天冬氨酸酶体系中R-3-氨...酸相关物质HPLC方法研究_穆玉敏.pdf

Coal and Chemical Industry煤 炭 与 化 工Coal and Chemical Industry第 46 卷 第 5 期2023 年 5 月Vol.46 No.5May 20230引言R-3-氨基丁酸是医药中间体 R-3-氨基丁醇的前体。R-3-氨基丁醇则是合成抗艾滋病整合酶抑制剂杜鲁特韦的重要原料。R-3-氨基丁酸还可以衍生为-内酰胺，进而合成青霉烯类抗生素。杜鲁特韦(Dolutegravir)作为葛兰素史克旗下抗HIV 新药，2013 年获批 FDA 上市并承认了它的突天冬氨酸酶体系中 R-3-氨基丁酸相关物质 HPLC 方法研究穆玉敏4，韩广欣1，张浩月4，梁海龙4，杨梦茜4，刘丽荣4，任丽梅1,2,3（1.石家庄学院化工学院，河北 石家庄050035；2.河北省生物制药国际联合研究中心，河北 石家庄 050035；3.河北省高效微生物制药应用技术研发中心，河北 石家庄 050035；4.美邦美和生物科技有限公司，河北 石家庄 050000）摘要：为了建立一种高效被大众认可的满足酶促体系中 R-3 氨基丁酸及相关物质的分析方法。基于显色法、衍生法本文探究了高效液相色谱 UV 检测器 210 nm 下采用特定流动相及检测参数的 HPLC 外标法。结果表明在选定的色谱条件下，R-3-氨基丁酸与相关物质可以和酶促反应中其它物质得到很好的分离，反应过程中底物巴豆酸在浓度 0.05 0.4 g/L范围线性良好，R2大于 3 个 9，产物 R-3-氨基丁酸在此检测条件下灵敏度好，检测限、定量限符合规定，浓度 0.35 2 g/L范围线性良好，R2大于 3 个 9。该方法同时满足原辅料、催化反应、纯化结晶、成品含量及杂质检测。关键词：天冬氨酸酶突变体；生物酶催化；巴豆酸；R-3-氨基丁酸；高效液相色谱法；外标法中图分类号：O657.7+2文献标识码：B文章编号：2095-5979（2023）05-0122-04Studies on HPLC method of R-3-aminobutyric acidrelated substances in aspartase systemMu Yumin4,Han Guangxin1,ZhangHaoyue4,LiangHailong4,YangMengxi4,Liu Lirong4,Ren Limei1，2，3(1.School of Chemical Engineering,Shijiazhuang University,Shijiazhuang 050035,China;2.Hebei International JointResearch Center for Biopharmaceuticals,Shijiazhuang 050035,China;3.Hebei Provincial University MicrobialPharmaceutical Application Technology R&D Center,Shijiazhuang 050035,China;4.Mei bang mei he Biological TechnologyCorporation Ltd.,Shijiazhuang 050000,China)Abstract：In order to establish an efficient analysis method of R-3-aminobutyric acid and related substances in theenzymatic system.Based on the color development method,the derivative method,the method ofHPLC external standard at210nm with specific mobile phase and detection parameters was explored.The