大鼠自由落体脑外伤模型的制作_高燕.pdf

浙江创伤外科!#年$%月第&卷第期()*+,-./0123.-4 15 63-27-8,9:23/*3;，14?&，1?大鼠自由落体脑外伤模型的制作高燕孙骏谟田志雄吴光耀 论著 作者单位：#ABC武汉，湖北省武汉大学中南医院创伤性脑损伤（63-27-8,9 D3-,.E.+23;，6DE）有较高的死亡率与致残率，给社会和家庭带来沉重的负担，相关实验及临床研究亦倍受关注。本文参照F*.*;G自由落体模型HCI设计并适当改进打击装置，以不同程度打击力制作大鼠脑外伤模型，探讨该模型损伤后的病理学特点及在脑外伤研究中的实用价值。C材料与方法C?C动物选择及分组：取健康、月龄、体重相似的雄性:J大鼠#!只，体重!%K!B/。按照随机化原则分入以下#组，轻伤组、中伤组及重伤组各C!只，假手术组L只。C?!脑 损 伤 动 物 模 型 装 置 的 改 进：实 验 参 照F*.*;G法改进并设计打击装置，其装置由底座、电磁铁释控开关、撞杆、下落砝码和外周导管组成。外周导管为不同长度的铜管，内径CL77，自上而下每间隔C97带有一个直径77侧孔，铜管下端焊接一环形铜片封口，中心留有77小孔。铁制砝码分别为!/和#/，直径C77，上下端均为平面，铁制撞杆由两个圆柱体连接而成，其纵剖面为“6”形。上份高77，直径C77，位于导管内；下份高A?77，直径#?77，正好从导管底部的孔中穿出作为打击面。电磁铁释控开关采用AL电源控制数匝铜制线圈，接通时电源产生电磁效应吸引铁制砝码，置于铜制导管上方，断开电源时释放砝码下落（图C）。C?A不同损伤程度脑外伤模型 的 制 作：将大鼠提前A天单 独 喂 养，术前 禁 食M小时。实验时用CN水合氯醛以?A/OP/腹腔内注射进行麻醉，俯卧位固定于脑立体定向仪Q江湾!型RS上。消毒皮肤，正中切开，剥离骨膜，暴露右顶骨，用牙科钻在冠状缝后C?77，中线旁!?77处钻一直径77骨窗，保持硬膜完整。将撞杆置于硬膜上，用!/砝码分别于C97、A97高处沿外周导管坠落，撞击撞杆从而撞击硬膜，致右顶叶轻、中度脑挫裂伤，用#/砝码于!97高处坠落致重度脑挫裂伤。A种致伤冲击力大小为!/97、L/97、C/97。打击后切口内滴注#万单位硫酸庆大霉素#K滴，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮。假手术组仅开颅窗后用骨蜡封闭，不施加打击。C?#病理学观察：各组分别进行血脑屏障观察、光镜及电镜观察。血脑屏障观察：损伤组和假手术组术前C小时注射!T伊文氏兰A74OP/，术后$小时在 麻 醉 状 态 下 开 胸 经 升 主 动 脉 灌 注 生 理 盐 水!%74，直至右心房流出液清亮为止，以清除血液中【摘要】目的改进F*.*;G自由落体模型装置并制作大鼠脑外伤模型，探讨该模型的病理学特点及对临床实验的价值。方法采用电磁铁释控开关自由落体模型，以不同冲击力（!%/U97、L%/U97、C%/U97）致大鼠轻、中、重度脑损伤，并进行一系列病理学观察。结果病理学证实脑组织出现不同程度的改变，与致力伤大小成正比。结论 本模型对脑外伤实验和临床研究有实用价值。【关键词】脑外伤；动物模型；大鼠；病理【中图分类号】VL$【文献标识码】W!#$%&()*+,-./)%&$0,#&)+1&2 3%45#6.7 8%60 095%:0%4.;!#$%&()*+,&-./0%&12030.&4 56%78 9,:%&;.77%45 9,2%&;20&%?8【+.-&);6)*7,4Z71Z*3-8*-.Z G*Y*3Y*=3-,.83-27-*3*7-Z*=;-*4*98317-/.*8,94;1.83144*Z 3*4*-G,./G,89)-.Z Z,55*3*.8,7X-98（!%/U97、L%/U97、$%/U97）-.Z*X319*Z*Z-G*3,*G 15 X-8)141/;1=G*3Y-8,1.?+;51.;6)*Z,55*3*.8 Z*/3*X-8)141/,9-4 9)-./*G 15 8)*=3-,.,.+23;)-Z-Z,3*98 X31X138,1.,8),7X-98?&0715;&0 6),G71Z*4)-G-X3-98,9-4 Y-42*,.83-27-8,9=3-,.,.