壮通饮对脑缺血再灌注小鼠神经细胞损伤的影响及其作用机制.pdf

2023年7 月第43卷第7 期Jul.2023 Vol.43 No.7本文引用：杨鑫勇，王凯华，刘丹宁，王亚南，周嫦艳.壮通饮对脑缺血再灌注小鼠神经细胞损伤的影响及其作用机制 ，湖南中医药大学学报,2 0 2 3,43(7):1155-116 4.湖南中医药大学学报Journal of Hunan University of Chinese Medicine1155壮通饮对脑缺血再灌注小鼠神经细胞损伤的影响及其作用机制杨鑫勇12,王凯华2*，刘丹宁1,2,王亚南1,2,周娣艳1,21.广西中医药大学研究生院，广西南宁530 2 0 0；2.广西中医药大学附属国际壮医医院，广西南宁530 2 0 0【摘要】目的探讨壮通饮对脑缺血再灌注小鼠神经细胞损伤的影响及其作用机制。方法采用线栓大脑中动脉栓塞法诱导建立小鼠脑缺血再灌注模型，造模成功后的6 7 周龄雄性C57BL6J小鼠随机分为模型组、壮通饮组、阿司匹林组、壮通饮联合阿司匹林组，各组再随机分为1、3、7 d时点组，另设不造模的空白组和假手术组，每组10 只，按照分组灌胃给药至相应时点。记录各组每日体质量及ZeaLonga评分，采用TTC染色法测定脑缺血小鼠的脑梗死体积百分比;HE染色观测缺血病理改变情况,TUNEL染色比较神经细胞凋亡情况，透射电镜观测神经细胞线粒体结构改变及自噬情况，Westernblot以及RT-PCR技术分析P62、LC 3I/LC 3I、Bc 1-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bc1-2/adenovirusE1B19kDa interacting protein3，BNIP3）-actin蛋白或基因表达情况。结果与空白组、假手术组相比，模型组体质量明显下降（P0.05),TTC染色可见脑组织缺血梗死，出现神经细胞凋亡及线粒体损伤。与模型组相比，各给药组体质量升高(P0.05),行为学评分降低(P0.05),梗死体积降低，且持续减小(P0.05)；神经细胞凋亡率降低(P0.05)。模型组线粒体结构损伤明显较重，在1d时各给药组即可观测到较多线粒体自噬小体，而模型组在3d时才可观测到，在7 d时各给药组大多数线粒体结构完整，可见被溶酶体消化完成的脂滴，而模型组可见自噬小体与自噬溶酶体同时存在。与模型组比较,各给药组P62蛋白表达在1d时降低,3、7 d时升高(P0.05);LC3II/LC 3I 的蛋白比值以及P62、BNI P3的基因表达水平在1d时升高,7 d时降低(P0.05)。在各给药组中,壮通饮联合阿司匹林组各项指标均优于其他给药组及模型组(P0.05)。结论壮通饮能够减轻脑缺血再灌注小鼠的神经细胞损伤，这可能与促进神经细胞发生线粒体自噬，维持细胞内线粒体稳态有关。【关键词】壮通饮；脑梗死；缺血再灌注；神经功能；线粒体自噬【中图分类号】R285.5【文献标志码 A【文章编号 doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2023.07.002Effects of Zhuangtong Drink on cerebral ischemia-reperfusion-inducednerve cell injury in mice and its mechanismYANG Xinyong2,WANG Kaihua*,LIU Danning,WANG Yanan,ZHOU Changyan?1.Graduate School,Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530200,China,2.International ZhuangMedicine Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530200,ChinaAbstract Objective To investigate the effects of Zhuangtong Drink on nerve cell injury induced by cerebral ischemia-reperfusion in mice and its mechanism.Methods The model of cerebral ischemia-reperfusion in mice was established by threadembolism induced middle cerebral artery occlusion(MCAO).Six to seven-week-old male C57BL6J mice were randomly divided intomodel group and treatment groups including Zhuangtong Drink group,aspirin group and Zhuangtong Drink combined with aspiringroup