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微生物的检验与检测
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生命科学学院 09级生物工程班
【摘要】水的微生物学检验，特别是肠道细菌的检验，对保证饮用水安全和控制传染病有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
水的微生物检查通常包括两个项目：细菌总数和大肠菌群测定。
所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit，CFU)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。
所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
【关键词】细菌 大肠菌群 微生物检验 微生物检测
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是卫生领域用语。大肠菌群包括了大肠艾希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
　　大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
　　大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（琼脂为1.5%）；乳糖蛋白胨培养液(g/L)：蛋白胨 10，牛肉膏 3，乳糖 5，氯化钠 5，溴甲酚紫 0.016，pH 7.3伊红美蓝培养基(g/L)：蛋白胨 10，乳糖 10，磷酸氢二钾 2，2%伊红水溶液 20ml，0.5 %美蓝水溶液 13ml ，琼脂 20，pH 7.2
1.1.2 实验用品：水样采集器（灭菌处理），Eppendorf离心管，Tips，微量加样枪，无菌水，250ml三角瓶（灭菌处理），灭菌培养皿
1.1.3 标准菌株：标准大肠埃希氏菌与沙门氏杆菌斜面培养物，经实验十一鉴定为大肠菌群的斜面培养物
1.1.4 抗血清：兔抗沙门氏菌、大肠埃希氏菌菌体的抗血清(委托公司制备)
1.2 水样采集
1.2.1 采月湖水的采集：用ETC-1A采水器采集0.5-1米水深样品，然后置于灭菌三角瓶待分析。
1.2.2 采集疑似大肠菌群较多的水源，方法同上。(南京外国语学校仙林分校北门口河水)
1.3 样品处理
1.3.1 池水的稀释：在灭菌离心管中取100μL池水加900 μL无菌水，混匀，制备10-1的稀释液。原液和10-1的稀释液用于平板计数。
1.3.2 根据南京外国语学校仙林分校北门口河水水样的污染程度将水样稀释成10-1、10-2稀释度。
1.3.3 抗体的制备：选择健康的兔子作为抗血清制备动物。注射灭活的抗原菌液（浓度约为109/mL，第1次耳缘静脉注射0.2 mL，以后每隔2d注射1次，抗原注射量依次为0.4 、0.6、1、2 和2mL等。取血，分离血清，测其凝集效价。若效价符合要求后，取兔血，待血凝后，离心分离出血清，装入灭菌的血清瓶中并加入0. 01%硫柳汞（防腐剂），-20度保存，备用。
1.4 样品的平板操作
1.4.1 池水样(每组5块平板)
取原液和10-1稀释度的水样各1ml放入培养皿内，倾注15mL融化后冷却的牛肉膏蛋白胨培养基，立即在桌面作平面旋摇。注意样品与培养基混合时，可将皿底在平面上先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转，使其充分混匀。旋转时小心，不要使混合物溅到皿边上方。每个稀释度做2个平皿，然后置于37℃倒置培养。
另取一无菌培养皿，倾注15mL牛肉膏蛋白胨培养基作为整个检测试验的空白对照。
1.5 大肠菌群的检测（多管发酵法）
1.5.1 初发酵检测（乳糖蛋白胨液体培养基 ）

1.5.2 平板分离
将24h培养产酸产气的发酵管内的培养物分别划线接种于伊红美兰琼脂平板上，37℃培养18-24h，将符合下列特征的菌落的一小部分进行涂片作革兰氏染色并镜检。
①深紫黑色、有金属光泽；
②紫黑色、不带或略带金属光泽；
③淡紫红色，中心颜色较深。
伊红和美蓝可抑制G+生长；不发酵乳糖的细菌菌落无色透明；能发酵乳糖，产酸力弱，菌落为棕色；发酵乳酸，产酸能力强，菌落紫色，有绿色金属闪光。

