响应面法优化鹿茸菇液体菌种发酵配方.pdf

单灿灿，叶典章，郭宇，等.响应面法优化鹿茸菇液体菌种发酵配方J.福建农业学报，2023，38（6）：723731.SHANCC,YEDZ,GUOY,etal.ResponseSurfaceOptimizationofMediumFormulationforCultureofLyophyllum decastesJ.Fujian Journal ofAgricultural Sciences，2023，38（6）：723731.响应面法优化鹿茸菇液体菌种发酵配方单灿灿1，叶典章1，郭宇1，吴斌1，李佳欢1,2，程泳春3，孙淑静1,2，胡开辉1,2,4*，金文松1,2,4*1.福建农林大学生命科学学院，福建福州350007；2.福建农林大学（古田）菌业研究院，福建宁德352299；3.福建珍菌子生物科技有限公司，福建宁德352256；4.福建省食用菌产业技术创新研究院，福建宁德352299摘要：【目的】以提高鹿茸菇液体菌种菌丝生物量为目的，通过优化液体菌种发酵配方，制备优良液体菌种，推动鹿茸菇工厂化生产快速发展。【方法】以鹿茸菇为研究材料，采用摇瓶培养方式，通过单因素设计分析 6 种碳源、8 种氮源、10 种金属离子对鹿茸菇菌丝生长的影响。采用 Box-Behnken 响应面法进一步优化单因素筛选出的碳源、氮源与金属离子，比较分析液体菌种与固体菌种应用于鹿茸菇生产的优劣性。【结果】适合鹿茸菇生长的营养要素分别为全麦粉、花生饼粉、KH2PO4与 MgSO47H2O，营养要素间的最优配方为全麦粉 47gL1、花生饼粉 22gL1、KH2PO42.00gL1、MgSO47H2O2.00gL1，当发酵培养至第 8d 时，菌丝生物量达到最大值（32.811.10gL1），以优化配方制备的鹿茸菇液体菌种菌丝生物量较初始配方提高了 7.34 倍。在生产试验中液体菌种较固体菌种，制种时间缩短 48d，菌丝萌发时间缩短 2d，单袋产量提高 15.47%。【结论】本研究研发的液体菌种发酵配方可获得高质量的生产用种，以液体发酵方式制备鹿茸菇生产用种适合鹿茸菇工厂化生产。关键词：鹿茸菇；液体菌种；发酵配方；菌丝生物量中图分类号：S646文献标志码：A文章编号：1008-0384（2023）06072309Response Surface Optimization of Medium Formulation for Culture ofLyophyllum decastesSHANCancan1,YEDianzhang1,GUOYu1,WUBin1,LIJiahuan1,2,CHENGYongchun3,SUNShujing1,2,HUKaihui1,2,4*,JINWensong1,2,4*1.College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian350007,China;2.Edible Fungi ResearchInstitute(Gutian),Fujian Agriculture and Forestry University,Ningde,Fujian352299,China;3.Fujian Zhen Jun Zi BiologicalTechnology Co.,Ltd.,Ningde,Fujian352256,China;4.Edible Fungi Industry TechnologyInnovation Research Institute of Fujian,Ningde,Fujian352299,ChinaAbstract:【Objective】ToimprovethemyceliumbiomassofLyophyllum decastliquidseeds,high-qualityliquidseedsareprepared by optimizing the liquid fermentation formula,to promote the rapid development of industrial production ofL.decastesmushrooms.