after modeling.Each group was randomly subdivided into 1 d,3 d,and 7 d groups.In addition,blank group and sham-【收稿日期 2 0 2 3-0 4-14【基金项目】国家自然科学基金项目（8 19 6 0 8 0 1,8 2 16 0 9 46)；广西中医药大学引进博士科研启动基金项目（2 0 18 BS063）；广西一流学科建设开放课题（2 0 19 XK148）；广西自然科学基金项目（2 0 2 1GXNSFAA196012)；广西中医药大学第二批“岐黄工程 高层次人才团队培育项目（2 0 2 10 0 8)；广西壮族自治区中医药管理局自筹经费科研课题（GXZYZ20210103）；广西中医脑病重点学科项目（GZXK-Z-20-14)；广西中医药大学校级重点硕士研究生科研创新项目（YCSZ202030）。【第一作者 杨鑫勇,男，硕士,研究方向：脑血管疾病的中西医结合防治。【通信作者*王凯华，男，博士，主任医师，E-mail：Wa n g k a i h u a l 119 16 3.c o m。1156operated group without modeling were also set up,10 mice per group.The corresponding drugs were administered by gavage in thegroups to the corresponding time points.The daily body weight and Zea Longa scores of each group were recorded,The percentageof cerebral infarction volume in mice with cerebral ischemia was measured by TTC staining;the ischemic pathological changes,neuronal apoptosis,and structural changes and autophagy of nerve cell mitochondria were observed by HE staining,TUNELstaining,and transmission electron microscope,respectively,the protein or gene expressions of P62,LC3 ILC3 I,Bel-2/adenovirusE1B 19kDa interacting protein3(BNIP3)and-actin were analyzed by Western blot and RT-PCR techniques.ResultsCompared with blank group and sham-operated group,the body weight of mice in model group decreased significantly(P0.05),andthe behavioral scores increased(P0.05);TTC staining showed cerebral ischemic infarction,neuronal apoptosis and mitochondrialinjury.Compared with model group,the body weight of mice in treatment groups increased(P0.05);the behavioral scores,mortalityrates,as well as the rate of neuronal apoptosis decreased(P0.05);the infarction volume was reduced and continued to be lowered(P0.05).The structural damages of mitochondria in mice of model group were obviously more severe More mitophagosomes could beobserved in treatment groups on the Ist day,while in model group on the 3rd day.Most of the mitochondria in treatment groupswere intact on the 7th day,and the lipid droplets digested by lysosomes could be seen,while in model group,autophagosomes andautolysosomes coexisted.Compared with model group,the expression of