猪Caskin1基因生物信息学分析_高锦春.pdf

2023(15):51-56,132-133畜牧科学收稿日期:2022-09-15;修回日期:2023-05-19基金项目:国家自然科学基金项目(31802063);河北省自然科学基金项目(C2020204058);河北农业大学引进人才科研专项(ZD201718)作者简介:高锦春(1995 ),男,硕士研究生,研究方向为畜禽遗传资源保种与利用,18634900586 .通信作者:陶晨雨(1988),女,副教授,博士,硕士生导师,研究方向为动物基因表观修饰和生殖衰老,taochenyuty .DOI:10.13881/ki.hljxmsy.2022.09.0109 猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪猪 C C C C C C C C C C C C C C C Ca a a a a a a a a a a a a a a as s s s s s s s s s s s s s s sk k k k k k k k k k k k k k k ki i i i i i i i i i i i i i i in n n n n n n n n n n n n n n n1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 基基基基基基基基基基基基基基基基因因因因因因因因因因因因因因因因生生生生生生生生生生生生生生生生物物物物物物物物物物物物物物物物信信信信信信信信信信信信信信信信息息息息息息息息息息息息息息息息学学学学学学学学学学学学学学学学分分分分分分分分分分分分分分分分析析析析析析析析析析析析析析析析高锦春,史佩华,崔浩亮,张新博,赵顺然,陶晨雨(河北农业大学 动物科技学院,河北 保定 071000)中图分类号:S828;Q343 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2023)15-0051-08摘 要:为了分析猪钙/钙调素依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)相互作用蛋白 1(Caskin1)基因和编码蛋白的结构与功能,并探讨其在改善生殖衰老中的潜在可能性,试验首先获取猪 Caskin1 基因及其蛋白序列,采用生物信息学分析方法对 Caskin1 基因编码蛋白的理化性质、磷酸化位点、高级结构、相互作用网络和保守基序等进行研究,构建猪 Caskin1 基因系统发育树,分析该基因的组织表达谱。结果表明:猪 Caskin1 基因编码序列(CDS)长度为 4 359 bp,可编码 1 452 个氨基酸;猪 Caskin1 蛋白的分子量为 151 782.89 u,理论等电点为 9.21;其二级结构以无规则卷曲结构(61.16%)为主,为不稳定亲水性蛋白,不存在信号肽,没有跨膜结构;猪 Caskin1 基因为保守基因,其编码蛋白的 SH3 结构域是高度保守结构域,且该蛋白质与 CASK、SYT7、NSF、CADPS、P14K2A、DPYSL4 等多个蛋白质间存在相互作用;猪 Caskin1 基因与牛、羊的亲缘关系最近,与原鸡的亲缘关系最远;该基因不仅在大脑中高表达,在卵巢中的相对表达量也比较高。说明猪 Caskin1 基因及蛋白的生物学功能丰富,生物学意义较为重要。关键词:猪;Caskin1 基因;生物信息学分析;基因进化树;组织表达谱分析 开放科学(资源服务)标识码Open Science Identity(OSID)钙/钙调素依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)相互作用蛋白 1(Caskin1)是一种能够调节皮质肌动蛋白丝的多结构域支架蛋白1。支架蛋白是一种存在于信号转导过程中且本身不具备任何酶活性的蛋白质,其作用类似分子胶水,能“粘连”两个或多个功能相关的蛋白质2,支架蛋白的多结构域为其招募其他功能蛋白、组织和调节靶蛋白在靶位点的活动等提供了优势,也使支架蛋白在信号通路及相关级联反应中发挥不同功能,从而保证信号传递的特异性和功能发挥的高效性3-4。研究发现,Caskin1 只在脊椎动物中选择性存在,而在无脊椎动物中不存在,同时在大脑、脊髓的突触区域和网膜的带状突触内高表达1,5-6,说明 Caskin1 在突触转导中发挥重要的衔接作用。