results show that under selectedchromatographic conditions,R-3-aminobutyric acid and related substances can be well separated from other substances inthe enzymatic reaction,and the substrate crotonic acid in the concentration of 0.05 0.4g/LRange lineargood,R2Morethan 999,the product R-3-aminobutyric acid has good sensitivity under this detection conditions,the detection limit andquantification limit meet the requirements,and the concentration is 0.35 2g/LRange lineargood,R2More than 999.Themethod alsomeets the rawmaterials,catalytic reaction purification and crystallization,finished product content and impuritydetection.Key words：apartic ase mutants;biological enzyme catalysis;crotonic acid;R-3-aminobutyric acid;HPLC;externalstandard method责任编辑：索喜梅DOI：10.19286/ki.cci.2023.05.030作者简介：穆玉敏（1990），女，河北石家庄人。通讯作者：任丽梅（1984），河北保定人，高级工程师。引用格式：穆玉敏，韩广欣，张浩月，等.天冬氨酸酶体系中 R-3-氨基丁酸相关物质 HPLC方法研究J.煤炭与化工，2023，46（5）：122-125，129.化 工 工 艺 与 工 程1222023 年第 5 期破性。降低杜鲁特韦原料药成本、推广其应用范围的关键步骤是 R-3-氨基丁酸。据统计，2016 年全球抗 HIV 药物销售额为230.23 亿美元，20112016 年复合增速为 8.4%，显著高于全球药物市场约 3.5%的平均增长率。到2022 年市场价值增长到 320 亿美元，R-3-氨基丁酸作为其重要原料中间体，其市场容量及价格也是水涨船高。R-3-氨基丁酸为一种手性氨基醇类，早期的氨基醇类物质主要通过天然的氨基酸为原料还原得到。目前，合成 R-3-氨基丁醇的方法有以硼氢化物还原法、以酒石酸为拆分剂的拆分法和以钌碳等为诱导剂的化学诱导法等，近年兴起以各种酶为核心的生物催化和基因转移等合成方法。采用以上方法制备 R-3-氨基丁醇的环境有不能直接获得手性产物、污染大、收率不高且不利于企业的节能减排等缺点，生物法的相关产品研究逐步走向市场。为了降低杜鲁特韦原料药成本，推广 R-3-氨基丁醇应用范围，重要步骤在于开发一种高效、低成本的路线合成高纯度的 R-3-氨基丁酸。随着科学研究进步，发现利用天冬氨酸酶突变体可以提供一种催化反式丁烯酸生产 R-3-氨基丁酸的新路线。优化其生产工艺达到工业化生产，对于生物医药行业具有重要的意义。该酶促体系由巴豆酸、铵盐、含镁离子的盐组成，重组天冬氨酸酶突变体为生物酶催化剂，以氨水调节 pH，在特定温度及碱性条件下进行反应，然后经过分离、纯化、脱色、过滤、结晶、干燥，获得 R-3-氨基丁酸。相对以上提及的化学法，生物催化具有环境友好、条件温和、收率高、易制备和工艺路线短等优点，可为杜鲁特韦重要原料 R-3-氨基丁醇的工业化生产提供可靠的技术支撑。除此之外，与传统的化学合成相比，微生物合成技术是通过环境友好的途径制备，免于使用重金属、有机溶剂以及强酸强碱，且生物催化剂具有高效的底物特异性，可减少副产物的形成。