蚊母树叶瘿蚜分子鉴定及种群遗传分化研究_徐湘潭.pdf

湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023 年 2 月16-生物技术 遗传育种湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）引用格式：徐湘潭，何衍彪，李意成，等.蚊母树叶瘿蚜分子鉴定及种群遗传分化研究 J.湖南农业科学，2023（2）：16-19.DOI:10.16498/ki.hnnykx.2023.002.0042023（2）：16-19蚊母树（Distylium racemosum Sieb.et Zucc）隶属于金缕梅科蚊母树属，是一种常绿灌木或中乔木，在华南、华中地区常作园林绿化植物，多年来一直受到蚜虫的危害，在叶片上形成大量的虫瘿。前人研究发现，危害蚊母树引起虫瘿的主要是蚊母新胸蚜/矢日本扁蚜（Neothoracaphis yanonis Matsumura）和杭州新胸蚜（Neothoracaphis hangzhouensis Zhang）1-2。这 2 种蚜虫形态、习性都非常相似，后者已被作为前者的次异名处理3。据报道，湖南长沙、吉首等地危害蚊母树引起叶片虫瘿的是蚊母新胸蚜4-5，江苏南京市蚊母树叶片上的虫瘿主要由杭州新胸蚜造成，其次是蚊母新胸蚜2,6。安徽省合肥市杭州新胸蚜同时危害蚊母树（D.racemosum）和杨梅叶蚊母树（Distylium myricoides Hemsl），引起虫瘿7。虽然湖南吉首、安徽合肥等地都有蚊母树叶片虫瘿的相关报道，但关于蚊母树叶瘿蚜形态学、分子鉴定的文章鲜见报道，关于各地蚊母树叶瘿蚜种群之间亲缘关系或遗传分化的研究也未见报道。为了快速鉴定湖南娄底等地的蚊母树叶瘿蚜类别，明确蚊母树叶瘿蚜各地理种群的遗传距离和亲缘关系，笔者收集了湖南、重庆、江苏、浙江 4 地区的蚊母树叶瘿蚜标本，提取其 DNA 进行线粒体 COI、COII 蚊母树叶瘿蚜分子鉴定及种群遗传分化研究 徐湘潭1，何衍彪1,2，李意成1，李佳1，刘建宏1（1.湖南人文科技学院农业与生物技术学院，湖南省高校农作物有害生物绿色防控重点实验室，湖南 娄底 417000；2.娄底市农业科学研究所，湖南 娄底 417000）摘要：为了明确我国蚊母树叶片虫瘿致瘿蚜虫的种类及其种群遗传分化情况，从湖南、重庆、江苏、浙江 4 地区的蚊母树叶瘿蚜标本中提取 DNA 进行线粒体 COI、COII 基因片段序列分析，结合 GenBank 同源序列进行了分子鉴定，并构建了基于COI、COII 基因序列的蚜虫分子系统进化树。结果表明：南京中山植物园蚊母树叶瘿蚜基因片段序列与湖南省长沙、娄底、永州种群的完全相同，即共享 1 个单倍型；重庆、杭州地理种群存在一定的遗传分化，但仍以长沙、南京标本的单倍型为主，且各单倍型样本之间的遗传距离非常小。序列分析结果支持 4 地区 6 个城市的蚊母树叶瘿蚜均为蚊母新胸蚜（Neothoracaphis yanonis Matsumura），杭州新胸蚜（N.hangzhouensis）是蚊母新胸蚜的同物异名。关键词：蚊母树；叶瘿蚜；分子鉴定；同物异名中图分类号：S433.3文献标识码：A文章编号：1006-060X（2023）02-0016-04Molecular Identification and Genetic Differentiation of the Leaf Gall-Inducing Aphids of Distylium racemosum XU Xiang-tan1，HE Yan-biao1,2，LI Yi-cheng1，LI Jia1，LIU Jian-hong1（1.College of Agriculture and Biotechnology,Hunan University of Humanities,Science and Technology;Key Laboratory of Green Control of Crop Pests in Hunan Higher Education,Loudi 417000,PRC;2.Loudi Institute of Agricultural Science,Loudi 417000,PRC）Abstract：To identify the species of leaf gall-inducing aphids of Distylium racemosum in China and explore the population genetic differentiation,the COI and COII gene sequences of the leaf gall-inducing aphids of Distylium racemosum from Hunan,Chongqing,Jiangsu and Zhejiang were obtained by PCR amplification,and then