在医学领域,Caskin1 基因可以作为评价很多疾病预后的基因标志物,例如在肝癌细胞中,Caskin1 基因表达水平与免疫估计值和肿瘤纯度评分显著相关7。近年来对 Caskin1 基因敲除小鼠的研究发现,其缺失不仅影响小鼠的突触功能和增加疾病发生的概率,还对其空间记忆、认知学习和步调形态有很大负面影响。研究人员对抑郁症病人和自闭症小鼠的研究发现,Caskin1 的 mRNA 和蛋白质表达水平均有所改变。河北农业大学动物科技学院胚胎中心实验室前期对老龄高胎次淘汰母猪和年轻低胎次母猪卵巢颗粒细胞的蛋白质组学分析发现,与年轻低胎次母猪相比,老龄高胎次淘汰母猪卵泡颗粒细胞中 Caskin1 基因的表达量显著升高,提示其可能在因高胎次导致的母猪繁殖力下降过程中发挥重要作用。目前,关于Caskin1 基因在繁殖领域的研究报道较少,Caskin1 基因对卵泡颗粒细胞衰老的潜在调控机制尚不清楚。本试验以 Caskin1 基因为生殖衰老候选基因,对Caskin1 基因编码蛋白质的组成、结构及生物学特性进行分析,以期为进一步从分子水平研究 Caskin1 基因提供思路,同时也为研究 Caskin1 基因对生殖能力低下的影响奠定基础。152023(15):51-56,132-133畜牧科学1 材料与方法1.1 试验动物180 日龄母猪(年轻母猪)和五年以上淘汰母猪(老年母猪)各 30 头,母猪均为北京黑猪,由唐县昌鑫黑猪养殖有限公司提供。屠宰后立即采集大脑、心脏、背最长肌、肝脏、脾脏、肺脏、卵巢和子宫等组织样品装于冻存管中,于液氮中保存,运回实验室后置-80 冰箱中保存,备用。1.2 主要试剂 氯仿、异丙酮、无水乙醇,均购自天津市大茂化学试剂厂;ransScript Uni All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qRT-PCR(One-Step gDNA Removal)、TRIzol,均购自北京全式金生物技术有限公司;RNA 提取试剂盒,购自 Omega 公司;反转录试剂盒,购自宝日医生物技术(北京)有限公司。1.3 主要仪器梯度 PCR 仪,购自美国 ABI 公司;低温离心机,购自德国 Sigma 公司;荧光定量 PCR 仪,购自美国BIO-RAD 公 司;低 速 台 式 离 心 机,购 自 上 海BIORIDGE 公 司;超 微 量 分 光 光 度 计,购 自 美 国Thermo Fisher Scientific 公司;枪头、离心管,均购自美国 Crystalgen 公司。1.4 猪 Caskin1 基因引物的设计与合成根据 Ensemble 数据库中猪 Caskin1 基因(登录号为 XM_021086770.1)序列,利用 DNAMAN 软件设计 Caskin1 和 GAPDH 基因引物,引物均由苏州金唯智生物技术有限公司合成。引物信息见表 1。表 1 引物信息Table 1 Primer information基因序列Caskin1GAPDHF1 5-CCTGTCACGGGACTTCTGGC-3R1 5-TGCTGGCTCTGCTTGGCTC-3F2 5-GAAGGTCGGAGTGAACGGAT-3R2 5-CATGGGTAGAATCATACTGGAACA-31.5猪总 RNA 提取、cDNA 合成和实时荧光定量PCR 检测取适量猪组织装入含 TRIzol 1 mL 的离心管(2 mL)中,充分研磨后立即放入已预冷的 4 低温离心机中,参照 RNA 提取试剂盒说明书提取各组织总 RNA,然后使用超微量分光光度计测定 RNA 浓度,-20 保存,备用。按照反转录试剂盒说明书合成 cDNA,反应体系:5SuperMix for qRT-PCR 4 L,gDNA Remover 1 L,Total RNA 2 L,RNase-Free Water 13 L。反应程序:50 反应 5 min,85 加热5 s。以 Caskin1 基因的 cDNA 为模板、GAPDH 基因为内参基因进行实时荧光定量 PCR 扩增,反应体系(总体积为 20 L):2PerFect Start Green qRT-PCR SuperMix 10 L,0.2 mlo/L 正反引物各 0.4 L,Passive Reference Dye(50)0.4 L,cDNA 模 板2 L,无酶水 6.8 L。实时荧光定量 PCR 扩增程序:95 预变性30 s;95 变性5 s,60 退火30 s,72 延伸 30 s,共 40 个循环。