【Methods】TakingL.decastesastheresearchmaterial,theeffectsof6kindsofcarbonsources,8kindsofnitrogensources,and10kindsofmetalionsonthemyceliumgrowthwereanalyzedbysingle-factordesign.Thecarbonsource,nitrogensource,andmetalionsscreenedoutbysingle-factordesignwerefurtheroptimizedbytheBox-Behnkenresponsesurfacemethod,andtheadvantagesanddisadvantagesofliquidseedsandsolidseedsintheproductionofL.decastesmushroomswerecompared.【Results】ThenutritionalelementssuitableforthegrowthofL.decasteswerewholewheatflour,peanutmeal,K2HPO4,andMgSO47H2O,andtheoptimalformulawaswholewheatflour47gL1,peanutmeal22gL1,K2HPO42.00gL1,MgSO47H2O2.00gL1.Whenthefermentationculturereachedthe8thday,thedrycellmass(DCM)was收稿日期：20220312初稿；20221206修改稿作者简介：单灿灿（1994），女，硕士研究生，研究方向：食用菌工厂化栽培（E-mail：）*通信作者：胡开辉（1962），男，教授，研究方向：食用菌的应用、开发与工厂化栽培（E-mail:H）；金文松（1983），男，博士，副研究员，研究方向：食药用真菌次级代谢产物合成途径解析（E-mail:）基金项目：国家自然科学基金项目（81803667）；中国博士后科学基金面上项目（132300346）；福建省科技厅对外产业化合作项目（2020I1008）；中央引导地方科技发展资金项目（2022L3005）福建农业学报2023，38（6）：723731http:/Fujian Journal of Agricultural Sciencesdoi:10.19303/j.issn.1008-0384.2023.06.01132.811.10 gL1.Compared with the DCM by the initial formula,the DCM prepared with the optimized formula wasincreasedby7.34times.Comparedwithsolidseeds,theproductiontimeofliquidseedswasshortenedby48days,thetimeofmycelium germination was shortened by 2 days,and the yield per bag increased by 15.47%,in industrial production.【Conclusion】Theliquidfermentationformuladevelopedinthisstudycanobtainhigh-qualityproductionseeds,andtheliquidfermentationstrategyforthepreparationofseedsissuitablefortheindustrialproductionofL.decastesmushrooms.Key words:Lyophyllum decastes；Liquidseeds；Liquidfermentationformula；Myceliumbiomass0引言【研究意义】鹿茸菇，学名荷叶离褶伞Lyophyllumdecastes(Fr.)Singer1，是一种珍稀的药食两用型高等真菌。鹿茸菇口感爽脆、味道清淡，备受老百姓的喜爱，成为“网红菇”2。国内市场对于鹿茸菇的巨大需求，推动了鹿茸菇产业的快速发展，使其成为继金针菇、杏鲍菇、真姬菇、双孢蘑菇之后的新型食用菌工厂化栽培品种，生产基地主要聚集于上海、江苏、浙江、福建等地相关食用菌企业。菌丝培养阶段在整个食用菌栽培过程中十分重要。鹿茸菇菌丝在栽培基质中萌发时间长，抗杂菌能力弱3，易发生有害菌侵害，污染率高，后期出菇产量低甚至不出菇4。目前鹿茸菇工厂化栽培多以固体菌种为主，传统固体菌种存在萌发时间长、制种周期长、菌龄不一致5、污染率高等弊端，而液体菌种培养工序简单6，扩繁迅速，短时间内可达到一定的生物量79，菌球更易分散，菌丝萌发快10。