中国福氏志贺菌前噬菌体分布与基因组进化研究_梁俊容.pdf

*实验研究*中国福氏志贺菌前噬菌体分布与基因组进化研究梁俊容，金东，杨晶，卢珊，熊衍文，叶长芸，徐建国摘要：目的前噬菌体是细菌基因组中重要可移动原件，在细菌毒力和宿主适应性方面发挥着重要作用。由噬菌体介导的福氏志贺菌血清型转化频繁发生，给志贺菌的监测、诊断和预防工作带来不便。为了探究我国福氏志贺菌基因组进化与其前噬菌体相关的血清型别转换之间的关系，利用生物信息学方法将前噬菌体在福氏志贺菌基因组中的分布与进化进行关联分析。方法在中国 17 省（市、自治区）选取的 294 株福氏志贺菌具有丰富的血清型多态性。通过比较不同血清型福氏志贺菌基因组中原噬菌体及血清型转换噬菌体的覆盖度，统计分析其分布规律。结果部分菌株可携带多种前噬菌体，同一种前噬菌体也可分布在不同血清型菌株中；部分菌株虽携带血清型转换噬菌体却并未发生血清型转换事件。不同血清型转换噬菌体在福氏志贺菌进化树中成簇出现，表明该部分菌株出现了血清型集中转换现象。结论本研究有助于揭示前噬菌体的遗传多样性及与福氏志贺菌进化和血清型变异之间的关系，对预防和控制志贺菌的感染具有重要意义。关键词：福氏志贺菌；噬菌体；血清型转换；细菌基因组；进化中图分类号:R211;R378.2文献标志码:A文章编号:10039961（2023）05051606ProphagesdistributionandgenomeevolutionofShigellaflexneriinChinaLiang Junrong,Jin Dong,Yang Jing,Lu Shan,Xiong Yanwen,Ye Changyun,Xu Jianguo.Institute for Infectious Disease Control and Prevention,Chinese Center for DiseaseControl and Prevention,Beijing 102206,ChinaCorresponding authorCorresponding author:Xu Jianguo,Email:Abstract:ObjectiveProphageisoneofthemobilegeneticelementscarriedonbacterialgenome,whichplaysanimportantroleinbacterialvirulenceandhostadaptability.Phage-mediatedserotypeconversionoccursfrequently,whichbringsinconveniencetothesurveillance,diagnosisandpreventionofShigella.Inordertoexploretherelationshipbetweentheserotype-convertingphagesofShigella flexneriandgenomeevolution,weanalyzedcorrelationbetweenthedistributionofprophageandthephylogenetictreeofShigella flexneri.MethodsIntotalof294Shigella flexneriwithdifferentserotypesfrom17provincesinChinawereselected.Wecomparedthecoverageofprophagesandserotype-convertingphagesinthedifferentgenomeofShigella flexneri.Correlationanalysisweredidaboutthephagedistributioninphylogenetictree.ResultsTheresultsshowedthatmultiplekindsofprophageswerecarriedbyShigella flexneri,andthesameprophagemaydistributedindifferentserotypestrains.Somestrainscarriedbacteriophageswithoutserotype-convertingevents.Thebacteriophagesappearedinclustersintheevolutionarytree,indicatingaconcentratedserotype-convertingevents.ConclusionWeindicatedthecloserelationshipbetweenserotype-convertingphagesandtheevolutionofShigella flexneri.OurresearchisofgreatsignificanttopreventandcontrolShigellainfection.Keywords:Shigella flexneri;Prophage;Serotypeconversion;Bacterialgenome;EvolutionThisstudywassupportedbyNationalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina(No.2021YFC0863400,No.2021YFC2302000)andtheUnknownBacterialDiscoveryandFunctionResearchUnit(No.2018RU010)福氏志贺菌是发展中国家引起细菌性痢疾的主要病原菌。