1.5.3 革兰氏染色观察
将阳性结果的菌落取部分涂片，进行革兰氏染色，观察结果。
阳性结果的标准：革兰氏阴性，且无芽孢。
1.5.4 复发酵确认
将革兰氏阴性无芽孢的菌落接种于乳糖蛋白胨液体培养基中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1～2个，37度培养24小时，观察结果。
阳性结果的标准：发酵液变为黄色
杜氏小管内有气泡
1.6 大肠杆菌和沙门氏菌的血清学检验
1.6.1 菌悬液的制备
在离心管中加入100μl生理盐水。用接种环刮取平板上的菌苔于离心管中。用枪头反复吹吸，使菌液混匀。
1.6.2 大肠杆菌、沙门氏菌抗原性检测
事先将干净载玻片做上标记，取10倍稀释的大肠杆菌抗血清和沙门氏菌抗血清，各40μL于载玻片上。然后，分别加入大肠杆菌和沙门氏菌的菌悬液各40μ L。放置于空培养皿中，于37度保温15-20min。温育后，检查是否有颗粒状沉淀。
实验示意图：

2 结果
2.1 菌落计数
菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units, CFU)计数。
2.1.1 平皿菌落数的选择：先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不宜采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的面积大小不足平板的一半，而其余的一半平板菌落分布又比较均匀，则可将此一半的菌落数乘以2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
2.1.2 稀释度的选择

2.1.3 菌落数的报告
菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以4舍5入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示（见表中报告方式栏）
*若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
附：稀释度选择和菌落报告数方式

平板菌落分布图

菌落总数统计表
水样
不同稀释度的平均菌落数
菌落总数
（CFU/mL）
报告方式
（CFU/mL）
未稀释

10-1
采月湖湖水
62(63，60)
7(6，8)
62
62
结论：采月湖水符合国家水源标准
2.2 查表计数
根据三个梯度（即三个取水样的体积）每5管中出现阳性结果的管数，查阅《GB/T 5750.12-2006 生活饮用水标准检验方法 微生物指标》
总大肠菌群MPN（Most Probable Number）检索表，得到大肠菌群5次重复测试统计表的细菌最可能数，再乘以相应稀释倍数，即可换算为100mL水样中的大肠菌群数。
附：MPN计数法
最大可能数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大可能数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。

本次实验的检测数据（每升水样中大肠菌群数量）
取水样的体积
（mL）

原液
1mL/管

10-1稀释度

1mL/管

10-2稀释度
1mL/管
管数
5管
5管
5管
阳性管数
5管
5管
5管
菌数近似值
>16000
饮用水、水源水、游泳池水卫生的国家标准
饮 用 水 1L水不得超过3个
准备加氯消毒后供饮用的水(水源水) ≤1000
准备净化处理及加氯消毒后供饮用的水(水源水) ≤10000
游泳池水 ≤100
结论：南京外国语学校仙林分校北门口河水中大肠杆菌群数极多，超过国家水源标准

初发酵检测结果 复发酵检测结果

划线平板分离 革兰氏染色
2.3 大肠杆菌和沙门氏菌的血清学检验

抗原性检测结果
3 讨论
3.1 MPN检索表：
　　MPN 为最大可能数(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列进行稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最近似的数值。
　　MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。注意国家标准和行业标准中所附MPN表所用稀释度是不同的，而且结果报告单位也不相同。
3.2初发酵和证实试验：
　　无论是国家标准的三步法还是行业标准的两步法，都利用了乳糖发酵管进行了两次发酵试验，培养基的配制略有不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
　　初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
3.3挑选菌落：
　　国家标准中，需要对初发酵阳性培养物接种伊红美蓝平板分离，对典型和可疑菌落进行观察和证实试验。由于大肠菌群是一群细菌的总称，在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。国家标准方法规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时，检出率最高；红色、粉红色菌落检出率较低。
另外，挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。
3.4 已证实水体中存在大肠菌群，但在实验中大肠杆菌血清与待测菌株未能产生凝集反应，原因可能在于该大肠菌群中所含的菌与该大肠杆菌血清不具特异性，所以不能产生凝集反应。
【参考文献】
[1]《GB/T：4789.2-2010中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验-菌落总数测定》.
[2]《GB/T：4789.3-2010中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验-大肠菌群计数》.
[3]《GB/T：5750.12-2006生活饮用水标准检测方法-微生物指标》.
[4] 张英,张志伟.大肠菌群检测中应注意的几个问题探讨[J].现代测量与实验室管理,2009(03):35—36.