共进行 3 次生物重复及 3 次技术重复,获得每个样品的 Ct 值。1.6 猪 Caskin1 基因的生物信息学分析对猪 Caskin1 基因编码序列(CDS)进行生物信息学分析,涉及的物种名称及登录号见表 2,主要生物信息学工具见表 3。表 2 物种名称及登录号Table 2 Species names and login numbers物种登录号物种登录号猪XM_021086770.1人NM_020764.4小家鼠NM_001360469.1褐家鼠NM_080690.2牛XM_024985369.1原鸡XM_015294456.4绵羊XM_042240328.1猴子XM_039478128.1山羊XM_018040658.1水牛XM_025274996.2表 3 生物信息学相关软件及功能Table 3 Bioinformatics related software and its functions软件名称网址功能ORF Finderhttps:/www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/开放阅读框分析 ProtParam https:/web.expasy.org/protparam/蛋白质理化性质分析 ProtScalehttps:/web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl#opennewwindow蛋白质疏水性预测SignalP 4.1 http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/蛋白质信号肽分析 TMHMM http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/蛋白质跨膜结构预测NetPhos 3.1https:/services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1蛋白质磷酸化位点预测SOPMA https:/npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html蛋白质二级结构预测 SWISS-MODEL https:/swissmodel.expasy.org/comparison/蛋白质三级结构预测 STRING 11.5 https:/cn.string-db.org/蛋白质相互作用网络预测 GSDS 2.0http:/gsds.gao-lab.org/基因结构保守性分析SMARThttp:/smart.embl-heidelberg.de/蛋白质结构域预测 MEMEhttps:/meme-suite.org/meme/蛋白质保守基序分析MEGAhttps:/基因系统发育树构建252023(15):51-56,132-133畜牧科学1.7 数据的统计分析 采用 2-Ct 法分析基因的相对表达量。利用Excel 2019 软件整理试验数据,采用独立样本 t 检验对组间 Caskin1 基因的表达水平进行统计学分析。P0.05 表示差异显著,P0.05 表示差异不显著。2 结果与分析 2.1 猪 Caskin1 基因序列和蛋白质的理化性质分析经 ORF Finder 在线软件预测分析后发现,猪Caskin1 基因全长为 5 824 bp,CDS 长为 4 359 bp,可编码 1 452 个氨基酸;在 93 bp 和 4 451 bp 处分别存在一个起始密码子 ATG 和一个终止密码子 TGA;碱基 A、T、G 和 C 的含量分别为 18%、15%、32%和 35%,并且猪 G+C 含量(67%)高于 A+T 含量(33%),说明猪 Caskin1 基因 CDS 的 DNA 双链比较稳定。经 ProtParam 在线软件 预 测 分 析 后 发 现,猪 Caskin1 蛋白的分子量为 151 782.89 u,理论等电点为 9.21,分子式为 C6630H10711N1969O2051S30。带负电荷的氨基酸残基数为 146 个,带正电荷的氨基酸残基数为 166 个。在 20 种必需氨基酸中,丙氨酸(Ala)和脯氨 酸(Pro)含 量 较 高,占 比 分 别 为 13.2%和13.1%;色氨酸(Trp)含量最低,占比为 0.5%。