致牛腹泻4种细菌多重荧光定...PCR检测方法的建立及应用_高睿.pdf

动物医学进展，（）：致牛腹泻种细菌多重荧光定量 检测方法的建立及应用高睿，徐伟，罗艳，谢晓刚，李梦磊，张琪，许信刚（杨凌职业技术学院动物工程学院动物疫病防控陕西省高校工程研究中心，陕西杨凌 ；陕西省彬州市动物疫控中心，陕西彬州 ；西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 ）摘要：随着规模化和集约化养牛业的不断发展，多种致病菌混合感染造成牛腹泻严重制约了养牛业的快速发展，对腹泻病原进行快速准确鉴别诊断对疫病防控至关重要。根据沙门氏菌的 基因、大肠埃希氏菌的 基因、产气荚膜梭菌的 基因以及志贺氏菌的 基因的保守区域建立了可同时检测这种细菌的多重荧光定量 检测方法，并对其特异性、灵敏性和重复性进行了研究。结果显示，建立的标准曲线线性关系良好；优化后的检测方法仅可特异性扩增出种目标细菌；对大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌和产气荚膜梭菌的最低检出限分别为 、和 ，该方法的灵敏性高于普通单项 检测方法 倍；批内、批间差异均小于。用此方法检测人工感染病料，每份病料均检测出对应攻毒细菌的荧光信号。以上结果表明，所建立的多重荧光定量 方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于致牛腹泻细菌的实验室检测。关键词：大肠埃希氏菌；沙门氏菌；志贺氏菌；产气荚膜梭菌；多重荧光定量 中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）大肠埃希氏菌（.）、沙门氏菌（）、志贺氏菌（）和产气荚膜梭菌（.）收稿日期：基金项目：陕西省重点研发计划项目（）作者简介：高睿（），女，陕西长安人，硕士，副教授，主要从事分子病原学研究。通讯作者 ，（.，；.，；.，）：（）（），：；DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.004均为条件性致病菌，在正常情况下这些细菌也会存在于牛群体内，而当其外界环境或者饲养环境突然发生剧烈变化时，会导致牛群机体抵抗力低下，造成细菌的大量增殖从而导致牛群发病。牛群感染大肠埃希氏菌时主要表现为腹泻、败血症和脑膜炎，若不及时对其进行治疗，病犊牛可能会因为心力衰竭而造成死亡。感染沙门氏菌的牛在不同发病时期其症状略有不同，其在发病早期粪便颜色呈黄色水样腹泻，不含有血液和黏液；到病程中后期粪便中偶有夹杂血丝或混有血液的现象，并随着病程的不断发展腹泻和脱水症状也逐渐加深。产气荚膜梭菌可感染不同品种、不同年龄阶段的牛，发病时可集中在同圈舍或者相邻圈舍，其患病牛主要表现为肠炎、腹痛、腹胀。志贺氏菌主要是通过破坏牛群的肠道上皮黏膜细胞从而导致犊牛的痢疾。以上种细菌均会造成牛的腹泻，而当临床出现这种情况时，临床无法准确快速的分辨是何种细菌引起的，因此急需实验室的快速诊断为临床的诊疗提供指导。实时荧光定量 （）是指在 扩增过程中，通过荧光信号对 进行实时检测，按照荧光物质的不同可分为染料法和探针法两种。染料法无法特异性检测不同病原体，而探针法可以通过使用不同的荧光基团与淬灭基团对探针进行修饰，从而实现在单个试管中检测到不同的病原体。与常规的 相比，多重 荧光定量 具有特异性高、更加省时的优点。基于现在对于牛种腹泻病原的多重检测方法研究较少，本研究建立了一种多重 荧光定量 检测方法，以期为种致牛腹泻细菌的检测、鉴别诊断以及有效防控提供可靠方法。材料与方法材料菌株来源沙门氏菌、大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、志贺氏菌、链球菌、山羊海藻百伯史坦菌以及巴氏杆菌，均由西北农林科技大学动物医学院兽医微生物实验室保存并提供。