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1 6 5CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 5 月第 35 卷第 3 期液滴式数字PCR检测尿路上皮癌患者尿cfDNA中FGFR3基因S249C突变的临床应用价值祖丽胡马尔艾孜木阿吉1，赵焕2，马晟1，高苒3，王雅茹1，肖汀1，*(1国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，分子肿瘤学国家重点实验室，癌发生及预防分子机理北京市重点实验室，北京100021；2国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院，病理科，北京100021；3中国医学科学院医学实验动物研究所，北京100021)Clinical value in using dropletdigital PCR to detect urinarycfDNA FGFR3 S249C mutation inpatients with urothelial carcinomaZULIHUMAER Aizimuaji1,ZHAO Huan2,MA Sheng1,GAO Ran3,WANG Yaru1,XIAO Ting1,*(1.State Key Laboratory of Molecular Oncology,Beijing Key Laboratory forCarcinogenesis and Cancer Prevention,National Cancer Center/NationalClinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital,Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing 100021;2.Department of Pathology,National Cancer Center/National ClinicalResearch Center for Cancer/Cancer Hospital,Chinese Academy of MedicalSciences and Peking Union Medical College,Beijing 100021;3.Instituteof Laboratory Animal Sciences,Chinese Academy of Medical Sciencesand Peking Union Medical College,Beijing 100021,China)收稿日期：2023-03-12；修订日期：2023-04-28基金项目：中国癌症基金会北京希望马拉松专项基金(LC2020A31)作者信息：祖丽胡马尔艾孜木阿吉，E-mail：。*通信作者，肖汀，E-mail：【摘要】目的：通过非侵入性方式提取尿路上皮癌(UC)患者尿游离DNA(cfDNA)，使用液滴数字PCR(ddPCR)检测尿cfDNA中成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因S249C位点突变，辅助尿脱落细胞学检查提高UC的诊断效能。方法：收集27例UC患者尿液并提取尿cfDNA，采用ddPCR检测尿cfDNA中FGFR3S249C突变情况。应用受试者工作特征曲线(ROC)评价尿cfDNA中FGFR3S249C突变对于尿脱落细胞学诊断不明确UC患者的诊断效能。结果：UC患者尿cfDNA中FGFR3S249C突变的检出率为25.9%(7/27)。按尿液细胞学巴黎报告系统(TPS)分类，FGFR3S249C突变在高级别尿路上皮癌(HGUC)中检出率为18.8%(3/16)，可疑高级别尿路上皮癌(SHGUC)中为50%(4/8)，未见高级别尿路上皮癌(NHGUC)中为0(0/3)。FGFR3S249C在非浸润性UC中的突变率为25.0%(1/4)，在浸润性UC中为31.6%(6/19)。在尿脱落细胞学诊断为SHGUC的样本中使用ddPCR检测出的FGFR3S249C突变对于UC有50%(4/8)的检出率，且ROC曲线下面积为0.781，95%CI(0.407，1.000)，在UC诊断中起到良好的辅助作用。结论：使用ddPCR检测尿cfDNA中FGFR3S249C突变作为一种非侵入性的检测方式可以辅助提高尿脱落细胞学诊断不明确样本的诊断效能。【关键词】尿路上皮癌；尿游离DNA；液滴数字PCR；FGFR3S249C突变；尿脱落细胞学中图分类号：R730.4文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)03-0165-07doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.001【ABSTRCT】OBJECTIVE：Thepurposeofthisstudywastoimprovediagnosticefficacyofurothelialcarcinoma(UC)by using the droplet digital PCR(ddPCR)to detect FGFR3 S249C(fibroblast growth