猪Caskin1 蛋白的消光系数为 67 310,体外半衰期为 30 h,体内半衰期大于 20 h;脂溶性指数为 72.38,不稳定系数为 53.08,表明猪 Caskin1 蛋白是不稳定蛋白。经 ProtScale 在 线 软 件 预 测 分 析 后 发 现,猪 Caskin1 蛋白的疏水性分值在第 165 位氨基酸处最高,为 2.144 分;在第 1 176 位氨基酸处最低,为-3.167 分;平均亲疏水性分值为-0.490 分,亲水指数小于 0,表示亲水性强,说明猪 Caskin1 蛋白属于亲水性蛋白。见图 1。图 1 猪 Caskin1 蛋白疏水性预测Fig.1 Prediction of hydrophobicity of porcine Caskin1 protein经 SignalP 4.1 在线软件预测分析后发现,猪Caskin1 蛋白的信号肽评分均低于阈值(见 132 页彩图 2A),说明该蛋白质中不存在信号肽,不是分泌蛋白。使用 TMHMM 在线软件预测分析后发现,猪Caskin1 蛋白没有跨膜结构(见 132 页彩图 2B),说明该蛋白质不属于跨膜蛋白。2.2 猪 Caskin1 蛋白磷酸化位点预测经 NetPhos 3.1 在线软件预测分析后发现,猪Caskin1 蛋白中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化(见 132 页彩图 3),其中丝氨酸磷酸化位点最多,其次为苏氨酸磷酸化位点,酪氨酸磷酸化位点最少。2.3 猪 Caskin1 蛋白高级结构预测与蛋白质相互作用网络关系分析经 SOPMA 在线软件预测分析后发现,猪 Caskin1 蛋白的二级结构包括-螺旋、-折叠、延伸链和无规则卷曲,所占比例分别为 27.96%、3.86%、7.02%和 61.16%(见 132 页彩图 4A),为混合型蛋白。经 SWISS-MODEL 在线软件预测分析后发现,三级结构与二级结构预测结果相同,见 133 页彩图 4B。经 STRING 11.5 在线软件预测分析后发现,Caskin1 与 CASK、SYT7、NSF、CADPS、P14K2A、DPYSL4 等蛋白质存在蛋白质相互作用网络关系(见133 页彩图 4C)。2.4 猪 Caskin1 基因结构保守性和蛋白质结构域及保守基序分析经 GSDS 2.0 在 线 软 件 预 测 分 析 后 发 现,猪 Caskin1 基因在各物种中的结构比较相似(见 133 页彩图 5A),说明该基因为保守基因。经 SMART 在线软件预测分析后发现,猪 Caskin1 蛋白的前端是 6 个锚蛋白重复序列,然后是 1 个 Src 同源结构域 3(SH3结构域),2 个不育 基序(SAM)结构域,1 个富含脯氨酸的区域,还有 1 个 C 端长序列,见 133 页彩图5B。6 个锚蛋白重复序列分别为 48 80,81 113,114146,147 171,188 220,220 252 位氨基酸;SH3 结构域为 281347 位氨基酸;2 个 SAM 结构域分别为 472535,541 605 位氨基酸。经 MEME 在线软件预测分析后发现,猪与牛、褐家鼠等物种所含的保守基序相同(见 133 页彩图 5C),且这些保守基序的位置和数量也大致相同,说明猪 Caskin1 蛋白为保守蛋白。第 133 页彩图 5C 中的红色区域是猪Caskin1 蛋白的 SH3 结构域,SH3 结构域的保守性预测评分最高,说明其是猪 Caskin1 蛋白高度保守的结构域。2.5 猪 Caskin1 基因系统发育树构建结果见图 6。由图 6 可知,不同物种的 Caskin1 基因 mRNA 序列同源性较高,其中猪与牛、羊的亲缘关系最近,与原鸡的亲缘关系最远。此外,牛和水牛、绵羊和山羊、小家鼠和褐家鼠、人和猴子的亲缘关系较近,说明Caskin1 基因 CDS 在同一种属动物的长期生物进化352023(15):51-56,132-133畜牧科学图 6 猪 Caskin1 基因系统发育树的构建Fig.6 Construction of phylogenetic tree of porcine Caskin1 gene 过程中具有一定的保守性。2.6 各组织中猪 Caskin1 基因表达分析结果见图 7。由图 7 可知,猪 Caskin1 基因在年轻母猪和老年母猪的各组织中均有表达,与年轻母猪比较,老年母猪大脑中 Caskin1 基因的相对表达量极显著降低(P0.05),在肝脏、脾脏、肺脏和子宫中的相对表达量显著升高(P0.05),在卵巢中的相对表达量极显著升高(P0.05),柱标表示差异显著(P0.05),表示差异极显著(P0.01)。