主要试剂 核酸提取试剂盒、无内毒素质粒小提中量试剂盒、通用型 纯化回收试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司产品；、，赛默飞世尔科技有限公司产品。主要仪器设备 扩增仪，力康生物医疗科技控股有限公司产品；凝胶成像系统，上海培清科技有限公司产品；实时荧光定量 仪，西安天隆科技有限公司产品。实验动物健康昆明小鼠 只，体重 左右，购自空军军医大学实验动物中心。方法引物和探针的设计根据 上收录的沙门 氏 菌 的 基 因、大 肠 埃 希 氏 菌 的 基因、产气荚膜梭菌的 基因以及志贺氏菌的 基因的保守区域利用 软件对其进行引物和探针的设计。引物序列如表所示。阳性质粒制备使用 提取试剂盒分别对大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌及产气荚膜梭菌进行基因组核酸提取，以这种细菌的 为模板，使用本研究所设计的特异性引物进行 扩增，扩增体系为 ，上、下游引物各，模板各其余用 补足至。在 仪中进行扩增，反应程序为：；，共 个循环；延伸 。将 产物与克隆载体 进行连接，并将构建的质粒进行 与测序鉴定。将鉴定为阳性的质粒使用超微量光谱分析仪进行浓度测定，并使用下列公式计算其拷贝数，将质粒进行倍比稀释后于 冰箱保存。拷贝数（）阳性质粒浓度 （质粒总长）。多重荧光定量反应条件优化实时荧光定量的总反应体积为，反应体系包括 、对引物及探针、种细菌模板。分别对其引物、探针浓度以及退火温度进行条件优化。加入不同体积的探针使终浓度为、分析最优探针浓度的配置；加入不同体积的引物使引物终浓度为、来确定最优引物浓度；退火温度采用、，循环数采用 次。并在延伸阶段收集荧光信号。标准曲线的建立在确定的多重荧光定量 最优扩增条件下，以 为阴性对照，并使用其 对 标 准 阳性 质 粒进行 倍浓度稀释，选取 的标准质粒来进行扩增，使用荧光定量 仪自带软件来建立标准曲线。特异性试验分别对大肠埃希氏菌、志贺氏菌、巴氏杆菌、山羊海藻百伯史坦菌、沙门氏菌、链球菌和产气荚膜梭菌提取 ，用建立的多重荧光定量 检测方法对其进行检测，验证本研究所建立的检测方法的特异性。动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）表实时荧光定量 引物与探针序列 名称 序列（）（）长度 序列号 产气荚膜梭菌.志贺氏菌 大肠埃希氏菌.沙门氏菌 敏感性试验在多重荧光定量 最优扩增条件下，以 为阴性对照，并使用其对标准阳性质粒进行 倍浓度稀释，选取 的标准质粒来探究其检测下限，同时使用常规 进行对照检测，评估两者的差异。重复性试验在多重荧光定量 最佳反应体系和条件下，以 为阴性对照，并使用其对标准阳性质粒进行倍比稀释，选取 的标准质粒来进行扩增，在不同时间进行次检测（批间）以及在同一时间进行次检测（批内），计算变异系数。细菌人工模拟病料的检测将昆明小鼠按照下列设计进行分组攻毒.（各 ）、.（各 ）、.（各 ）、.（各 ）、.（）、（）、（）、.（）、.（各 ）、.（各 ）、.（各）、（各）、.（各）、.（各）、.（各）。同时设立生理盐水（）对照组隔离饲养。攻毒 后，无菌取攻毒小鼠与对照组小鼠脾脏与肝脏，将组织研磨后，使用 提取试剂盒提取其组织总 ，并用本试验所建立的检测方法对其进行检测。结果阳性重组质粒制备使用荧光定量特异性引物对大肠埃希氏菌阳性质粒（目的基因为 ）、沙门氏菌阳性质粒（目的基因为 ）、志贺氏菌阳性质粒（目的基因为 ）、产气荚膜梭菌阳性质粒（目的基因为 ）进行 鉴定，扩增大小与预期结果一致（图）。将重组质粒进行测序，测序结果显示标准阳性重组质粒均构建成功。测定质粒浓度分别为 （大肠埃希氏菌）、（沙门氏菌）、（产气荚膜梭菌）、（志贺氏菌）。