+23;*X*3,7*.8-4-.Z 94,.,9-4 83-27-8,9 G82Z,*G?【A+:*&%);】63-27-8,9=3-,.,.+23;；W.,7-4 71Z*4；V-8；_-8)141/;图$打击模型示意图!MA浙江创伤外科!#年$%月第&卷第期()*+,-./0123.-4 15 63-27-8,9:23/*3;，14?&，1?!图!A中度组水肿区正常结构消失，少量髓鞘溶解，空泡变B电镜，CD%E；F重度组轴索肿胀，髓鞘明显溶解，空泡变B电镜，CD%E。AF染料，断头取脑行77冠状切片，观察脑组织蓝染部位及范围；!光镜观察：术后D小时后经升主动脉先后快速灌注生理盐水D%74及冰冷#G多聚甲醛$%74，继 续 于!%7,.内 缓 慢 灌 注#G多 聚 甲 醛$%74，断头取脑迅速浸入$%G甲醛#H固定#I小时，修成厚#77块，常规酒精脱水，石蜡包埋，行7冠状切片，作JK染色及尼氏小体染色；#透射电镜检查：经升主动脉灌注#G多聚甲醛和!?G戊二醛L%?DMNF（NJO?#）!%74混合液后，立即取脑组织于冰上修成#77小块，浸入戊二醛溶液，#H后固定过夜，常规丙酮脱水，环氧树脂P$I包埋，半薄切片定位，超薄切片，醋酸铅铀、柠檬酸铅双染色，日立JQP%型透射电镜观察、照像。!结果!?D肉眼观及血脑屏障观察：假手术组骨窗局部血管轻度扩张，无渗血，脑组织无异常；轻伤组局部脑膜血管充血明显，有或无少许渗血可自行停止，多无明显脑裂伤，伴或不伴有急性硬膜下血肿或局限性蛛网膜下腔出血；中、重伤组均出现脑挫裂伤，皮质和L或皮质下区出血灶，脑体积增大，部分出现中线移位，重伤组脑损伤程度和范围明显大于中伤组。假手术组KF染色为阴性，损伤组脑组织出现不同程度蓝染，从损伤中心冠状切面上可观察蓝染色泽及范围。轻伤组可观察到损伤灶在脑表面形成直径约R77淡蓝色斑；中、重伤组损伤灶蓝染颜色逐渐加深，范围扩大；重伤组蓝染深度可达大脑半球深部，部分脑干可观察到蓝染（表D）。!?!光镜及电镜观察：假手术组镜下无明显病理改变，轻伤组损伤局部可见大脑皮层锥体细胞变圆、染色浅淡、核偏位、胞质呈网状、细胞及血管间隙增大等脑水肿病理改变，伴或不伴硬膜下及蛛网膜下腔出血；中伤组脑组织神经元肿胀明显，胞浆染色浅淡，尼氏体减少，皮质浅层及皮质下白质可见出血灶；重伤组局部脑皮质挫裂伤明显，广泛蛛网膜下腔出血，脑实质内出血灶更广泛，脑水肿更明显，部分核固缩，甚至胞膜破裂S细胞呈空泡状，胼胝体、海马及部分基底节区可出现出血灶S侧脑室内见少到中量血细胞，部分出现同侧脑干挫伤水肿及小出血灶等，!例可见脑对冲伤。电镜下见损伤组水肿区细胞核固缩，核仁分离，线粒体嵴减少呈空泡样变，轴索肿胀，髓鞘溶解空泡样变，这些改变随致伤力增加更明显（图!）。R讨论R?D本模型的病理学特点：脑外伤后早期出现微循环舒缩功能障碍，引起不同程度的脑缺血及微血管内凝血，造成内皮结构破坏，血脑屏障通透性增高，导致脑水肿形成T!U。伊文氏兰与血清蛋白结合而不能透过正常的血脑屏障，是常用的血脑屏障受损指示剂。本模型观察到脑组织蓝染表面直径及深度与致伤力大小及脑损伤严重程度一致，证实脑外伤后血脑屏障破坏与损伤程度关系密切。本模型脑组织局部损伤重，多位于同侧大脑半球，非损伤区尤其对侧半球无明显损伤，损伤区可观察到局灶性皮质挫裂伤、皮质及皮质下的白质出血、蛛网膜下腔出血、脑水肿等，其中皮质胼胝体交界处出血较常见，有时可不伴脑挫裂伤，与国外报道基本一致。可能该区组织成分及纤维走行方向差异导致结合疏松且力学特点不同，从而受创后容易发生小假手术组轻伤组中伤组重伤组脑组织KF蓝染色泽Q淡蓝色蓝色深蓝色脑表面KF蓝染直径平均大小QR777777以上脑组织KF蓝染深度Q距脑表面!77左右的皮质浅层脑表面以下RQ77的皮质深层脑表面以下77以上，甚至脑干表D脑组织血脑屏障观察结果!I#浙江创伤外科!#年$%月第&卷第期()*+,-./0123.-4 15 63-27-8,9:23/*3;，14?&，1?血管断裂出血集聚在间隙内ABC。此模型损伤后脑组织蓝染范围、程度及病理学检查证实了脑损伤程度，对损伤分级有重要参考价值。从损伤构成看，中重伤组相似，仅表现为损伤程度更重，范围更广。因此，笔者认为，从损伤范围而不是损伤类型描述损伤严重程度更有意义。