图 7 各组织中猪 Caskin1 基因相对表达量的检测Fig.7 Relative expression levels of porcine Caskin1 gene in various tissues蛋白质分子发挥作用的重要区域,经常构成酶活性部位和其他蛋白质特异性结合的功能部位。对 Caskin1蛋白的结构域进行分析发现,在 N 端有 6 个锚蛋白重复序列,锚蛋白重复序列能与多种底物结合,参与多种生物调节过程,包括转录起始、细胞周期调节和细胞信号8,还能与一系列糖和脂质结合,从而扩展其在底物结合中的多功能性和灵活性9。此外,在医学研究领域,锚蛋白重复序列可作为一类靶向结合蛋白10-11。在锚蛋白重复序列后是一个高度保守的包含 60 个氨基酸的 SH3 结构域,在蛋白质相互作用过程中起着关键作用,且可能存在信号转导作用12-14。在体内大多数 SH3 结构域会影响其宿主蛋白质与其他蛋白质间相互作用的特异性15,例如在人类 c-Src 酪氨酸激酶中发现了 2 个自结合肽段(SBPs),其 中 第1个SBP(fSBP)片 段(248SKPQTQGLAK257)与 c-Src 酪氨酸激酶 SH3 结构域相互作用,当分离的 fSBP 螺旋构象发生改变时,极大削弱了其与 SH3 结构域结合的能力,说明 fSBP构象具有重要作用16。O.Toke 等17研究发现,人类 Caskin1 蛋白的 SH3 结构域还具有脂质结合能力。在 SH3 结构域后面是 2 个 SAM 结构域,SH3 结构域不仅能与其他相关的 SAM 结构域结合,还能与含有非 SAM 结构域的蛋白质结合,甚至与 RNA 结合,这种多功能性使它们从信号转导到转录和翻译调节的很多生物过程中发挥功能18。在 SAM 结构域后面是由约 800 个氨基酸构成的一段富含脯氨酸的 C 端长序列,其结构呈现无序性19-20,Caskin1 蛋白可以通过富含脯氨酸的区域与蛋白磷酸激酶成员 Abi 蛋白相互作用因子-2(Abi-2)19和 Nck 蛋白21的SH3 结构域结合。负责细胞间信号传递的受体酪氨酸激酶(EphB1)通过招募 Nck 蛋白与 Caskin1 蛋白结合,并将 Caskin1 蛋白的 SH3 结构域中的酪氨酸磷酸化5。因此,Caskin1 蛋白的 C 端脯氨酸区域可以介导其与其他蛋白质结合,从而发挥生物学功能。对 Caskin1 蛋白质相互作用网络的分析发现,Caskin1 蛋白与多个蛋白质存在相互作用关系,其中CASK 蛋白是在猪和小鼠睾丸的精子细胞和成熟精子的顶体区域发现的,而未在其他动物睾丸细胞中发现。精子在附睾成熟过程中获得了结合透明带、顶体反应和使卵子受精的能力,顶体反应后 CASK 蛋白被452023(15):51-56,132-133畜牧科学分解,且在附睾成熟过程中 CASK 蛋白含量降低,说明 CASK 蛋白可能在这些功能的获得过程中发挥作用22。PMCA4 蛋白是小鼠精子中主要的 Ca2+外排泵,能够调节精子运动,保持精子活力。PMCA4 mRNA 有 2 个剪接变体 PMCA4a 和 PMCA4b,在小鼠睾丸和整个附睾中都有表达,并且它们均可与 CASK蛋白结合23。在雌性发情小鼠中检测到的 PMCA4a是由输卵管和子宫囊泡分泌的,其在输卵管中的表达量要高于阴道和子宫,且用腔液孵育的精子中PMCA4a 含量增加了 3 倍24,说明在受精和胚胎发育过程中 PMCA4 蛋白发挥关键作用。研究发现,Caskin1 蛋白在老龄雌性小鼠卵巢颗粒细胞中高表达,且能与 CASK 蛋白形成复合物参与生殖调控。本试验通过实时荧光定量 PCR 技术检测了年轻母猪和老年母猪不同组织中 Caskin1 基因的表达情况,结果不同组织中均有 Caskin1 基因的表达,其中在年轻母猪大脑中的相对表达量最高,在卵巢中的相对表达量次之,在肌肉中的相对表达量最少。与年轻母猪比较,Caskin1 基因在老年母猪的肝脏、脾脏、肺脏、子宫和卵巢组织中的相对表达量均升高,说明其在卵巢衰老过程中具有潜在功能。目前,关于大脑神经中 Caskin1 基因的研究较多,认为该基因参与了大脑的很多病理过程,但其在卵巢中高表达的潜在意义还有待挖掘,对卵巢功能衰退和生殖能力下降的影响还有待验证。