P62 protein in each treatment group decreased on the lstday and increased on the 3rd and 7th day(P0.05),while LC3 ILC3 I ratio and the gene expression levels of P62 and BNIP3increased on the lst day and decreased on the 3rd and 7th day(P005).Among treatment groups the indexes of Zhuangtong Drinkcombined with aspirin group were better than other treatment groups and model group(P0.05).Conclusion Zhuangtong Drink canrelieve the injury of nerve cells in cerebral ischemia-reperfusion mice,which may be related to the promotion of nerve cellmitophagy and the maintenance of intracellular mitochondrial homeostasis.Keywords Zhuangtong Drink;cerebral infarction;ischemia-reperfusion;neurological function;mitophagy湖南中医药大学学报http:/2023年第43卷缺血性脑血管病是最常见的脑血管病,约占全部脑血管疾病的7 5%,具有高发病率、高死亡率、高致残率、高复发率等特点。目前，有效治疗方法包括溶栓治疗、血管内治疗等急性治疗措施，但受到时间窗和出血转化风险的限制，且有缺血再灌注损伤的风险。因此，寻找有效的脑神经保护药物对保护缺血脑组织的功能具有十分重要的意义。壮医认为,头脑为“巧坞”,脑梗死是瘀血堵塞三道、两路,而致“巧坞”失养所致。治疗上,壮医注重疏三道通两路，调治“巧坞”。壮通饮由扶芳藤、黄花倒水莲、参三七3味特色壮药组成。扶芳藤味辛，性平,能通龙路、火路,能舒筋通络，止血消瘀。黄花倒水莲味甘,性微温,能祛湿解毒,补虚,活血止血。参三七味甘、温、微苦，能通龙路，能止血消肿，化瘀止痛。壮通饮有通龙路、火路之功，能舒筋通络、活血止血消瘀,在脑梗死的临床治疗上具有显著疗效 3。线粒体是缺血后神经细胞死亡的关键靶区，是神经细胞存活的关键因素。线粒体自噬是一种特殊的自噬类型，可以选择性地清除受损线粒体,其在应激状态中（如缺氧、钙超载等）起着至关重要的作用4。在缺血再灌注病理过程中,细胞可以通过激活自噬途径，清除受损的线粒体和过量产生的活性氧化物（reactive oxygen species，R O S）,维持细胞内线粒体功能的稳定，从而抑制线粒体依赖的调亡5。提示线粒体自噬是缺血再灌注病理过程中重要的内源性保护机制，是脑梗死治疗的潜在靶点。本研究通过动物实验，探索壮通饮与线粒体自噬的联系，以期为脑缺血治疗提供新思路及新药物。1材料1.1动物使用19 6 只SPF(specific pathogenfree)级同遗传背景雄性C57BL6J小鼠,6 7 周龄，体质量19.421.4g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（湘）2 0 19-0 0 0 4，动物质量合格证号：430 7 2 7 2 1110 12 5417 4。所有实验动物均饲养于广西中医药大学科学实验中心SPF级动物房中。饲养条件：5只1笼，温度2 2，湿度50%，自由饮水、进食，有实验人员操作时开启日光灯，其余时间关闭日光灯，于8:0 0 至17:0 0 开启动物照明灯光。本实验经本校伦理委员会批准，符合3R原则，伦理编号：DW20210410-074。本实验共使用小鼠19 6 只，死亡36 只,死亡原因多为蛛网膜下腔出血及病情过重，实际纳人实验16 0 只，总体死亡率为18.37%。2023年第43卷1.2药物制备壮通饮方剂临床每日使用剂量：扶芳藤30 g，黄花倒水莲2 0 g，三七10 g。根据中药药理研究方法学提供的实验动物剂量换算方法，按照成人体质量6 0 kg计算，小鼠给药量：扶芳藤4.55g/(kg?d)、黄花倒水莲3.0 3g/(kgd）、参三七1.52 g/(kgd)。第一次煎煮取10 倍体积的纯水，浸泡30 min后，煮至沸腾后续煮1h，取溶液待用。第二次煎煮取8 倍体积纯水复煎，煮至沸腾后续煮30 min，取药液与第一次药液混合后使用30 0 目滤网过滤，将过滤后的药液至于6 0 水浴锅中,浓缩药液至2 0 0 mL，每毫升含生药0.9 1g。按照0.1mL/10g灌胃体积灌胃给药。阿司匹林按照成人剂量10 0 mg/d（成人体质量按6 0 kg计算）换算成小鼠给药剂量为：13mg/kg，使用万分之一天平称取7.5mg每管分装于10 mL离心管中,每次给药前加人纯水5mL,每毫升含药1.5mg，制备成0.1mL/10g给药浓度的阿司匹林溶液。