液体菌种较固体菌种更适用于鹿茸菇工厂化生产，因此急需开展鹿茸菇液体菌种配方优化研究。【前人研究进展】第二次世界大战期间，为了满足对抗生素的大量需求，发酵罐制造业开始兴起，同时解决了液体深层发酵的供氧问题，奠定了现代发酵工业的基础。Humfeld11首 次 使 用 液 体 深 层 发 酵 技 术 成 功 制 备 Agaricucampestris 菌丝体。随着发酵工程理论知识与实践经验的不断积累，液体深层发酵技术现已广泛应用于大多数食用菌品种5（除混合种出菇类型，如银耳）生产用种的制备。与固体菌种相比，液体菌种优势更明显，应用前景更广阔12，制备工艺具备完全替代固体菌种的潜能。关于鹿茸菇方面的研究主要聚焦于鹿茸菇菌丝在平板培养基上的生物学特性，包括不同碳源、氮源、金属离子、生长素对鹿茸菇平板菌丝生长的影响1314，摇瓶试验分析不同培养基成分对鹿茸菇液体菌丝生长的影响15，通气搅拌式发酵罐中优化鹿茸菇液体菌丝发酵条件，液体菌种配方优化等16。张汉燚等17对鹿茸菇中试发酵培养基进行优化，最佳培养基配方为玉米面 5%、大豆0.5%、ZnSO4 0.025%、MgSO4 0.05%、KH2PO40.05%。发酵至第 8天时，菌丝体生物量达到最大值（10.578gL1）。席亚丽等18对鹿茸菇摇瓶发酵条件进行探索，获得最佳培养基配方为玉米面 200gL1、蔗糖15gL1、麸皮 35gL1、酵母膏 1.5gL1；温度26，接种量 10%，培养时间为 68d。【本研究切入点】鹿茸菇液体菌种培养优化的研究多采用单因素和正交试验结合的方式，试验设计考虑多种因素的影响，但无法明确因素之间交互作用对响应值的影响，缺少各因素与响应值之间的函数关系，无法确定最大响应值所对应的因素组合方式。目前，单因素试验和 Box-Behnken 响应面法结合优化鹿茸菇液体菌种发酵配方的研究较少，鹿茸菇液体发酵培养工厂化生产效率有待提高。【拟解决的关键问题】本研究以鹿茸菇为研究材料，采用摇瓶培养方式，以提高菌丝生物量为目的，采用单因素试验和 Box-Behnken 响应面法结合的方式，对培养基碳源、氮源和无机盐的添加量进行优化，以期获得适合鹿茸菇菌丝生长的液体发酵培养基配方，为推动鹿茸菇液体菌种生产提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试菌株鹿茸菇菌种（编号：LDS-1-YJY-2018）保存于福建农林大学（古田）菌业研究院，为福建珍菌子生物科技有限公司生产菌种。1.1.2试剂酵母粉、蛋白胨均购于 Oxoid；琼脂粉购于 Chembase；葡萄糖、蔗糖、鱼粉、维生素 B1、K2HPO4、MgSO47H2O、ZnSO4、CaSO4等无机盐均购于国药集团化学试剂有限公司；供试碳源玉米粉、小麦粉、全麦粉均购于陇龙之家，玉米芯购于联丰农产品深加工；供试氮源豆粕粉、牛肉膏、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆均购于鸿润宝顺培养基原料厂家。1.1.3培养基配方PDA 加富液体培养基（1L）：土豆 200g，葡萄糖 20g，蛋白胨 2g，酵母粉 2g，K2HPO42.5g，MgSO47H2O1g，VitaminB10.1g，pH 自然。PDA 加富固体培养基在液体培养基的基础之上加入琼脂 20g。724福建农业学报第38卷摇瓶一级种子液培养基（1L）：葡萄糖 20g，蛋白胨 2g，酵母粉 2g，K2HPO42.5g，MgSO47H2O1g，pH 自然。摇瓶基础发酵培养基（1L）：葡萄糖 20g，蛋白胨 2g，K2HPO42.5g，MgSO47H2O1g，pH 自然。固体菌种培养基：木屑 78%，麸皮 20%，葡萄糖 1%，石灰 1%，含水率 65%左右。1.2试验方法1.2.1摇瓶一级种子液的制备将保藏菌种接种于PDA 加富固体培养基平板，25，培养 20d 左右直至菌丝长满平板。应用打孔器（0.5mm 直径）在平板上面打 30 孔，应用接种器将菌块挑入摇瓶一级种子液培养基（含磁力搅拌子），25，150rmin1培养 4d，第 4天取出摇瓶置于磁力搅拌器上以 800rmin1、30min 打散菌球，继续培养 4d，即制成一级种子液。1.2.2液体菌种生长动力学曲线的测定按 10%接种量将一级种子液接种于 100mL 基础发酵培养基，25、150rmin1振荡培养。每隔 1d 分别取出发酵液，100 目纱布过滤收集菌球，RO 水清洗 3 遍，60烘干至恒重。每个处理设置 3 个重复。1.2.3最适液体发酵培养基成分筛选基础发酵培养基 121，灭菌 20min。