were sequenced and compared with the homology sequences from GenBank.The phylogenetic trees based on COI and COII gene sequences of aphids were constructed by the NJ method.The results have shown that the samples from Nanjing,Changsha,Loudi and Yongzhou share the same unique haplotype.There is a certain genetic differentiation in the populations from Chongqing and Hangzhou,but the haplotype of the most samples is the same as that of Changsha and Nanjing populations,and the genetic distances among different haplotypes are extremely small.The results of sequence analyses reveal that all samples from six cities of four regions are Neothoracaphis yanonis Matsumura whose synonym is Neothoracaphis hangzhouensis Zhang.Key words：Distylium racemosum;leaf gall-inducing aphid;molecular identification;synonym收稿日期：2022-10-18 基金项目：湖南人文科技学院博士科研启动费项目（82500250）作者简介：徐湘潭（2000），女，湖南常德市人，硕士研究生，研究方向为资源利用与植物保护。通信作者：何衍彪徐湘潭等：蚊母树叶瘿蚜分子鉴定及种群遗传分化研究17-生物技术 遗传育种基因片段序列分析，结合 GenBank 同源序列进行了分子鉴定，并构建了基于 COI、COII 基因序列的蚜虫分子系统进化树。1材料与方法1.1试验材料采集的蚊母树叶瘿蚜基本信息见表 1，将标本保存在 75%酒精中。COI 引物：上游，5-GGTCAACA AATCATAAAGATATTGG-3；下游，5-TAAACTT CAGGCTGACCAAAAAATCA-3。COII 引物：上游，5-CATTCATATGCAGAATTACC-3；下游，5-GAGA TCGTTACTTTGCT TTT-3。引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。1.2试验方法1.2.1总 DNA 提取参照何衍彪等8的方法，采用 TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒进行样本总 DNA 的提取。1.2.2PCR 扩增及序列测定PCR 反应体系（25 L）：10Buffer 2.5 L，MgCl2（25 mmol/L）1.75 L，dNTP 2.25 L，上、下游引物（10 pmol/L）各1.5 L，Taq DNA 聚 合 酶（5 U/L）0.2 L，模 板DNA 23 L，剩余体积由 ddH2O 补齐。PCR 反应条件：95预变性 5 min；95变性 1 min，52退火1 min，72延伸 1 min，34 个热循环；72延伸 10 min。PCR 反应以 ddH2O 代替模板 DNA 作空白对照。PCR 扩增产物送武汉天一辉远生物科技有限公司进行双向测序。1.2.3DNA 序列数据处理用 DNAstar 软件中的Editseq 程序进行序列编辑，用 Clustal X 2.0 软件中的 Align 程序进行 DNA 同源序列比对，并人工核对校正。从 GenBank 中下载了相关物种的 COI、COII同源序列共 18 条（表 2）一起进行比较分析。通过MEGA 6.0 软件计算出各叶瘿蚜种群间的遗传距离，以 NJ 邻接法构建进化树。2结果与分析2.1我国蚊母树叶瘿蚜的发生情况及形态蚊母树以前是一种广泛分布（或种植）的园林绿化植物，目前在湖南、重庆比较常见，其他省份很多城市都已经不再种植。叶瘿蚜在我国蚊母树各种植区（生长区）均有发生，除了危害蚊母树外还可以危害杨梅叶蚊母树，但几乎不危害小叶蚊母树Distylium buxifolium（Hance）Merr。在湖南，3 月蚊母树虫瘿初为黄绿色凸起，后变成紫红色球状虫瘿，内有 1 头橙黄色干母成虫和数量不等的黄色迁移蚜若虫。4月上旬虫瘿基本成型，内常有数十头橘黄色至橙黄色 3 龄若虫，4 月中下旬开始出现迁移蚜成虫。