factorreceptor 3，FGFR3)mutation in cfDNAs which were extracted from urine of UC patients and in combinationwith urinary cytology.METHODS：Urine samples were collected from 27 UC patients and DNA samples wereextracted.TheFGFR3S249CmutationinurinarycfDNAwasdetectedbyddPCR.Receiveroperatingcharacteristic curves(ROC)were applied to evaluate the diagnostic efficacy of urinary cfDNA for patients withunclear urinary cytology but a clear pathological diagnosis of UC.RESULTS：The detection rate of the FGFR3S249C mutation for UC was 25.9%(7/27).The detection rate of the mutation classified by TPS(The Parissystem for reporting urinary cytology)was 18.8%(3/16)in HGUC(high-grade urothelial carcinoma)，50%(4/8)论著癌变畸变突变1 6 6CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 2023in SHGUC(suspicious for high-grade urothelial carcinoma)，and 0(0/3)in NHGUC(negative for high-gradeurothelial carcinoma).The mutation rate was 25.0%(1/4)in non-invasive UC and 31.6%(6/19)in invasive UC.The detection rate of positive mutation by ddPCR in SHGUC was 50.0%(4/8)，and the area under the ROCfor the diagnosis of UC by the mutation was 0.781 with 95%CI(0.407，1.000)，which showed good accuracyfor its diagnosis.CONCLUSION：Measurement of the FGFR3 S249C mutation in urinary cfDNA using ddPCRas a non-invasive assay could improve the diagnostic efficacy for UC with unclear urinary cytology diagnosis.【KEY WORDS】urothelial carcinoma；cfDNA；ddPCR；FGFR3S249C mutation；urine cytology尿路上皮癌(urothelial carcinoma，UC)是起源于尿路上皮的一种多源性恶性肿瘤，包括膀胱癌(bladdercancer，BC)和上尿路上皮癌(upper tract urothelialcarcinoma，UTUC)，是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一1-3。目前膀胱镜和尿脱落细胞学检查是监测UC的金标准。但膀胱镜的局限性在于对UTUC和原位癌难以活检，且有创不适合作为常规监测的方法4。尿脱落细胞学虽属于特异度高的无创检查，但因其灵敏度有限从而容易漏诊5-6。寻找可辅助尿脱落细胞学检查并提高UC检出率的非侵入性生物标志物是UC诊治的研究重点。随着“精准医学”概念的普及，液体活检作为无创诊疗是肿瘤精准医学的发展方向之一。在泌尿生殖系统恶性肿瘤中，由于尿液与肿瘤直接接触，使得尿游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)检测成为最常用的一种液体活检方法7。cfDNA的检测可以独立于细胞形态学，甚至早于细胞形态的改变检测出靶基因的突变状态。有研究表明接受过膀胱切除术的患者尿cfDNA中拷贝数水平预示着肿瘤复发的可能，而且在与循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)关联时其预测结果更为明显8。但由于尿cfDNA浓度低DNA含量较少，已有的传统基因检测手段如Sanger测序等无法精准检测DNA含量低的样本，所以另一种灵敏度更高的检测方法成为了检测尿cfDNA的重要手段。液滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年来发展起来的一种突破性定量的分析技术，这种高灵敏的技术已经证明了其在绝对定量、稀有事件检测、拷贝数变异、基因表达和定量miRNA等应用中的可靠性9。