其中玉米芯、玉米粉、小麦粉、全麦粉、豆粕粉、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、鱼粉需 115 灭菌 40min，冷却后均要求过 100 目 筛 网，滤 液 加 入 基 础 发 酵 培 养 基。按10%接种量接入相应培养基，25，150rmin1，培养 8d，100 目纱布过滤收集菌球，RO 水清洗 3 遍，60 烘干至恒重。每个处理设置 3 个重复。该操作方法适用于 1.2.3、1.2.4 与 1.2.5。以摇瓶基础发酵培养基为基础，分别用不同种类的碳源、氮源、无机盐替代摇瓶基础发酵培养基相对应的培养基成分，以筛选最适合鹿茸菇液体菌球生长的碳源、氮源与无机盐。供试碳源（20gL1）：葡萄糖、蔗糖、玉米芯、玉米粉、小麦粉、全麦粉，CK 为不加碳源；供试氮源（2gL1）：蛋白胨、豆粕粉、牛肉膏、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、鱼粉、玉米浆，CK 为不加氮源；供试无机盐（1gL1）：CoCl2、CuSO4、ZnSO4、CaSO4、MnSO4、FeSO4、NaCl、KCl、MgSO47H2O、K2HPO4，CK 为不加无机盐。1.2.4单因素设计以摇瓶基础发酵培养基为基础，分别替换其中碳源、氮源、无机盐成分进行单因素试验。各因素质量浓度梯度如下：全麦粉为10、20、30、40、50、60、70gL1；花生饼粉为 2、6、10、14、18、22、26gL1；K2HPO4为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0gL1；MgSO47H2O 为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0gL1。1.2.5响应面设计试验基于单因素设计结果，以菌丝生物量为响应值评价指标，采用 Box-Behnken 响应面法对全麦粉（A）、花生饼粉（B）、磷酸氢二钾（K2HPO4，C）、七水硫酸镁（MgSO47H2O，D）进行 4 因素 3 水平优化设计试验（表 1）。表 1 Box-Behnken 设计因素水平及编码Table 1 Codes and levels of factors in Box-Behnken experiment水平Level因素Factors/(gL1）A全麦粉WholewheatflourB花生饼粉PeanutmealC磷酸氢二钾K2HPO4/D七水硫酸镁MgSO47H2O/+155242.252.25050222.002.00145201.751.751.2.6液体菌种和固体菌种出菇试验按照最适发酵培养基配方制备液体菌种，以 10%的接种量接种于 250mL 摇瓶内，24130rmin1培养 8d，获得液体菌种。采用袋口接种的方式将液体栽培种接种至菌袋内，每袋接种 2530mL，接种固体菌种作为对照组。养菌与出菇管理工艺均由福建珍菌子生物科技有限公司完成。1.3统计分析培养基成分筛选试验和单因素试验使用 GraphpadPrism9 软件作图。响应面试验使用 DesignExpert8.0.6 软件进行。试验数据均使用 SPSSStatistics26 软件进行显著性差异分析。2结果与分析2.1鹿茸菇液体菌种生长动力学曲线由图 1 可知，鹿茸菇菌丝生物量随培养时间的延长呈先上升后下降的趋势。在发酵过程中，02d为延滞期，28d 为快速生长期，810d 为稳定期，10d 后进入衰亡期。当鹿茸菇菌丝培养至第 8天时，菌丝生物量达到最大值（4.47gL1），因此确定鹿茸菇液体菌种培养时间为 8d。2.2培养基成分的筛选由图 2-A 可知，鹿茸菇菌丝在 6 种供试碳源中均可生长，且菌丝生物量均高于不加碳源的对照组。不同碳源对菌丝生物量的影响具有显著差异性，从高到低的顺序为：全麦粉葡萄糖蔗糖小麦粉玉米粉玉米芯，以全麦粉作为碳源时，菌丝生物第6期单灿灿等：响应面法优化鹿茸菇液体菌种发酵配方725量达到最大值（8.50gL1），显著高于其他碳源。由图 2-B 可知，鹿茸菇菌丝在 8 种供试氮源中均可生长，其中花生饼粉是供试氮源中最适宜鹿茸菇生长的复合氮源，以花生饼粉作为氮源时，菌丝生物量可达 11.12gL1。由图 2-C 可知，当 Co2+与 Cu2+质量浓度为 1gL1时，菌丝生物量均低于不加无机盐的对照组，抑制鹿茸菇菌丝的正常生长，而其余离子均不同程度地促进菌丝的生长发育，其中尤以K+与Mg2+最为显著。