根据其表面 O-抗原结构的差异，可将其分为 20 余个血清型，包括 1a、1b、1c、1d、2a、2b、2variant、3a、3b、4a、4av、4b、5a、5b、Y、Yv、X、Xv、6 和 7b 等12。在世界范围内，不同地区流行血清型具有一定的地域性分布特征。福氏志贺菌的糖基转移酶（Glucosyltransferases,Gtrs）和 O-乙酰转移酶，共同决定着血清型的不同。除血清型 6 外，其他O 抗原具有共同的四糖骨架重复单元（即 Y 血清型结构）：由 1 个 N-乙酰葡萄糖胺和 3 个鼠李糖构成3。四糖骨架中特定糖的糖基化、乙酰化、磷酸乙醇胺化修饰决定了福氏志贺菌的特异性抗原决定簇，导致基金项目：国家重点研发计划项目（No.2021YFC0863400，No.2021YFC2302000）；未知细菌发现与功能研究（No.2018RU010）作者单位：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京102206作者简介：梁俊容，女，湖南省娄底市人，博士，主要从事肠道致病菌研究，Email：通信作者：徐建国，Tel：[phone]，Email:收稿日期：20230106网络出版日期：20230427516疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202301060564了其血清型的多样性。其中 O-抗原的糖基化和乙酰化修饰是由血清型转换噬菌体所介导，而磷酸乙醇胺化是由质粒（pSFxv-1）所介导46。许多已测序的细菌基因组中都整合有前噬菌体的序列。并且一个细菌基因组中整合多个前噬菌体的序列的现象也不少见。噬菌体在感染宿主菌后，引起的溶原菌（宿主菌）表型的改变，称为溶原转换。包括溶原菌理化表型、血清型及致病型等的改变。这种特性是溶原菌逃避宿主免疫系统，引起致病性增强的一个重要的方面。由噬菌体介导的血清型别转换在细菌性传染病病原体中多有出现，如沙门菌的抗原结构和血清型别都与溶源性转换有关7。迄今为止，已经报道的福氏志贺菌血清型转换噬菌体有 6 种：SfI、SfII、Sf6、SfIV、SfV 和 SfX1,89。不同的志贺菌血清型转换噬菌体携带不同的 O-抗原修饰基因 rfb、oac 和 gtr10。除噬菌体 Sf6 外，其他噬菌体均携带由 gtrA、gtrB 和 gtr 组成的基因簇，gtr基因编码特异性葡萄糖基转移酶（Gtr），介导葡萄糖基以不同的连接方式添加到 O-抗原四糖重复单位的不同糖基上导致血清型的转换。从而使得志贺菌逃避宿主的免疫和排斥其他噬菌体的侵入并维持 O 抗原的多样性4,9,11。目前不同血清型转换噬菌体与福氏志贺菌基因组中进化关系情况仍不十分清楚。为探究我国福氏志贺菌遗传多态性形成的分子机制，本研究利用生物信息学方法对 294 个中国福氏志贺菌基因组中整合的前噬菌体序列进行分析，尤其对血清型转换噬菌体的分布规律进行了研究，揭示福氏志贺菌的血清型流行变异规律及基因组进化之间的关系。1材料与方法1.1福氏志贺菌的选取及全基因组序列的测定挑选了 294 个有代表性的福氏志贺菌，来自中国 17 省（市、自治区），分离时间跨度长达 40 余年，其中还包 括 34 个 动 物 来 源 的 福 氏 志 贺 菌。使 用WizardGenomicDNA 纯化试剂盒（Promega，USA）提取细菌基因组 DNA。使用 NexteraXT 文库准备试剂盒（Illumina，USA）进行文库准备。最后在Illumina/Solexa 平台上进行二代测序，测序深度为100。1.2原噬菌体预测将测序完成后的福氏志贺菌双端原始序列使用 FastQC 进行质量控制，使用fastp 软件去除短读长及低质量数据12。使用Spades3.13.0 对高质量 reads 进行组装13。组装得 到 的 contigs 使 用 PHASTER在 线 预 测 软 件（http:/phaster.ca/）对其中的前噬菌体序列进行识别、预测和注释14。综合分析得到的溶原性噬菌体基因组结构，整合位点信息。1.3原噬菌体分类针对预测得到的完整型噬菌体序列，使用 blast 与 PhageGenome 的数据库进行比对和注释，挑选最优的比对结果作为噬菌体的最终注释结果15。对比 PHASTER 网站结果对原噬菌体进行初步分类。选取预测出的每一个原噬菌体相似性最高的噬菌体，作为该菌株预测到的一种噬菌体类型，统计所有完整性原噬菌体所对应的最相似噬菌体种属及数目，并用 R 软件作图。