成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 受 体 3(fibroblast growthfactor receptor 3，FGFR3)基因被认为是膀胱癌患者尿液细胞中具有潜能的生物标志物10。位于FGFR3第7号外显子上的S249C位点是最常见的突变位点(TCCTGC)11，S249C 突变型受体中的半胱氨酸残基可以使突变型单体在胞外形成二硫键从而触发激酶的激活12，这会持续激活下游细胞的增殖途径并减少细胞凋亡13，有研究表明该突变会导致乳头状膀胱癌的形成14。Montalbo等15对尿脱落细胞学诊断不明确的样本通过多重PCR与SNapShot的方法联用检测FGFR3基因突变，结果发现由于检测突变率较低无法评估其对于尿 脱 落 细 胞 学 诊 断 不 明 确 样 本 的 临 床 意 义。Christensen等16利用ddPCR方法检测尿cfDNA和血浆ctDNA中FGFR3和PIK3CA突变位点，结果表明UC患者尿cfDNA突变拷贝数水平与肿瘤阶段、等级和大小呈正相关，尿cfDNA中高拷贝数能提示疾病的进展。本研究采用ddPCR方法检测UC患者尿cfDNA中FGFR3S249C突变情况，以辅助提高尿脱落细胞学诊断不明确的样本对于UC的诊断效能。1材料与方法1.1材料1.1.1样本来源选取2020年11月2021年7月在中国医学科学院肿瘤医院就诊的泌尿系统疾病患者。前瞻性收集临床怀疑有尿路上皮病变患者尿液(送检尿量200 mL)，纳入分析的实验组标准：经膀胱镜或术后组织病理结果确诊为尿路上皮癌；纳入分析的对照组标准：经膀胱镜或术后组织病理结果确诊为良性。排除标准：非尿路上皮病变，或有其他系统的恶性肿瘤史。1.1.2样本量估算引用公式 n=U2P(1-P)/2。n=预估样本量；U=正态分布中累积概率为/2 的 U 值；U0.05=1.96；P值分别为：预估FGFR3用于诊断尿路上皮癌的灵敏度(0.80)和诊断尿路皮癌的特异度(0.90)；=允许误差(通常定为0.050.10)。计算得出预估所需样本量为30。1.1.3实验试剂提取尿 cfDNA 所需试剂 Quick-DNA Urine Kit(含尿液稳定剂)购于 Zymo research 公司；QubitTMdsDNA HS and BR Assay Kits 购 于Invitrogen 公 司。ddPCR 所 需 ddPCRTMSupermix forProbes(No dUTP)、微滴生成油、ddPCRTM微滴读取油、DG8TMCartridges and Gaskets、DG8 Cartridge Holder、Pierceable Foil Heat Seal、PCR半裙边96孔板和探针FGFR3 pS249C_dHsaMDV2516760(20 )均 购 自 Bio-论著癌变畸变突变1 6 7CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期Rad公司；UltraPureTMDNase/RNase-Free 双蒸水购于Invitrogen公司。1.1.4实验仪器QX200TMDroplet reader、QX200TMDroplet Generator、PX1 PCR Plate Sealer和T100热循环仪均购于Bio-Rad公司；DRAGON LAB MX-F涡旋仪购于Dragon公司；恒温水浴锅购于北京医疗器械公司；Qubit 3.0购于Thermo Fisher公司。1.2实验方法1.2.1尿 cfDNA 提取选择送检尿量大于 200 mL者，混匀后留取40 mL，2 500 g/min离心后留上清液加入尿液稳定剂(每1 mL尿加入70 L尿液稳定剂)，以备DNA提取。另外150 mL尿用于尿脱落细胞学诊断制片。尿cfDNA提取分为3个步骤：总DNA(游离)沉淀、蛋白消化、DNA纯化。将已加入尿液稳定剂的40mL尿液转移到合适的离心管内，并加入20 L纯化珠，3 000 g离心15 min，收集细胞沉淀。弃去上清后不搅动细胞沉淀，保留大约100-400 L细胞沉淀，并向其中加入等体积的尿液细胞消化液，重悬。将5%的蛋白酶K加到重悬的细胞沉淀中，涡旋混匀，在55 下孵育30 min。添加1倍体积的基因组裂解液到消化完后的混合液中，并涡旋混匀。将全部样品转移到 Zymo-SpinTMIC-S 柱中，Zymo-SpinTMIC-S 柱套在一个收集管后16 000 g离心(下同)1 min，去除滤出液后，重复上述步骤。将Zymo-SpinTMIC-S柱套在新的收集管中，加入200 L Urine DNA Prep Buffer到离心柱中，离心1 min，弃去滤出液。将700 L UrineDNA Wash Buffer 放置到离心柱中离心1 min，弃去滤出液。再用200 L Urine DNA Wash Buffer重复上步骤。将离心柱转移到不含DNase/RNase-free的EP管中，加入10 L DNA洗脱液到基质上，室温下放置35 min，全速离心1 min来洗脱DNA。cfDNA 浓度采用Qubit 3.0荧光定量仪测定，选取浓度0.3 ng/L的cfDNA样本进行ddPCR检测。1.2.2ddPCR检测尿cfDNA中FGFR3S249C突变进行ddPCR检测的流程有配制反应液、制备微滴、PCR扩增、读取微滴、分析数据。