迁移蚜成虫卵圆形，体长1.62.0 mm，头、胸棕色至黑褐色，腹部橙黄色；触角 5 节；前翅宽阔，翅痣短，中脉一分叉，后翅有斜脉，静止时翅平叠于背面。2.2不同地理类群叶瘿蚜的分子鉴定及遗传分化从长沙、娄底、永州、南京、重庆、杭州 6 个地点采集的蚊母树叶瘿蚜标本中，各随机提取了 30头蚜虫的 DNA 进行 COI、COII 基因扩增，获得了表 1蚊母树叶瘿蚜样本及相关信息种群代码样本编号虫 态寄 主采集地采集时间（年-月-日）YZWMYZ1-YZ30成 虫蚊母树湖南永州（蓝山县中等职业技术学校）2021-05-04LDWMLD1-LD30若 虫蚊母树湖南娄底（湖南人文科技学院）2021-04-15CSWMCS1-CS30若 虫蚊母树湖南长沙（湖南农业大学）2021-04-09CQWMCQ1-CQ30若 虫蚊母树重庆北碚（西南大学）2021-04-17HZWMHZ1-HZ30成 虫蚊母树浙江杭州（湘湖风景区）2021-05-02NJWMNJ1-NJ30若 虫蚊母树江苏南京（中山植物园）2021-04-09表 2从 GenBank 中下载的相关物种同源序列物 种COI 编号物 种COII 编号Amphorophora rubiDQ499024Aphis glycinesKC840675Brachycaudus helichrysiKF639161Brevicoryne brassicaeNC056270Hyperomyzus pallidusHM405541Cinara tujafilinaJX035412Myzodium mimulicolaGU224128Diuraphis noxiaDQ005181Nearctaphis bakeriMN319851Hamamelistes betulinusAF328782Neothoracaphis quercicolaMN167415Meitanaphis flavogallisMF043982Neothoracaphis yanonisMH820606Neothoracaphis yanonisKP722574Neothoracaphis yanonisJX489642Nipponaphis coreanaGU457808Uroleucon luteolumGU559861Schlechtendalia chinensisKX852297湖南农业科学（HUNAN AGRICULTURAL SCIENCES）2023 年 2 月18-生物技术 遗传育种长度分别为 658、625 bp 的序列，序列登录号分别为ON227503ON227508、ON227509ON227514。对比发现，个城市的蚊母树叶瘿蚜 COI、COII 基因片段序列差异非常小，重庆、杭州部分个体的 COI基因片段序列第 581 位碱基存在差异，部分个体的COII 基因片段序列中第 381 或 681 位碱基存在差异。分析不同种群的 COI、COII 基因片段序列（表3）可知，个城市的蚊母树叶瘿蚜共发现 5 个单倍型（其中 COI 2 个、COII 3 个），长沙、娄底、永州、南京的蚊母树叶瘿蚜共享同一单倍型（CCT 型），重庆、杭州蚊母树部分叶瘿蚜发生了遗传分化，但种群个体仍然以 CCT 型为主；单倍型 TTC 和 TCT 只在重庆种群中被发现；单倍型 TCC 和 CCC 只在杭州种群中被发现。COI 的 2 个单倍型基因序列与 GenBank 收录的同源序列比对结果（图 1）显示，蚊母树叶瘿蚜单倍型 C 型标本 COI 基因片段序列（ON227504）与GenBank 中 蚊 母 新 胸 蚜（Neothoracaphis yanonis）福州标本（MH820606）同源序列完全一致（相似度 100%），二者与蚊母树叶瘿蚜单倍型 T 型标本（ON227508）聚为一支，其次是与我国蚊母新胸蚜另一地理种群标本（JX489642）聚为一支，最后与同 属 的 Neothoracaphis quercicola（MN167415）聚为一大支。COII 的 3 个单倍型基因序列与 GenBank 收录的的同源序列比对结果（图 2）显示，蚊母树叶瘿蚜单倍型 TC 型标本 COII 基因片段序列（ON227513）与蚊母树叶瘿蚜单倍型 CC 型标本 COII 基因片段序列（CQWM ON227514）聚为一支，二者与 GenBank 中收录的蚊母新胸蚜我国某地标本（KP722574）聚为一支，最后与蚊母树叶瘿蚜单倍型 CT 型标本 COII图 1基于 COI 基因序列的蚜虫分子系统进化树（采用 MEGA6.0 软件分析，同源序列来自 GenBank，下同）图 2基于 COII 基因序列的蚜虫分子系统进化树表 3蚊母树叶瘿蚜 5 个单倍型分布情况种群代码COI 单倍型COII 单倍型CTTCCTCCYZWM3000300LDWM3000300CSWM3000300CQWM2464260HZWM2460228NJWM3000300合 计1681241688徐湘潭等：蚊母树叶瘿蚜分子鉴定及种群遗传分化研究19-生物技术 遗传育种基因片段序列（ON227510）聚为一大支。