1.4福氏志贺菌系统发育树构建及与志贺菌血清型转换噬菌体的分布下载参考基因组 Shigella flexneri2002017（GCA_000022245.1），使 用 Snippy 软 件提取 294 株福氏志贺菌单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP）序列文件，在RAxML软件中进行最大似然法（Maximumlikelihood,ML）系统发育树的构建（Bootstrap1000）。使用iTOL（https:/itol.embl.de/）对进化树进行美化。构建了本地的志贺菌相关噬菌体基因组数据库。使用基因短序列比对软件 BWA对噬菌体参考数据建立索引。将质控后的福氏志贺菌基因组双末端序列与其进行比对。统计每个菌株对噬菌体基因组比对情况及覆盖度，比较噬菌体在不同血清型菌株中的分布差异。挑选主要的志贺菌噬菌体序列，使用 R 软件的 pheatmap 包对噬菌体覆盖度表格绘制聚类热图，并对应到进化树中。2结果2.1中国福氏志贺菌株特征选取的 294 个代表性福氏志贺菌血清型分布极为丰富。以我国早期最主要的血清型 2a、2b 及 2001 年在中国新发现的Xv 血 清 型 菌 株 占 多 数，比 例 分 别 为 18.71%、16.67%和 31.63%。各血清型在 17 个省（市、自治区）的分布非常复杂，各地区均出现多种血清型共存的现象。尤其以河南省的血清分布最为多样（表 1）。2.2不同血清型福氏志贺菌前噬菌体分布PHASTER2软件对 294 株福氏志贺菌进行噬菌体预测，一共预测得到 819 条前噬菌体序列。根据比对和注释结果，挑选最优的比对结果作为前噬菌体的最终注释结果，一共有 783 个有注释结果的前噬菌体。对所有前噬菌体序列的注释信息进行汇总，一共得到45 个非冗余的噬菌体注释信息（其中与志贺菌相关的噬菌体为 27 个），统计这 45 个噬菌体在 294 株不同血清型福氏志贺菌中的数量和分布情况并绘制分布热图（图 1）。从所有前噬菌体数量分布热图可以发现，Enterobacteria phage P4 噬菌体除血清型疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5517www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.2023010605641b 菌株外，普遍存在于其他血清型的菌株中，ShigellaphageSfII 噬菌体则主要分布在 2a 和 2b 血清型的菌株中；EnterobacteriaphageSfI噬菌体则主要分布在1a 和1b、1d 血清型的菌株中；Enterobacteria表 1不同省(市、自治区）挑选的福氏志贺菌血清型分布Table1SerotypesdistributionofShigellaflexnerifromdifferentprovinces血清型省份总计安徽 北京 福建 甘肃（动物菌株人菌株）贵州 黑龙江 河南 湖北 江苏 辽宁 青海 陕西 上海 山西 四川 西藏 浙江1a2114011151147381b223181d12142a41454441713161552b2221501281327311503a02213194a114av114b117b11X202121118Xv1235815322212331111193Y101147Y-gtrI11Y-gtrII1113Yv11Yv-gtrII123合计2581360（3426）111491694153127232294注：-.表示该省（市、自治区）没有分离到该血清型菌株注：热图顶端颜色标签按照 294 株福氏志贺菌不同的血清型划分。热图内部颜色代表菌株中含有右侧噬菌体的个数，具体个数见左侧颜色标尺图1不同血清型福氏志贺菌前噬菌体分布Figure1DistributionofprophagesamongShigellaflexneriwithdifferentserotypes518疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202301060564phageIME10，EscherichiaphageHK75和 Enteroba-cteriaphageSf6噬菌体主要分布在 X 和 Xv 血清型的菌株中；EnterobacteriaphagemEp235噬菌体主要分布在 2b 血清型菌株中（图 1）。2.3不同血清型菌株中福氏志贺菌相关噬菌体分布挑选27 个志贺菌相关噬菌体基因组进行前噬菌体分布分析，统计其在各血清型福氏志贺氏菌基因组中携带的数目。结果显示：X、Xv 和 2b 血清型菌株以含有 EnterobacteriaphageSf6 噬菌体为主；2b 血清型菌株还含有较多 Stx1convertingphage 和 ShigellaphageSfII 噬菌体；而 2a 和 2b 以及 3a 血清型菌株则也以含有 ShigellaphageSfII 噬菌体为主；1a 和 1b以及 1d 血清型菌株则以含有 EnterobacteriaphageSfI 噬菌体为主（图2）。