R-3-氨基丁酸是一种典型的手性 氨基酸，据研究发现其有效组分仅为 R 构型。本论文根据生物酶催化的高选择性，针对生物催化结束后的反应液以及终成品获得前成分复杂的母液等进行分析方法探讨。生物酶催化原理：巴豆酸加铵盐经天冬氨酸酶催化，催化条件 42 pH9.0，200 rpm 得到 R-3-氨基丁酸。反应液及母液等纯化步骤为：催化反应液 离心过滤 超滤脱色（活性炭）脱炭 减压浓缩 结晶 离心洗涤 干燥 成品包装。由生物酶催化原理和反应液及母液等纯化步骤可知，该反应中间步骤包含铵根离子、镁离子、原辅料杂质、反应杂质等复杂组分。目前国内外关于 R-3-氨基丁酸含量测定方法主要为滴定法：精密称定 R-3-氨基丁酸标准品0.1 g 到 250 mL 三角瓶中，加 3 mL 无水甲酸待样品完全溶解后继续加入 50 mL冰醋酸，然后加两滴结晶紫指示剂，立刻用高氯酸（已标定）滴定至紫色消失变为蓝色，保持 30 s 不变色。R-3-氨基丁酸含量测定方法衍生法：采用 1-氟-2,4-二硝基苯和 HPLC 进行衍生化，在 360 nm 处进行紫外检测。R-3-氨基丁酸的相关物质检测高效液相法：流动相：准确量取纯水 990 mL，甲醇 10 mL 加入1 000 mL量筒，加入 0.5 mL 磷酸和 1 mL 三乙胺调pH 为 5.6，过滤超声 15 min 即得。稀释液：超纯水，色谱条件：色谱柱：YMC-Pack Pro C181504.6 mml.D.S-3 m；210 nm；流速：0.5 mL.min；波长：210 nm；柱温：25；进样量：10L；运行时间：30 min。上述 3 种方法实验步骤繁琐，且需结合不同方法定量检测 R-3-氨基丁酸及其相关物质巴豆酸等，为解决现有方法存在的问题，本文开发了一种能够快速、准确定量检测R-3-氨基丁酸及其相关物质的高效液相色谱分析方法。通过 50 mL 小体系反应及 1 L、30 L 体积放大反应验证，在该方法条件下反应底物巴豆酸在浓度 0.05 0.4 g/L 范围内线性良好，R23 个 9，产物 R-3-氨基丁酸在浓度 0.35 2 g/L范围内线性良好，R23 个 9，此方法同时满足监测催化反应过程、原辅料及成品杂质监测，效率大大提升，该检测法灵敏度高，检测限为 0.2 g/L，定量限 0.5 g/L，对获取高纯度 R-3-氨基丁酸有重大贡献。1结果与讨论1.1实验部分1.1.1仪器与设备高效液相色谱仪，LC-2030 Plus 岛津。电子天平，赛多利斯仪器有限公司型号 AUW220D。pH 计，梅特勒-托利多仪器有限公司，Seven2 GoS2。1.1.2材料与试剂磷酸二氢钾，分析纯。乙腈，色谱纯。磷酸阿拉丁色谱纯含量85%。超纯水。甲醇康科德，色谱纯。穆玉敏等：天冬氨酸酶体系中 R-3-氨基丁酸相关物质 HPLC方法研究123煤炭与化工2023 年第 5 期第 46 卷由图 1 和图 2 可以看出，两个色谱条件检测同一样品 R-3-氨基丁酸可得出结论。（1）液相色谱条件二基线相较平稳。（2）液相色谱条件二灵敏度更高，可检测其相关物质更低检出限，有利于工艺控制得到纯度更高的产品。（3）液相色谱条件二相对时间较短，可提高检测效率。综上特点色谱条件二可以同时完成原辅料、催化反应、纯化结晶和成品含量及杂质分析，高效便捷。2.2检出限和定量限及方法线性相关性的测定分别以 3 倍和 10 倍信噪比浓度得到检测限（LOD）和定量限（LOQ），LOD 为 0.15 mg/mL，LOQ 为 0.5 mg/mL。配制 R-3-氨基丁酸和巴豆酸不同质量浓度标准溶液 4 个，在液相色谱条件二下，分别进行分析检测，用质量浓度做横坐标，以峰面积为纵坐标得到线性回归方程。线性关系测试结果见表 1。如表 1 在液相色谱条件二体系中，该反应底物三乙胺色谱纯含量99.5%。R-3-氨基丁酸标样麦克林含量99.5%。巴豆酸标样阿拉丁含量98%。