按照公式计算拷贝数分别为 （大肠埃希氏菌），（沙门氏菌），（产气荚膜梭菌），（志贺氏菌）。将个阳性重组质粒分别进行 倍浓度倍比稀释，置于 冰箱保存备用。反应条件的优化通过选择荧光强度高、值较小、扩增效率接近 时的扩增条件来进行反应条件的优化，最终确定的最优反应条件为模板各、引物浓度分别为 （大肠埃希氏菌）、（志贺氏菌）、（产气荚膜梭菌）、（沙门氏菌），探针浓度分别为 （大肠埃希氏菌）、（志贺氏菌）、（产气荚膜梭菌）、（沙 门 氏 菌）。确 定 的 反 应 条 件 为：；，共 个循环。标准曲线的建立标准曲线如图所示。在 的浓度梯度区间内，（浓度）与 值之间呈现良好的线性关系，如图所示，所得的标准曲线分别为志贺氏菌：.，相关系数（）为 ；产气荚膜梭菌：.，相关系数（）为 ；沙 门 氏 菌：.，相关系数（）为 ；大肠埃希氏菌：.，相关系数（）为 。高睿等：致牛腹泻种细菌多重荧光定量 检测方法的建立及应用 标准 ；沙门氏菌；产气荚膜梭菌；大肠埃希氏菌；志贺氏菌；阴性对照 ；.；.；图 扩增结果 特异性试验结果使用优化好的检测条件对不同细菌进行检测，来评估所建立检测方法的特异性。结果表明仅有大肠埃希氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌和志贺氏菌阳性模板有荧光信号（图），而链球菌、山羊海藻百伯史坦菌以及巴氏杆菌均无荧光信号。表明所建立的检测方法可以从混合模板中正确识别靶基因，未出现交叉反应，说明所建立的检测方法具有高度特异性。敏感性试验结果以 阳性重组质粒为模板对两种检测方法进行比较。检测结果如下：多重荧光定量 检测方法对于志贺氏菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌以及产气荚膜梭菌的检出下限分别为 、（图）。而常规 检测对于志贺氏菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌以及产气荚膜梭菌的检出下限分别为 、（图）。从这两种检测结果的对比可以看出多重荧光定量 检测方法的灵敏度是常规单项 检测方法的 倍，说明本研究所建立的检测方法对比常规单项 检测方法检出阈值更低，敏感性更强。图大肠埃希氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、志贺氏菌荧光定量 标准曲线 .，.，大肠埃希氏菌；沙门氏菌；产气荚膜梭菌；志贺氏菌；分别为链球菌、巴氏杆菌和山羊海藻百伯史坦菌；阴性对照 .；.；，.；图大肠埃希氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、志贺氏菌荧光定量 特异性结果 .，.，动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）标准模板荧光定量 扩增曲线；阴性对照 ；图大肠埃希氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、志贺氏菌荧光定量 灵敏性试验结果 .，.，沙门氏菌；大肠埃希氏菌；志贺氏菌；产气荚膜梭菌 ；.；.标准 ；阴性对照 ；图大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、产气荚膜梭菌常规 灵敏性试验结果 .，.，重复性试验结果将大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌以及产气荚膜梭菌的 阳性重组质粒在不同时间进行次检测（批内）；在不同时间对上述模板进行重复次检测（批间）。结果显示，批内变异系数 在 之 间，批 间 变 异 系 数 在 之间（表），表明本方法重复性好。