以上数据表明，较适合于鹿茸菇菌丝发酵的碳源、氮源、无机盐分别为全麦粉、花生饼粉、K2HPO4与 MgSO47H2O。2.3单因素试验为了探究培养基单一成分如何影响鹿茸菇液体菌丝的生长，分别开展了全麦粉、花生饼粉、K2HPO4246810121357911012345培养时间Fermentation/d菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)ggfedcbaaaab不同字母表示均值之间差异显著（P0.05），下同。DatawithdifferentlettersindicatesignificantdifferencesatP0.05.Sameforthefollowingfiguresandtables.图 1 鹿茸菇液体菌种生长动力学曲线Fig.1 The growth dynamics curve of L.decastes liquid strainCK玉米芯Corncob玉米粉Corn meal小麦粉Wheat flour蔗糖Sucrose葡萄糖Glucose全麦粉Whole wheat flour0246810AB碳源种类Type of carbon source菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)e edcdcabCK豆粕粉Soybean meal powder黄豆饼粉Soybean cake powder牛肉膏Beef extract鱼粉Fish meal玉米浆Corn syrup蛋白胨Peptone棉籽饼粉Cottonseed cake meal花生饼粉Peanut meal051015氮源种类Type of nitrogen source菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)e decdebcdbcdbcababaCK氯化钴 CoCl2硫酸铜 CuSO4硫酸锌 ZnSO4硫酸钙 CaSO4硫酸锰 MnSO4硫酸亚铁 FeSO4氯化钠 NaCl硫化钾 KCl七水硫酸镁 MgSO47H2O硫酸氢二甲 K2HPO4051015C无机盐种类Type of inorganic salt菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)fec bcbbab fgdegA、B 与 C 分别代表 6 种碳源、8 种氮源与 10 种金属离子对鹿茸菇液体菌丝生长的影响。A,B,andCrepresenttheeffectsof6carbonsources,8nitrogensources,and10metalionsonthegrowthofL.decastesliquidstrain,respectively.图 2 3 类营养要素对鹿茸菇液体菌丝生长的影响Fig.2 Effects of 3 type nutrients on growth of L.decastes in liquid medium726福建农业学报第38卷与 MgSO47H2O 单因素质量浓度梯度试验。以全麦粉作为培养基的碳源，质量浓度为 4060gL1时，菌 丝 生 物 量 达 到 最 大 值（13.10gL1）（图 3-A）。以花生饼粉作为培养基的氮源时，质量浓度为 1826gL1时，菌丝生物量达到最大值（24.65gL1）（图 3-B）。以 K2HPO4与 MgSO4作为培养基的无机盐时，K2HPO4与 MgSO47H2O 的质量浓度均为 1.52.5gL1，菌丝生物量分别达到其最大值（图 3-C、D）。在不考虑培养基成分之间是否存在交互作用的影响下，单因素设计已成功筛选到各培养基成分较适合鹿茸菇菌丝生长的质量浓度范围。2.4响应面优化试验在 单 因 素 试 验 结 果 的 基 础 上，采 用 Box-Behnken 设计对碳源（全麦粉）、氮源（花生饼粉）、无机盐（K2HPO4与 MgSO47H2O）进行 4 因素 3 水平响应面优化试验，结果见表 2。以因素为自变量，菌丝生物量为响应值，使用 DesignExpert8.0.6 软件进行多元线性回归和二次项拟合，可得到二次多项回归方程式（1），方差分析见表 3。Y=3.340.086A+0.21B0.098C+0.020D+0.0092AB0.16AC0.036AD+0.018BC+0.01BD0.011CD+0.65A2+0.15 B2+0.56C2+0.31D2。