CT 型、TC 型和 CC 型蚊母树叶瘿蚜 COII 基因片段序列与蚊母新胸蚜我国某地标本（KP722574）的同源序列相似度分别为 99.67%、99.67%和 99.50%。由表 4 可知，6 个城市的蚊母树叶瘿蚜遗传分化总体不明显，基于 COI+COII 基因序列的 5 个单倍型之间的遗传距离仅为 0.0010.002。表 4蚊母树叶瘿蚜 COI+COII 不同基因型间的遗传距离基因型遗传距离CCTTCTCCCTTCTCCCCTTCT0.001CCC0.0010.002TTC0.0020.0020.002TCC0.0020.0010.0010.0013结论与讨论由于线粒体 DNA（mtDNA）属于母系遗传，在种群内和种群间具多态性，在个体水平上具异质性，因此被大量地应用于研究昆虫进化和种群遗传学；同时，COI、COII 等线粒体 DNA 常被应用于区分和鉴定亲缘关系很近的分类单元或微小昆虫9。湖南省（永州市、娄底市、长沙市）蚊母树叶瘿蚜 COI 基因片段序列与 GenBank 中收录的蚊母新胸蚜（Neothoracaphis yanonis）福州标本（MH820606）同源序列完全一致10，COII 基因片段序列与 GenBank 中收录的蚊母新胸蚜（N.yanonis）我国某地标本（KP722574）同源序列相似度也高达 99.67%，足以证明娄底市蚊母树叶瘿蚜为蚊母新 胸蚜。杭州新胸蚜是张广学教授于 1982 年发现的新种，分布于杭州、上海、南京、武汉，是南京地区危害蚊母树蚜虫的优势种2,6,11。其与蚊母新胸蚜的特征差异主要表现为头顶毛、腹部背片背毛与触角节最宽直径的比例，触角节鞭部顶端、喙节毛的数量，以及跗节毛序等方面10。Chen等3认为蚊母新胸蚜、杭州新胸蚜在形态、习性方面都非常相似，可将它们互为同物异名。研究发现，南京中山植物园蚊母树叶瘿蚜 COI、COII 基因片段序列与湖南省（永州、娄底、长沙）的完全相同，说明这些样本均为蚊母新胸蚜。重庆、杭州地理种群存在一定的遗传分化，但仍以长沙、娄底、永州、南京标本的单倍型（CCT 型）为主，且各单倍型样本之间的遗传距离非常小。因此，研究中采自重庆和杭州的样本也是蚊母新胸蚜。从标本采集范围来看，郭昆11对中国扁蚜科的系统分类研究所采用的蚊母树叶瘿蚜标本主要来自于江苏、浙江，而廖文宇等5仅仅对长沙的蚊母树叶瘿蚜进行了分子鉴定。该研究采集的标本分布于湖南、重庆、浙江、江苏 4 地区，采样点经纬度跨度较大，采集的标本基本能代表我国蚊母树叶瘿蚜种群遗传结构。根据个城市蚊母树叶瘿蚜的 COI、COII 基因片段序列及各单倍型的分布情况，从分子水平上证明 6 个城市的蚊母树叶瘿蚜与 GenBank 2019 收录的福州标本均为蚊母新胸蚜，杭州新胸蚜是蚊母新胸蚜的同物异名。分子鉴定只是物种鉴定的一个辅助手段，如果能将张广学教授所鉴定的杭州新胸蚜模式标本 COI、COII 序列与其他各地蚊母树叶瘿蚜标本的进行比对、分析，其结果对于蚊母新胸蚜、杭州新胸蚜的分类地位的确定将更加具有说服力。参考文献：1 沈百炎.矢日本扁蚜的初步观察与防治 J.植物保护，1986，12（6）：16-17.2 沈百炎，荆建玲，朱建国.杭州新胸蚜生物学的初步研究 J.植物保护，1993，19（2）：5-7.3 CHEN J，JIANG L Y，QIAO G X.Revision of Neothoracaphis Takahashi with description of a new species from China（Hemiptera：Aphididae：Hormaphidinae）J.Oriental Insects，2011，45（2/3）：146-161.4 李晓腾，刘世彪，张世鑫，等.中华蚊母树虫瘿类型及其致瘿昆虫生活史初探 J.昆虫知识，2010，47（4）：789-793.5 廖文宇，吴海龙，张诗晟，等.长沙地区 7 种寄主蚜虫的快速鉴定及其亲缘关系分析 J.中国植保导刊，2019，39（6）：12-21.6 巨云为，朱萍，施大伟，等.蚊母树对杭州新胸蚜虫瘿形成的生理生化响应 J.福建林学院学报，2012，32（1）：10-12.7 陈辰.杭州新胸蚜对 2 种蚊母树的危害性比较研究 D.合肥：安徽农业大学，2013.8 何衍彪，万宣伍，詹儒林，等.基于核糖体基因 18S 和 28S 序列的 12 种粉蚧亲缘关系解析 J.热带作物学报，2011，32（12）：2324-2330.9 张民照，杜艳丽，张爱环，等.线粒体 DNA 标记在昆虫学研究中的应用进展 J.北京农学院学报，2011，26（1）：76-80.10 LI Q，DENG J，CHEN C，et al.DNA barcoding subtropical aphids and implications for population differentiationJ.Insects，2019，11（1）：11.11 郭昆.中国扁蚜科的系统分类研究（同翅目：蚜总科）D.西安：陕西师范大学，2005.（责任编辑：成平）