临床上两者与患者治疗和预后均有重要关系：!级损伤局限于大脑半球层，包括局部挫伤、出血、水肿；级损伤累及大脑皮层、胼胝体、基底节及海马等部位；#级损伤累及大脑皮层至小脑、脑干等，并出现脑室内出血。打击部位位于顶叶支配运动和躯体感觉的“后肢”区域，此区相对较平坦且操作方便。该区受损后可产生损伤对侧肢体的神经功能障碍，如活动受限、行动迟缓等。此模型死亡率低，未发现低位脑干及延髓损伤D可能与作用力方向上的脑干压缩损伤少有关A$C。B?!颅脑损伤模型的制作：临床颅脑损伤比较复杂，动物模型的主要问题在于怎样做到尽可能简化模型又能模拟临床脑损伤发生机制，且有较好的稳定性和重复性。现今颅脑损伤模型有多种A#C，但缺乏一种稳定的定量模型。创伤性脑损伤严重程度主要与外力大小、外力作用时间、脑组织形变量有关。在保持颅骨完整的脑外伤模型中，不同动物的解剖差异使之皮肤、骨、硬膜、脑等机械力学特点不同，可导致相同水平打击负荷造成的致伤力传导到脑组织的大小和分布有差异，对实验影响较大，如用于复制脑震荡、EFG的直线或角加速伤模型等。颅骨开窗后致伤，外力直接作用于完整硬膜也属于闭合性脑损伤模型，致伤力作用的接触点和接触面积准确，可相对减少实验动物个体差异的影响，如液压伤弥漫性脑损伤模型及冷冻伤脑水肿模型等。液压伤模型装置较复杂，硬膜外埋置打击管，通过液压传导打击力使脑组织发生弹性形变而受损，但难以控制恒定的外力作用时间，多引起广泛脑损伤。较大致伤力易引起低位脑干和上位颈髓损伤，死亡率高，创伤性脑水肿形成不明显ADHC。冷冻伤脑水肿模型仅用以研究创伤性脑水肿。两者致伤机制与人类受伤机制不尽一致，均不适用于颅脑损伤的生物力学研究。相比之下，本脑外伤模型有以下特点：$装置简单，操作方便，实用经济；%实验可重复性好，致伤部位及面积准确一致，打击负荷类型一致且量化分级，电源控制砝码的释放时间和高度避免了以往同类模型中手吊线AIC或滑轮吊线法AJC砝码高度不稳定和对自由落体运动的影响，导管下方的袖口样结构控制皮质压缩深度均为!?77，瞬间产生同样的脑组织形变，实验中砝码撞击脑后及时将动物从装置上移开以保证只有一次撞击，而不是重复致伤；&与临床脑外伤力学机制最相似，充分模拟临床局灶性创伤性脑损伤及脑水肿，对损伤机制、生物学效应及相关病生理药效学研究有重要价值。但颅骨开窗后不能观察到骨折，且人为减压措施对急性脑水肿形成、硬膜外血肿占位效应的观察有一定影响，与临床闭合性脑损伤发生机制稍有不同。本实验改进K*.*;L自由落体脑损伤模型装置，建立脑损伤分级定量模型，综合评估实验大鼠脑损伤的程度，发现脑损伤程度与致伤力成正比，有利于施加处理因素进行深入研究。如进一步分析脑损伤病理生理变化机制，用特定指标进行不同损伤程度的伤情评估，指导临床治疗，预测疾病预后等。参考文献IK*.*;EMDN1;*L1.MODP,.Q6D*8-4?Q*LR1.L*L819138,9-4,.+23;SG?M*8)1T141/;-.T 419-4*55*98L 15 91.82L,1.L,.8)*3-8?N3-,.Q*LDI&UID!JD!IIVIWSHJXJJ?!刘卫平D章翔D易禹声D等?大鼠急性颅脑损伤后脑微循环的变化?第四军医大学学报D!%D!$V$!WS$%HX$%&?B:244,Y-.ZOD M-38,.*0D N*9*3 ED*8-4?K42,TXR*392LL,1.71T*4 15 7*9)-.,9-4=3-,.,.+23;,.8)*9-8?0*231L23/D$&JHD#VWS!$XB#?#P*3 QQD:)1)-7,D_1.L8-.8,.,:?R*3,7*.8-4 71T*4L 15)*-T83-27-?F98-*2319),3:2RR4D!DUBS#&X#?E,1._DP;*8)NOD1Y4,L)19 06D*8-4?F 542,T R*392LL,1.71T*415*R*3,7*.8-4=3-,.,.+23;,.8)*3-8?0*231L23/DI&UJDHJVIWSIIXII&?H李力仙D王天佑D钟震宇D等?自由落体和液压致大鼠脑损伤的对比研究?中华实验外科杂志DI&DIHVWS#JX#U?J袁绍纪D朱诚D陈柏林D等?大鼠急性创伤性脑水肿模型的建立?上海医学DI&U&DI!VWS!JHX!JU?A收稿日期：!#X!XI&C（编辑：沈宏）!U