(1)通过表 3 方差分析表可知，模型 P0.01，说明回归方程在 0.01 水平极显著，表明试验设计可靠；失拟项 P0.05，说明所得方程与实际拟合非正常误差所占比例较小，可用该模型和回归方程来预测试验数据。R2=0.9900，R2adj=0.9800，进一步说明该模型拟合度较好，可信度高，约 98.00%的鹿茸菇液体菌种生物量可用该模型进行预测19。A、B、C、D 的 P 值小于 0.01，说明其对菌丝生物量有极显著影响。AB、CD 之间交互作用对菌丝生物量有极显著影响，AC、AD 有显著影响，BD、BC 无显著影响。比较 F 值大小可知，影响菌丝生物量的因素主次顺序为 A 全麦粉B 花生饼粉C 磷酸氢二钾D 硫酸镁，交互项影响顺序为 ACADBCCDAB=BD。响应曲面图可更加直观地反映两两因素之间交互作用情况，等高线的形状为椭圆形表示交互作用10203040506070051015ABCD全麦粉质量浓度Mass concentration of whole wheat flour/(gL1)菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)dccbaab2610141822260102030花生饼粉质量浓度Mass concentration of peanut meal/(gL1)eed dbca0.00.51.01.52.02.53.00246810七水硫酸镁质量浓度Mass concentration of MgSO47H2O/(gL1)eedbcacb0.00.51.01.52.02.53.0051015磷酸氢二钾质量浓度Mass concentration of K2HPO4/(gL1)eecdbcaecA、B、C 与 D 分别代表全麦粉、花生饼粉、K2HPO4与 MgSO47H2O 剂量梯度对鹿茸菇液体菌丝生物的影响。A,B,C,andD:Effectsofdose-dependentwholewheatflour,peanutcakeflour,K2HPO4,andMgSO47H2O,respectively,ongrowthofL.decastesinliquidmedium.图 3 单因素试验Fig.3 Results of single-factor design experiment第6期单灿灿等：响应面法优化鹿茸菇液体菌种发酵配方727明显，圆形则表示交互作用不明显20。在全麦粉质量 浓 度 为 45 52 gL1与 花 生 饼 粉 质 量 浓 度 为21.223.5gL1、全麦粉质量浓度为 45.051.5gL1与 K2HPO4质量浓度为 1.92.2gL1、全麦粉质量浓度 为 45.2 51.5gL1与 MgSO47H2O质 量 浓 度 为1.82.1gL1，菌丝生物量均出现极大值（图 4-AC）；全麦粉与花生饼粉、碳酸氢二钾均存在显著的交互作用（表 3）。其余因素之间几乎不存在交互作用，主要由单因素自身决定菌丝生物量（表 3、图 4）。2.5响应面验证试验鹿茸菇液体菌种发酵培养基响应面优化试验中，最佳组合为全麦粉 47.84gL1、花生饼粉 22.39gL1、K2HPO4 2.04 gL1、MgSO47H2O 1.97 gL1，预测菌丝生物量为 33.60gL1。考虑实际情况，将各组用量简化为全麦粉 47gL1、花生饼粉 22gL1、K2HPO42.00gL1、MgSO47H2O2.00gL1，此条件下的菌丝生物量为（32.811.10）gL1。实际值与预测值相差较小，说明本研究建立的模型可对菌丝生物量进行预测，试验设计有效可靠。2.6液体菌种与固体菌种出菇试验如表 4 所示，液体菌种制种周期仅需 16d，较固体菌种缩短了 48d。液体菌种接种后存在多个萌发位点，2d 后观察到菌丝萌发；固体菌种是从接种块向四周生长，萌发点较少，需 4d 才能萌发。鹿茸菇菌丝在栽培基质中萌发时间长，发菌较慢，较其他食用菌更易被杂菌污染，抗杂菌能力更弱，污染率高，后期出菇产量低甚至不出菇。