1.2实验方法1.2.1流动相制备流动相一：准确量取纯水 990 mL，甲醇 10 mL加入 1 000 mL量筒，加入 0.5 mL磷酸和 1 mL三乙胺调 pH 为 5.6，过滤超声 15 min。流动相二：30 mM磷酸二氢钾加入超纯水超声至完全溶解，加 5%乙腈，用磷酸调 pH 为 2.5，用0.45m有机膜过滤后超声 15 min。1.2.2标准溶液的制备质量浓度为 10 mg/mL 的标准溶液配置：精准称量 0.1 g（精确至 0.000 1 g）R-3-氨基丁酸标准品，用超纯水溶解后定容至 10 mL，震荡混匀。分别吸取 0.5、1、1.5 和 2 mL至 10 mL容量瓶，稀释成 0.5、1.0、1.5 和 2.0 mg.mL-1的标准溶液，备用。质量浓度为 10 mg/mL的标准溶液的配置：准确称取 0.1 g（精确至 0.000 1 g）巴豆酸标准品，用超纯水经超声波溶解后并定容至 10 mL，振荡混匀，用超纯水按上述步骤将 10 mg/mL的标准溶液逐级稀释成 0.05、1.0、2.0 和 4.0 mg/mL的标准溶液，备用。1.2.3高效液相色谱分析条件分 析 条 件 1：色 谱 柱:YMC-Pack Pro C181504.6 mml.D.S-3 m；流速：0.5 mL/min；波长：210 nm；柱温：25；进样量：10 L；运行时间：30 min。分析条件 2：安捷伦 Analytical 4.6250 mm5-Micron；流速：1.0 mL/min；波长：210 nm；柱温：30；进样量：10 L；采集时间：20 min。色谱操作条件为典型操作参数，依据仪器特点，可对操作参数进行适当调整，以获得最佳效果。2结果与讨论2.1流动相的选择分别用流动相一、二对应分析条件 1、2，进液相检测 R-3-氨基丁酸成品得到 R-3-氨基丁酸及相关物质色谱。色谱条件 2 R-3-氨基丁酸如图1 所示。色谱条件 1 R-3-氨基丁酸如图 2 所示。组分名称R-3-氨基丁酸巴豆酸线性范围/(g L-1)0.35 20.05 0.4曲线Y=65 022.9 X+17.885Y=8E+0.7 X-237 809方差0.999 70.999 9表 1 线性关系测试结果Table 1 Result oflinear relationship test图 1色谱条件 2 R-3-氨基丁酸Fig.1 Chromatographycondition 2 R-3-aminobutyric acid.432100102030时间/minIntensity（105）/mV图 2色谱条件 1 R-3-氨基丁酸Fig.2 Chromatographycondition 1 R-3-aminobutyric acid4321001020时间/minIntensity（105）/mV1242023 年第 5 期巴豆酸在浓度 0.05 0.4 g/L 范围线性良好，R23个 9，产物 R-3-氨基丁酸在浓度 0.35-2 g/L 范围线性良好，R23 个 9，该液相色谱条件可满足催化反应至结晶过程含量及杂质监测，方便快捷。2.3方法精密度的测定对同一样品重复 6 次，在液相色谱条件二体系中检测，精密度测试结果见表 2。准偏差为 8.9%；杂质标准偏差为 5.0%；巴豆酸标准偏差为 1.4%；该液相色谱条件对各个重要物质均能达到精密测定，重现性好。3展望R-3-氨基丁酸是抗艾滋病药物杜鲁特韦的重要原料，市场需求量与日俱增，本文主要对天冬氨酸酶生物催化反应体系有关物质开展了一些研究，该工艺条件温和、环境友好、工艺路线短、收率高、易制备、选择性高，但该方法蛋白含量大，尤其全菌体系表现出更强的活性，碍于时间受限，不完善之处，从以下几个方面继续探究。（1）R-3-氨基丁酸 UV 响应值较低，检出限相对较高，线性范围较窄，巴豆酸 UV 响应值较高，线性范围宽，合理稀释倍数尤为重要。（2）R-3-氨基丁酸与 S-3-氨基丁酸形影不离，仅 R-3-氨基丁酸为有意义活性，化工等其余领域是否直接高效生成 R 构型无法确定，本方法是否适用其体系有待研究。