配置反应液：探针 1 L，ddPCRTMSupermix for Probes(No dUTP)11L，模板1 L，UltraPuretm DNase/RNase-Free 双蒸水 加 至 终 体 积 为 20 L。制 备 油 滴：在 DG8cartridge中间的8个孔内分别加入20 L配置好的反应液，加样时需避免引入气泡。将70 L微滴生成油加入 到 DG8 cartridge 最 下 方 的 8 个 孔 中 盖 上 DG8TMGaskets，并钩牢两边小孔。制备好的 DG8 CartridgeHolder 轻放于 QX200TMDroplet Generator 中并生成微滴。PCR扩增：DG8TMcartridge最上排孔内为已生成的微滴，在96孔板内缓慢打入已生成的微滴，将PX1热封仪提前预热对已铺好微滴液的96孔板进行封膜，运行热封仪的程序为180，5 s。PCR反应需在封膜后的30 min内进行：95、10 min；39个循环94、30 s，55、1 min；98、10 min，16 保存(升降温速度2.5/s)。读取微滴，分析数据：在plate holder中放入已完成PCR的 96孔板组装好后放入到QX200TMDroplet reader中，使用QuantaSoft软件进行检测并对数据进行分析，ddPCR反应总微滴数10 000的样本纳入后续分析。按下式计算突变等位基因频率(mutation allele frequency，MAF)，MAF 是ddPCR读出的突变型拷贝数占总拷贝数的比例，是判定该样本是否有突变的重要标准17-18。MAF=突变拷贝数/总拷贝数以往研究报道使用与本研究相一致的 BioRadQX200 系统和实验试剂去检测尿 cfDNA 中FGFR3S249C突变位点19-20，对突变结果进行判读的统一标准为：MAF0.1%；突变阳性微滴3。1.3统计学方法使用 SPSS 23.0 进行统计学分析。本研究中对MAF和cfDNA浓度等计量资料进行Shapiro-Wilk正态性检验后，不符合正态分布故该计量资料以M(P25，P75)表示，组间比较采用非参数 Mann-WhitneyU检验。分类变量使用Fisher精准检验进行比较。金标准是以膀胱镜检查或经尿道膀胱肿瘤电切术病理诊断结 果 为 准。绘 制 受 试 者 工 作 特 征 曲 线(receiveroperating characteristic curve，ROC)，以尿脱落细胞学SHGUC且病理结果诊断为UC的患者作为实验组，以尿脱落细胞学结果是NHGUC且病理结果中未见肿瘤的患者为对照组，使用R语言中的pROC、ROCit包分别计算出个截点上FGFR3S249C突变对于诊断UC的灵敏度和特异度，绘制出ROC曲线；曲线下的面积在0.5和1之间，AUC越接近于1，说明诊断效果越好，AUC在0.50.7时有较低准确性，AUC在0.70.9时有一定准确性，AUC 在 0.9 以上时有较高准确性。作图使用GraphPad Prism 9.0.2。P0.1%且阳性微滴数3 的样本定义为FGFR3突变阳性，该突变对于UC的检出率为25.9%(7/27)。Hayashi等20研究者利用 ddPCR 方法从 153 名患者(含 56 名UTUC患者)尿上清中提取cfDNA检测TERT和FGFR3热突变位点，UTUC患者cfDNA中TERTC228T突变率为 39.3%，TERTC250T 突 变 率 为 7.1%，FGFR3S249C突变率为16.1%，结合细胞学检测结果计算出其特异度和灵敏度分别是96.0%和78.6%。已被FDA批准用于检测膀胱癌的诊断工具UroVysion、NMP22等可作为非侵入性方式预测膀胱癌。目前有研究表明，尿脱落细胞学结合尿液cfDNA诊断膀胱癌敏感性(77.5%)要高于尿脱落细胞学结合UroVysion(67.5%)19。这进一步说明我们的结果与以往研究有一致性的同时，FGFR3S249C突变对于UC的诊断效能有一定临床应用价值。本研究结果的重要之处是对于尿脱落细胞学诊断不明确但病理结果为UC的样本中，FGFR3S249C突变检测可以提高UC检出率且具有一定的诊断效能。本研究从尿液中提取cfDNA浓度在各尿脱落细胞学 HGUC 和 SHGUC 中浓度都有升高的趋势，且在HGUC 组 和 SHGUC 组 中 MAF 值 均 较 高。尤 其 在SHGUC 组中当不明确是否是高级别 UC 时，FGFR3S249C突变阳性可辅助诊断SHGUC以提高UC诊断效能。SHGUC中FGFR3S249C突变对UC检出率为50%AUC=0.781，95%CI(0.407，1.000)，这 提 示 在 尿cfDNA中使用ddPCR检测FGFR3S249C的突变对诊断UC有一定的辅助作用。由于尿cfDNA提取并对其进行ddPCR检测存在一定的技术难度，导致可纳入到本研究的合格样本数量较少，所以该研究结论还需要进一步扩大样本量来进行验证。综上所述，使用 ddPCR 检测尿 cfDNA 中FGFR3S249C突变作为一种非侵入性的检测方式可以辅助提高尿脱落细胞学诊断不明确样本的诊断效能。该方法将在临床上对于提高UC的早期筛查能力，辅助UC患者术前诊断、术后复发监测及预后判断上提供一定的参考依据。参考文献1ROUPRT M,SEISEN T,BIRTLE A J,et 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