固体菌种萌发时表 2 Box-Behnken 试验设计及试验结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment试验号NumberA全麦粉WholewheatflourB花生饼粉PeanutmealC磷酸氢二钾K2HPO4D七水硫酸镁MgSO47H2O菌丝生物量Myceliumbiomass/(gL1)1110029.611.182+110029.901.4531+10032.271.114+1+10028.772.015001130.791.28600+1129.411.887001+128.000.30800+1+130.211.099100131.722.1210+100129.371.6311100+130.202.0012+100+129.112.5113011029.294.29140+11030.000.681501+1030.201.45160+1+1030.114.8017101030.002.9718+101030.174.121910+1032.480.2120+10+1028.734.0121010130.094.38表 3 二次回归方程方差分析Table 3 ANOVA on quadratic regression equation来源Source平方和SS自由度DS均方MSFP显著性Significance模型Model0.7362140.052698.950.0001*A0.087810.0878165.280.0001*B0.012710.012723.850.0002*C0.007410.007413.960.0022*D0.024810.02480.310.0001*AB0.035810.03580.020.0001*AC0.0371010.03716.120.0001*AD0.004410.00440.320.0118*BC0.001510.00150.080.1114BD0.001110.00110.020.1702CD0.032710.03270.030.0001*A20.129910.1299169.260.0001*B20.197410.19749.190.0001*C20.204510.2045127.920.0001*D20.230210.230237.540.0001*残差Residual0.0074140.0005失拟项Lackoffit0.0047100.00050.690.7126纯误差Pureerror0.002740.0007总和Cortotal0.743628R2=0.9900R2adj=0.9800*表示差异显著（P0.05），*表示差异极显著（P0.01）。*indicatessignificantdifferenceatP0.05;*extremelysignificantatP0.01.728福建农业学报第38卷间长、菌丝生长速率低，污染率达 29.17%，远高于液体菌种。液体菌种在菌种制备和栽培周期方面均具有优势。如表 4 与图 5 所示，接种液体菌种的子实体整齐度较一致，单包产量和成品菇数量更高，产量较固体菌种提高 15.74%。子实体农艺性状方面，接种液表 4 液体菌种和固体菌种栽培过程及出菇比较Table 4 Comparison of fermentation processes andmushroomfruiting using liquid and solid media指标Index液体菌种Liquidstrain固体菌种Solidstrain原种培养时间Originalculturetime/d824栽培种培养时间Culturespawnincubationtime/d840制种周期Seedproductioncycle/d1664菌丝萌发时间Timeofmyceliumgermination/d24满袋时间Bagsfulltime/d4245污染率Pollutionrate/%8.3329.17现蕾时间Buddingtime/d79采收时间Harvesttime/d2527单包产量Singlepackageoutput/g500.8920.12432.0025.36子实体整齐度Fruitingbodyuniformity+菇长Length/cm12.821.1911.760.83菇径Size/mm12.371.6617.361.71盖高Height/mm6.861.3510.721.85盖径Diameter/mm20.063.7726.103.94+表示子实体整齐度较一致；+表示子实体整齐度一致。