序试剂管号123456氨基酸标准溶液 /mL0.00.20.40.6无氨蒸馏水/mL2.01.81.61.4水合茚三酮/mL3.03.03.03.03.03.0乙酸一氰酸盐缓冲液/mL0.50.50.50.50.50.5每管游离氨基酸含量/g0.01.02.03.04.05.0（三）样品测定 吸收样品滤液l. 0 mL（其中氨基酸总量不应大于5. 0 mL，否则应稀释后测定），放入20 mL干燥试管中，再加入无氨蒸馏水l. 0 mL，接着加人0. 5 mL乙酸一氰酸盐缓冲液和3. 0 mL水合茚三酮，然后按标准曲线制作步骤显色、比色，根据样品吸光度在标准曲线上查得或用回归方程计算出样品滤液中的含氮量。 四、结果计算按下式计算样品中氨基态氮的含量： CVT 样品氨基态氮含量（ug/l00 g）= 100 VsW 式中：C为从标准曲线上查得的氨基态氮含量，ug; VT为样品总体积，mL; Vs为测定时取用的样品体积，mL; W为样品鲜质量，g。 五、注意事项 1. 茚三酮重结晶的方法合格的 茚三酮应该是微黄色结晶，若保管不当，颜色加深或变成微红色，必须重结晶后方可使用。其方法如下：5g 茚三酮溶于15 mL热蒸馏水中，加入0.25 g活性炭，轻轻摇动，溶液太稠时，可适量加水，30 min后用滤纸过滤，滤液置冰箱中过夜后即可见微黄色结晶析出，用干滤纸过滤，再用1 mL蒸馏水洗结晶一次，置于干燥器中干燥后贮于棕色瓶中。 2. 茚三酮与氨基酸反应所生成的二酮茚一二酮茚胺在1h内保持稳定，故稀释后尽快比色。 3空气中的氧干扰显色反应的第一步。因为NaCN为剧毒品，故一般在不太严格时以抗坏血酸为还原剂，虽也可提高反应的灵敏度，并使颜色稳定，但由于抗坏血酸也可与茚三酮反应，使溶液颜色过深，故应严格掌握加人抗坏血酸的量。 4反应温度影响显色稳定性，超过80，溶液易褪色；可在80水浴中加热，并适当延长反应时间，效果良好。 5谷物籽实等含蛋白质的样品可用酸水解法将蛋白质水解后，用本法测定水解液中的氨基酸含量，可计算出样品蛋白质含量。六 、思考题 1植物体内游离脯氨酸的测定有何意义？ 2根据样品测定的结果、稀释倍数和质量，计算各处理的每克植物鲜重及干重样品中游离脯氨酸的平均含量。3.根据你的实验结果，分析低温与植物体内游离脯氨酸积累的关系。实验24 愈创木酚法测定过氧化物酶活性 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 一、原理 在过氧化物酶(peroxidase）催化下，HZ O：将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470 nm有最大光吸收，故通过测470 nm下的吸光度变化就可以测定过氧化物酶的活性。二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料 马铃薯块茎。 （二）仪器设备 可见光分光光度计；离心机；研钵；容量瓶；量筒；试管；吸管。 （三）试剂 1. 0. 05 mol/L pH 5. 5磷酸缓冲液。 2. 0. 05 mol/L愈创木酚。 3. 2H2O2。 4. 20三氯乙酸。三、实验步骤（一）酶液的制备 取5. 0 g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放人研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3 000 rmp离心10 min，上清液转入25 mL容量瓶中。沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取2次，上清液并人容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。 （二）过氧化物酶活性测定 酶活性测定的反应体系包括：0. 05 mol/L磷酸缓冲液2.9 mL,2% H2O2 1.0 mL,0. 05 mol/L愈创木酚1. 0 mL和0. 1 mL酶液。用加热煮沸5 min的酶液为对照，反应体系加人酶液后，立即于37水浴中保温15 min，然后迅速转人冰浴中，并加入20三氯乙酸2. 0 mL终止反应，然后过滤（或5 000 r/min离心10 min)，适当稀释，470 nm波长下测定吸光度。四、结果计算以每分钟A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U), A470VT 过氧化物酶活性U/(g。min）= WVs0.01t式中：A470为反应时间内吸光度的变化；W为马铃薯鲜质量（g);t为反应时间（min) ; VT为提取酶液总体积（mL); Vs为测定时取用酶液体积（mL) 。 五、思考题 1简述测定过氧化物酶活性的生理意义。 2本测定方法有哪些需要改进的地方？ 实验25 过氧化氢酶活性测定 过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。 1 紫外吸收法 一、原理 H2O2：在240 nm下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度A240随反应时间而降低。根据测定吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 二、材料、仪器设备及试剂（一）材料 小麦叶片等。（二）仪器设备 研钵；离心机；250 mL容量瓶；移液管（0. 5 mL, 2 mL各2支）；10 mL试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计。（三）试剂 1. 0. 2 mol/L pH 7. 8磷酸缓冲液（内含1聚乙烯毗咯烷酮）。 2. 0. 02 mol/L H202（使用前用0. 1 mol/L高锰酸钾标准溶液标定）。 三、实验步骤（一）酶液提取取小麦叶片0. 5 g加人2-3 mL 4下预冷的pH 7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25 mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液至容量瓶中并定容至刻度。混合均匀后将容量瓶置5冰箱中静置10 min，取上部清液于4 000 r/min下离心15 min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5下保存备用。（二）酶活性测定 取10 mL试管3支，其中2支样品测定管，1支为对照空白管，按下表顺序加人试剂。 表1 紫外吸收法测定H202样品液配置表 将S。号管在沸水浴煮1 min以杀死酶液，冷却。然后将所有试管在25下预热后，逐管加人0.3 mL 0. 1 mol/L的H202，每加完一管立即计时，并迅速倒人石英比色皿中，在240 nm下测定吸光度，每间隔1 min读数1次，共测4 min，待3支管全部测定完后，计算酶活性。四、结果计算 以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活性单位（U) 。 A240VT 过氧化氢酶活性U/(g.min)= 0.1VstW （AS1+AS2）其中A240=AS0 2 式中：AS0为加人煮死酶液的对照管的吸光度；AS1 ,AS2为样品测定管的吸光度；V：为提取酶液总体积（mL) ; Vs为测定时所用酶液体积（mL);W为样品鲜质量（g) ;t为从加H2O2开始到最后一次读数的时间（min); 0. 1为A240下降01时的1个酶活性单位（U). 【注】所用H2O 2溶液及KMn04溶液临用前需重新标定。 注意事项 凡在240 nm下有强烈吸收的物质都