此外，发现18 株2a 血清型福氏志贺氏菌，虽然携带抗原修饰基因 gtrII，却没有检测到参与转换的前噬菌体 ShigellaphageSfII 序列。2.4血清型转换噬菌体与福氏志贺菌基因组进化关系从分子层面分析了我国福氏志贺菌基因组中所携带的前噬菌体与基因组进化之间的关系。294 个福氏志贺菌基因组共分为 3 个大的聚类簇（cluster1、cluster2、cluster3）。cluster3 是中国流行的主要分支，主要包括 2a、1a、X 血清型及中国2000 年后新发现并流行的 Xv 血清型。不同分支携带的血清型转换相关的原噬菌体不一样。一部分菌株存在携带多种前噬菌体情况。尤其是 cluster2 的动物来源志贺菌携带的相关噬菌体最为丰富，该分支簇中 11 株 2b 血清型动物来源菌株同时集中携带 7 种前噬菌体：sfx、ShigellaphageSfII、ShigellaphageSf6、EnterobacteriaphageSfV、EnterobacteriaphageSfI、EnterobacteriaphageSf6、EnterobacteriaphageSf101。22 株 cluster3 的 1a、1d 血清型菌株同时携带 3 种前噬菌体：ShigellaphageSfII、EnterobacteriaphageSfV、EnterobacteriaphageSfI。cluster1 的 3 个 3a 血清型菌株同时携带两种前噬菌体：EnterobacteriaphageSfV 和 EnterobacteriaphageSfI。前噬菌体 sfx 在国内分布最为广泛，主要存在于 cluster3 的 X、1d、Xv、3a、2b 和个别1a 血清型菌株，携带率分别为 100.00%、100.00%、96.79%、70.00%，53.33%和 5.00%；在进化树中，sfx 在上述血清型菌株中成簇出现，表明该部分菌株出现了血清型集中转换现象（图 3）。此外cluster2 的 11 个动物 2b 血清型菌株中也集中存在前噬菌体 sfx（73.33%）；Enterobacteria_phage_SfI主要集中存在 cluster2 的动物 2b 血清型菌株（100.00%）及 cluster3 的 1a 血清型菌株中（84.62%）；Shigella_phage_SfII 主要存在 cluster2 的 4a、4av（100.00%）和动物 2b（100.00%）血清型菌株中。此外，Shigella_phage_SfII 还存在于 cluster3 的1a 血清型菌株中（79.49%）；Enterobacteria_phage_SfV 存在 cluster3的 1a、1d 血清型菌株中（携注：热图顶端颜色标签按照 294 株福氏志贺菌不同的血清型划分。热图内部颜色代表菌株中含有右侧噬菌体的个数，具体见左侧颜色标尺图2不同血清型福氏志贺菌基因组中志贺菌相关前噬菌体分布Figure2DistributionofShigellaassociatedprophagesamongShigellaflexneriwithdifferentserotypes疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5519www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202301060564带率分别为 43.90%，50.00%）以及 cluster1 的 11 个动物 2b 血清型菌株中（73.33%）和 cluster1 的 3 个3a 血清型菌株中（100.00%）；Shigella_phage_Sf6 仅存在 cluster2 的 1 个4b 血清型菌株中（图 3）。3讨论福氏志贺菌血清型转换噬菌体所介导的 O-抗原的糖基化和乙酰化修饰是引起血清型转换的主要原因3。噬菌体通过周期性、选择性、特异性与O 抗原结合有助于维持 O 抗原的多样性16，使得不同的克隆群在细胞表面结构出现差异，进而在它们的生态位进行优势选择。本研究中发现，不同血清型转化噬菌体在进化树中成簇出现，表明了周期性集体转化事件的发生。cluster2 的部分动物菌株中的噬菌体携带率及携带数目高于人来源的菌株，也可能与这部分动物来源的菌株面临更多的选择压力有关。据报道，血清型转换噬菌体 Sfl 通过感染 Y、3b、1a 和 X 血清型菌株，介导血清型分别转换为1a、1b、1c 和 1d17。噬菌体 SfV 介导福氏志贺菌血清型 Y 转变为血清型 5a18。噬菌体 Sf6 使福氏志贺菌血清型 6 转变成血清型 3b，血清型X转换为3a，Y转换为3b，1a 转换为 1b，4a转换为 4b5。噬菌体 SfII 可使血清型 1b 和 Y 转换为 2a，X 转换为2b8。