+showsuniformfruitingbodyformation;+acceptablefruitingbodyuniformity.34.032.831.630.429.228.02423B:花生饼粉Peanut meal/(gL1)B:花生饼粉Peanut meal/(gL1)B:花生饼粉Peanut meal/(gL1)A:全麦粉Whole wheat flour/(gL1)A:全麦粉Whole wheat flour/(gL1)D:七水硫酸镁MgSO47H2O/(gL1)D:七水硫酸镁MgSO47H2O/(gL1)D:七水硫酸镁MgSO47H2O/(gL1)A:全麦粉Whole wheat flour/(gL1)C:磷酸氢二钾K2HPO4/(gL1)C:磷酸氢二钾K2HPO4/(gL1)C:磷酸氢二钾K2HPO4/(gL1)2221202.252.152.051.951.851.7545.047.550.052.555.045.047.550.052.555.0菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)34.032.831.630.429.228.045.047.550.052.555.0菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)34.032.831.630.429.228.0菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)2.252.152.051.951.851.752.252.152.051.951.851.7534.032.831.630.429.228.01.751.851.952.152.052.25菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)2.252.152.051.951.851.75202122232434.032.831.630.429.228.0菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)2.252.152.051.951.851.75202122232434.032.831.630.429.228.0菌丝生物量Mycelium biomass/(gL1)图 4 两因素之间的交互作用对菌丝生物量的影响Fig.4 Effect of interaction between two factors on DCMa)b)a)：接种液体菌种的菌包；b)：接种固体菌种的菌包。a):Mushroom packet for inoculation of mycelia cultured in liquidmedium;b):mushroom packet for inoculation of mycelia cultured insolidmedium.图 5 子实体的外观形态Fig.5 Appearance of mushroom fruiting bodies第6期单灿灿等：响应面法优化鹿茸菇液体菌种发酵配方729体菌种的子实体菇长略高于固体，而固体菌种的菇径、盖高和盖径均高于液体菌种，菌柄粗、菌盖大会影响荷叶离褶伞的口感，降低商品价值。综合分析液体菌种和固体菌种的培养周期、出菇产量、子实体农艺性状等方面，液体菌种表现优异。因此采用本研究的培养基配方所制备的液体菌种可用于鹿茸菇工厂化栽培。3讨论与结论本研究经过分析 4 种廉价的复合碳源与 2 种昂贵的单一碳源、7 种廉价的复合氮源与 1 种昂贵的复合氮源，发现廉价型的全麦粉与花生饼粉具有作为鹿茸菇液体菌种发酵主料的潜质。此外，本项研究发现鹿茸菇菌丝可利用的碳源、氮源种类极广，但更倾向于利用复合型碳氮源，与魏生龙等14研究结果较一致。在本研究中，玉米粉与小麦粉作为碳源时，鹿茸菇菌丝生物量无显著性差异，该项结果与席亚丽等18的研究结果较一致，但本研究结果表明全麦粉作为碳源培养鹿茸菇液体菌丝的效果是小麦粉的 2.2 倍，说明麦壳和麸皮也具有促进液体菌丝生长发育的功能17。分析无机盐对鹿茸菇菌丝生长的影响，发现除 Co2+与 Cu2+显著抑制菌球生长之外，其他供试离子均具有正效应。该研究结果与魏生龙等14的研究结果存在一定差异，原因可能在于鹿茸菇平板菌丝与液体菌丝生长发育对离子的吸收利用情况不同13。在栽培过程中，鹿茸菇菌丝在栽培料中的快速定植是极为重要的一个环节，菌丝定植时间过长，容易出现高污染，这与程继红21所描述的情况极为相似。本研究利用单因素-响应面优化的培养基配方，在摇瓶培养时收获菌丝生物量可达32.811.10gL1，该值是张凌珊16研究结果的 40 余倍，应用该配方制备的液体菌种与传统固体菌种相比，制种周期、污染率均大幅下降，单包产量提高15.74%，具有较大的生产应用潜能。本研究结果最优配方为全麦粉 47gL1