4 结论本试验通过对猪 Caskin1 基因 CDS 的解读,分析了其分子生物学特征及在猪不同组织中的相对表达量,结果猪 Caskin1 基因是保守基因,全长 5 824 bp,CDS 长 4 359 bp,编码蛋白为保守蛋白,分子式为C6630H10711N1969O2051S30,分子量为 151 782.89 u,理论等电点为 9.21,可编码 1 452 个氨基酸。猪 Caskin1 蛋白是一个亲水性蛋白,平均亲疏水性分值为-0.490 分,不属于跨膜蛋白,不存在信号肽,其二级结构 以 无 规 则 卷 曲 为 主,与 CASK、SYT7、NSF、CADPS、P14K2A、DPYSL4 等多个蛋白质存在相互作用。Caskin1 基因在老年母猪卵巢中的相对表达量极显著高于年轻母猪卵巢,为进一步验证 Caskin1 基因在卵巢衰老过程中发挥的功能及作用奠定了理论基础。参考文献:1 TABUCHI K,BIEDERER T,BUTZ S,et al.CASK participates in alternative tripartite complexes in which Mint 1 competes for binding with Caskin1,a novel CASK-binding protein J.J Neurosci,2002,22(11):4264-4273.2 PAWSON T,SCOTT J D.Signaling through scaffold,anchoring,and adaptor proteinsJ.Science,1997,278(5346):2075-2080.3 LEVCHENKO A,BRUCK J,STERNBERG P W.Scaffold proteins 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potential function in disease treatment and improving reproductive ageing.In the present experiment,firstly,the porcine Caskin1 gene and its protein sequence were obtained.Then,bioinformatics analysis was used to predict the evolutionary tree of porcine Caskin1 gene,and the tissue expression profile and molecular structure of the gene were analyzed.At the same time,the physicochemical properties,phosphorylation sites,advanced structure,interaction network and conserved motifs of the encoded protein were studied.The results showed that the coding region of porcine Caskin1 gene was 4 359 bp,encoding 1 452 amino acids.The molecular weight of the protein was 151 782.89 u and the theoretical isoelectric point was 9.21.The secondary structure of the protein was mainly irregular structure(61.16%).Porcine Caskin1 protein was an unstable hydrophilic protein without signal peptide or transmembrane structure.The porcine Caskin1 gene was conserved,and the SH3 domain of the protein encoded by Caskin1 was highly conserved,and the protein interacted with CASK,SYT7,NSF,CADPS,P14K2A,DPYSL4 and other pr