（3）本文涉及催化反应底物较少蛋白较高体系，检测前必需对样品进行高温灭活及离心去除蛋白处理，用 0.22m有机滤膜过滤上机检测，添加预柱以适当保护色谱柱，需进一步优化上机检测前处理手段。4结语上述实验结果表明，采用本方法可满足生物转化法体系 R-3-氨基丁酸原辅料、催化反应、纯化结晶、成品含量同时检测 R-3-氨基丁酸及其有关物质检测，线性回归方程符合标准，基线平稳、分离效果好、准确度和精密度高、操作简单、快捷，是一种较为理想的 HPLC分析方法。本文借助于生物转化法高选择性优点，生成高纯度 R-3-氨基丁酸技术日益成熟，本方法成本大大降低，且顺应我国环保发展趋势，推广此分析方法极具必要性。本文方法已同时以实验级试剂和工业级试剂，在不同发酵体系和摇瓶催化及公斤级催化实验验证，在成品检测中更体现出其有关物质检出限更低的优势，从而得到含量更高，纯度更高成品。参考文献：1 张飞龙，杨卫华，陈明亮，等.固定化天冬氨酸酶制备（R）-3-氨基丁酸 J.生物加工过程，2020，18（5）：556-560.2 李艳玲，刘红淼，王彩霞，等.抗艾滋病新药：杜鲁特韦（dolutegravir）J.医药导报，2015，34（8）：1 064-1 066.3 张建礼，李宗涛，王朋，等.杜鲁特韦合成路线图解 J.中国卫生标准管理，2016，7（13）：125-127.4 柳鹏福，邵梅琪，等.一种用于测定氨基丁醇含量的高效液相色谱方法，CN108845048AP.2018-11-20.5 朱文兵，朱飞轮，等.一种 R-3-氨基丁醇的制备方法，CN114573463AP.2022-06-03.6 孙凤霞，孔琳，等.一种 3-氨基丁醇手性纯度的 HPLC分析方法，CN105675783AP.2016-06-15.7 孙传民，程占冰.焦江华，等.酶法制备 R 一 3 一氨基丁酸的方法，CN109576317 AP.2019.04.05.8 CRDENAS-FERNNDEZM,LPEZC,LVAROG,et al.Immobil-ize dl-aspartate ammonia-lyase from Bacillus sp.YM55-1 asbiocatalyst for highly concentrated l-aspartate synthesis J.Bioprocess Biosyst Eng,2012,35(8):1 437-1 444.9 徐应淑，宋宝安.手性氨基醇的研究进展J.遵义医学院学报，2006.29（3）：295-298.10 上海弈柯莱生物医药科技有限公司.一种 R-3-氨基丁醇的制备方法：CN108424370AP.2018.08.21.11 浙江永太科技股份有限公司.一种 R-3-氨基丁醇的提取制备方法：CN109970580AP.2019.07.05.12 浙江工业大学.一种用于测定氨基丁醇含量的高效液相色谱方法：CN108845048AP.2018.11.20.13 江西宇能制药有限公司.一种 R-3-氨基丁醇的制备方法中国，114573463P.2022.06.03.14 湖州柏特生物科技有限公司.一种（R）-3-氨基丁醇的制备方法：中国，11105342P.2021.07.13.15 自然资源部第三海洋研究所.一种（R）-3-氨基丁酸的合成与纯化方法：中国，113789311P.2021.12.14.16 袁建国，张言慧.一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法和应用：CN112779236AP.2021.05.11.表 2 精密度测试结果Table 2 Result ofthe precision test序号123456RSD/%R-3-氨基丁酸216 968216 966216 959216 952216 978216 9698.9杂质 11 2891 2901 2891 2781 2901 2925.0巴豆酸1 0771 0781 0771 0801 0801 0791.4（下转第 129 页）穆玉敏等：天冬氨酸酶体系中 R-3-氨基丁酸相关物质 HPLC方法研究1252023 年第 5 期（上接第 121 页）CD组合，浆液循环泵 B（变频）CD 组合明显优于浆液循环泵 AB（变频）C 组合，同一频率 AB（变频）D 可以保证更高的入口 SO2浓度，适应范围更广。