细菌人工模拟病料的检测使用本研究所建立的检测方法分别对攻毒小鼠与对照组小鼠的组织样品进行检测，检测结果显示阳性荧光信号与攻毒细菌菌种符合。证明该方法可以用于临床样品的检测。部分检测结果如图所示。讨论大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌以及产气荚膜梭菌是导致犊牛腹泻的主要病原，临床上因其症状的相似性以及耐药性的不断加重，给临床诊断与治疗造成很大的阻碍。而且由于现在养殖多为集约化养殖，这就为细菌的感染提供了契机，一旦有牛群感染发生腹泻，细菌就可由粪便大量排出从而造成相邻圈舍的相继发病，威胁犊牛的健康。因此，对于腹泻病原的快速鉴别检测对养牛业来说至关重要。目前国内外可以同时检测这种细菌的方法很少。刘嘉琳等建立了可同时检测猪大肠埃希氏菌、沙门氏菌及产气荚膜梭菌的荧光定量检测方法。冯育芳等建立了可同时检测沙门氏菌和志贺氏菌的荧高睿等：致牛腹泻种细菌多重荧光定量 检测方法的建立及应用表荧光定量 重复性试验结果 模板 拷贝数（）变异系数 批内重复 批间重复 大肠埃希氏菌.沙门氏菌 志贺氏菌 产气荚膜梭菌.光定量检测方法，但是相比于其灵敏性而言，本试验所建立的检测方法灵敏性均可高于其 倍。王艳萍等、魏昭等、郑萍等、戴陈伟等 分别建立了这种细菌的单项检测方法。但是这些检测方法仅可检出单一细菌，无法满足对混合感染样品进行检测的需求。因此，在病原的实验室检测方面，本试验所建立的多重实时荧光定量 检测方法比其他的检测方法具有较大的优势。本试验通过扩增大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌以及志贺氏菌的保守基因，分别构建阳性重组质粒，并对其引物、探针以及退火温度等一系列条件进行摸索与优化，最终建立了一种可以同时检测这种细菌的多重荧光定量 检测方法。该方法可以从混合模板中检测出阳性，而从其他病原沙门氏菌；产气荚膜梭菌沙门氏菌大肠埃希氏菌；产气荚膜梭菌大肠埃希氏菌扩增曲线；产气荚膜梭菌 ；.；.；.图人工模拟病料部分检测结果 体检测出未检测到荧光信号，表明该方法具有很高的特异性；对比常规单项 检测方法具有更低的检测阈值；变异系数均小于，具有良好的重复性；人工感染小鼠试验表明，本方法可用于临床细菌感染的鉴别诊断。总之，该方法就相对于其他检测方法来说，不管是从灵敏度、特异性还是重复性，均具有很大的优越性。该方法在临床样品的检测中可以同时检测单一细菌感染或者混合感染，相对于其他检测方法有明显优点，有较大的应用价值，可以满足临床的所有关键性需求，适用于实验室快速诊断。参考文献：沈思思，秦平伟，陈亮，等牛源致病性大肠埃希氏菌的实验室诊断 现代畜牧科技，（）：，（）：张婷 犊牛大肠杆菌病症状及诊治探析 中国畜禽种业，（）：许文婷 牛沙门氏菌病的病原学及综合防治 养殖与饲料，（）：张思国一起牛魏氏梭菌病的诊断与防治甘肃畜牧兽医，（）：刘嘉琳，刘东旭，董文龙，等猪大肠杆菌、沙门菌及产气荚膜梭菌的多重实时荧光定量 检测方法的建立及应用 中国兽医学报，（）：冯育芳，王莎莎，邢进，等实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量 方法的建立中国比较医学杂志，（）：王艳萍，董林，郭时金，等 禽源致病性大肠杆菌毒力岛 动物医学进展 年第 卷第期（总第 期）基因 荧光定量 检测方法的建立与应用 中国兽医科学，（）：魏昭，梁勃，吴蕊，等荧光定量 检测食品中沙门氏菌研究 食品安全导刊，（）：郑萍，毛怡心，陈西平，等水中产气荚膜梭菌的荧光定量 检测法环境与健康杂志，（）：戴陈伟，童琳，武昌俊，等 实时荧光定量 技术快速检测志贺氏菌食品安全质量检测学报，（）：，（.，；.，；.，）：，：；高睿等：致牛腹泻种细菌多重荧光定量 检测方法的建立及应用