噬菌体 SflV 可以使福氏志贺菌血清型 Y 分别转变成血清型 4a19。噬菌体 SfX 参与血清型x 的葡萄糖基化过程，将 Y 分别转变成血清型 X，血清型 X 经磷酸乙醇胺化修饰转换成 Xv20。研究中也证实了上述转化规律，在相应的血清型菌株中，通过全基因组序列分析发现了其血清转换噬菌体的存在。但是部分前噬菌体的携带情况并不仅限于上述参与转换后的血清型菌株中，例如 SfV 可存在于1a、2b 血清型菌株中；Sfl 还可存在于 2b 血清中；SfII 不仅在 2a、2b 血清型中存在，还存在于部分4a、4av、2b、1a 血清型菌株中。这些福氏志贺菌虽注：最内圈表述菌株宿主信息，第二圈表示菌株血清型分类。外圈热图由外向内分别表示噬菌体 sfx、Stx2-converting_phage_86、Stx2-converting_phage_1717、Stx1_converting_phage_DNA、Shigella_phage_Ss-VASD、Shigella_phage_SfII，Shigella_phage_Sf6、Shigella_phage_SHSML-45、Shigella_phage_POCJ13、Shigella_phage_75_02_Stx、Enterobacteria_phage_SfV、Enterobacteria_phage_SfI、Enterobacteria_phage_Sf6 及 Enterobacteria_phage_Sf101 在福氏志贺菌基因组的比对相似度图3福氏志贺菌进化树与前噬菌体分布情况Figure3Maximumlikelihoodtreeofthe294isolatesanddistributionofprophages520疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202301060564然携带血清型转换的噬菌体，却并未将噬菌体的抗原修饰基因整合进入相应的血清型菌株基因组中，因此，未发生血清型转换。此外，在本研究中发现了18 株福氏志贺菌携带抗原修饰基因却没有检测到参与转换的前噬菌体序列，这说明部分菌株在发生完血清型转换后，血清型转换噬菌体脱落未整合到基因组中，只保留了部分抗原修饰基因。大部分福氏志贺菌基因组中除了含有血清型转换相关的噬菌体外，还含有其余肠杆菌科前噬菌体序列，更进一步证实了志贺菌在起源和进化与大肠埃希菌的密切关系，提示该肠杆菌科噬菌体可能在福氏志贺菌进化过程中起到了关键作用。在细菌进化过程中，为了逃逸宿主免疫识别，血清型转换不会仅仅出现一次。本研究发现大部分菌株同时携带有多种噬菌体。携带多种前噬菌体一方面可以导致血清型进一步分化，增加菌株基因组多态性，另一方面部分前噬菌体可以影响宿主菌毒力及侵袭力，从而使其在生态位中更具选择优势。综上所述，本研究对福氏志贺菌基因组中前噬菌体及血清转换噬菌体分布及进化进行研究，揭示了噬菌体家族在福氏志贺菌基因组中的遗传多样性，对中国福氏志贺菌进化规律研究及防控具借鉴意义。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突参考文献YeCY,LanRT,XiaSL,etal.Emergenceofanewmultidrug-resistant serotype X variant in an epidemic clone of ShigellaflexneriJ.J Clin Microbiol,2010,48（2）:419 426.DOI:10.1128/JCM.0061409.1MacphersonDF,MoronaR,BegerDW,etal.Geneticanalysisofthe rfb region of Shigella flexneri encoding the Y serotype O-antigen specificityJ.Mol Microbiol,1991,5（6）:1491 1499.DOI:10.1111/j.13652958.1991.tb00795.x.2罗霞,孙强正,徐建国.福氏志贺菌 O-抗原修饰及血清型转换机制研究进展J.中华流行病学杂志，2013，34（7）：750753.DOI：10.3760/cma.j.issn.02546450.2013.07.021.Luo X,Sun QZ,Xu JG.O-antigen modification and serotypeconversion of Shigella 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Surveill,2023,38（5）:516521.DOI:10.3784/jbjc.202301060564（本文编辑：杨小平）疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5521www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202301060564