模拟工况运行要优于理论设计计算条件，因此现场实际运行时可调范围更广。3结语针对企业运行中入口 SO2浓度不稳定且变化随机性较强的情况，经过对运行数据及变频计算数据的分析比较，可以得出结论，对浆液循环泵 B 进行变频改造可以达到节能降耗的目的。计算浆液循环泵变频范围为 45 50 Hz，具体变频值可以根据现场实际运行效果实时调整。参考文献：1 冯斌，王锋涛，闫乃明，等.600 MW 燃煤机组脱硫浆液循环泵变频改造及节能优化研究 J.电力科技与环保，2021，37（2）：51-57.2 卢如飞，曹操.关于电厂吸收塔循环浆液泵变频改造的探索与实施J.节能与环保，2021，（12）：57-58.3 白雪川.循环流化床机组降低脱硫系统厂用电率的措施 J.云南水利发电.2021，37（9）：45-50.4 颜磊.火电厂脱硫系统浆液循环泵节能工艺探讨 J.科学技术创新.2019，（37）：36-37.5 闫欢欢.石灰石湿法烟气脱硫对标探讨 J.科学技术创新.2018，（28）：183-184.6 刘黎伟.烟气湿法脱硫浆液循环泵变频改造后对喷淋效果的影响与分析J.科学技术创新，2018，（3）：149-150.7 罗平，程志会.脱硫系统浆液循环泵节能降耗方法研究J.设备管理与维修.2017，（10）：125-126.8 李秀娟.湿法脱硫系统安全运行与节能降耗 J.电力科技与环保.2013，29（1）：53-55.9 郭正朝，赵学斌.湿法脱硫系统中浆液泵的节能改进 J.山西焦煤科技，2012，36（1）：41-43.10 刘黎伟.600 MW 锅炉机组脱硫浆液循环泵变频改造的应用与研究J.水泵技术，2017，（10）：125-126.17 杨卫华，张飞龙，钱敏帆，等.一种 R-3-氨基丁酸的制备方法：CN108374027 AP.2018.08.07.18 吕佳佳.利用重组大肠杆菌生物法制备法尼烯和 R-3-氨基丁酸的研究D.天津：天津大学，2020.19 吴生文，田重威，胡四明，等.一种光学活性的 3 一氨基丁醇和 3-氨基丁酸的制备方法：CN104370755A P.2015-2-25.20 花文起，丁鹏.一种 R-3 一气基丁醇的生产方法：CN1041785334P.2014-11-05.21 Q/CZY019-2017，R-3-氨基丁酸S.22 Q/HBT07-2018.R-3-氨基丁酸S.中国煤炭地质，2018，30（7）：5-9.2 高晓栋.烟煤为原料制备压块活性炭J.化学工程与装备，2020（6）：34-35.3 吴永红，张兵，肖大君.宁夏无烟煤基活性炭的制备及吸附性能研究J.化工新型材料，2015，43（11）：105-107.4 吴宪平，王福平，崔士国.新疆煤基活性炭产业发展前景J.洁净煤技术，2018，24（S1）：95-97.5 吴凡，叶传珍，王敏辉.新疆高惰质组煤基活性炭制备与表征J.煤炭工程，2020，52（12）：163-167.6 姚鑫，杨乾，赵学松，等.FeCl3添加剂作用下煤基压块活性炭的孔结构调控J.洁净煤技术，2020，26（4）：111-118.7 罗化峰，乔元栋，徐青云，等.大同煤温和超临界热溶-炭化耦合转化过程研究J.洁净煤技术，2019，25（1）：142-147.8 李学哲.大同煤质活性炭的研究与进展J.煤炭加工与综合利用，2018（5）：70-73.9 吴超，李强，郑环，等.汽油吸附用煤基活性炭的制备及研究J.煤化工，2017，45（1）：19-21.10 侯少芹.氧化镁/活性炭复合材料的制备及其吸附性能研究D.青岛：中国海洋大学，2009.11 蒋剑春.活性炭制造与应用技术M.北京：化学工业出版社，2018：106-107.（上接第 125 页）王守伟等：载氧化镁活性炭的制备及性能研究129