1.3主要仪器及试剂造模用线栓（型号：L1800)购自州佳灵生物技术有限公司。兽用青霉素钠（批号：19 0 30 1）购自华北制药集团有限责任公司。扶芳藤（批号：20210901）、黄花倒水莲（批号：2 0 2 1110 1）、三七（批号：2 0 2 10 7 0 1)购自仙茱中药科技有限公司。阿司匹林（批号：A104180)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。戊巴比妥钠(批号：117 15)购自美国Sig-ma-Aldrich LLC.公司。TTC染液(批号:DK0005)购自北京雷根生物技术有限公司。Gluta电镜固定液（批号：P1126）、R IPA 强效裂解液（批号：R0010）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：PC0020）、脱脂奶粉（批号：D8340)均购自北京索莱宝科技有限公司。快速制胶试剂盒（批号：PG213）、三色预染蛋白maker（批号：WJ103）、超灵敏化学发光液（批号：SQ101)均购自上海雅酶生物医药科技有限公司。LC3抗体（批号：146 0 0-1-AP)购自PTG。C y t C(批号：42 8 0 S）、-actin（批号：37 0 0 S)抗体购自美国CellSignaling Technology公司。P62抗体(批号：A7758)购自武汉博士德生物工程有限公司。羊抗兔二抗（批号：312 34)购自赛默飞世尔科技（中国）有限公湖南中医药大学学报http:/造模方法参考Zea Longa改良的线栓法对C57BL6J小鼠进行大脑中动脉缺血再灌注的造模。随机选择6 7 周龄实验小鼠，术前2 4h禁食不禁水，麻醉备皮后仰卧置于37 恒温垫上，于颈后垫一棉签以更好地暴露术口，在摇臂显微镜下操作，正中切口，小心暴露左侧颈总动脉（common carotidartery，C C A），沿CCA向上继续分离颈外动脉（e x t e r n a l c a r o t i d a r t e r y，EC A）、颈内动脉（inter-nal carotid artery，I C A）,术中注意避免触及迷走神经。两次结扎ECA后在结扎处中间剪断，使用动脉夹夹闭CCA和ICA,夹持住ECA残端，使用0.5mL注射器楔形面紧贴血管，与ECA上滑刺一小缺口，将线栓送人缺口处后，稍用力向外（以颈部正中为内）牵拉ECA残端，以避免线栓误人翼聘动脉（p t e r y g o p a l a t i n e a r t e r y，PPA），松开ICA上的血管夹，将线栓缓缓向里推送，至线栓黑色标记处接近分岔处，稍微感受到阻力时，立即停止插入线栓，结扎线栓人口处，清理并整理伤口，俯卧位置于恒温垫上。梗死1h后,再次暴露CCA,取出线栓,拉紧结扎线，确认无出血后缝合伤口。2.1.2成模的判断及造模后的护理动物苏醒后，具有以下4项体征则表示模型制作成功 8 1：（1)提尾时右前肢内收屈曲（即提尾悬空实验阳性)；(2)左眼Horner征；(3)爬行时向右划圈；（4)站立时向右侧倾倒。小鼠脑缺血再灌注损伤造模难度较大，文献报道的死亡率较高，本实验在造模过程中全程使用摇臂显微镜以充分暴露术野，在插人线栓时向外稍用力牵拉ECA残端，以防止误插入PPA，推送线栓时1157司。解剖显微镜（型号：MSD203）、摇臂显微镜（型号：ST6024-B1)由科学实验中心动物房提供。万分之一电子天平（型号：PL203)购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。TUNEL试剂盒（批号：11684817910）、PC R 仪（型号：LC96)购自上海罗氏制药有限公司。电泳仪（型号：PowerPacTMHC）、化学发光成像仪（型号：7 32 BR2019)购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司。2方法2.1动物造模2.1.11158稍看到线栓弯曲即停止，以避免蛛网膜下腔出血,采用取出线栓后再次结扎血管再缝合皮肤的办法，以防止拔栓后出血。术后立即予生理盐水以补充体液流失并消毒伤口。苏醒后每日常规消毒、抗感染、补充能量并严格控制环境温度。使用此饲养和护理方案，能够明显提升模型小鼠的成活率，预实验小鼠成活率为9 3.33%。2.1.3分组与给药方法随机挑选出空白组与假手术组后，将造模成功的小鼠随机分为模型组、壮通饮组、阿司匹林组、壮通饮联合阿司匹林组，每个给药组再随机分为1、3、7 时点组，每时点每组10 只。实验过程中每天10:0 0 给予每只小鼠10%葡萄糖水0.2mL/10g灌胃，16:0 0 给予聚维酮碘擦拭伤口消毒,并腹腔注射兽用青霉素钠4万单位。2 0:0 0 按分组以0.1mL/10g的灌胃体积灌胃给药,空白组不给药，假手术组及模型组予生理盐水两次，壮通饮组予壮通饮溶液1次及生理盐水1次，阿司匹林组予阿司匹林溶液1次及生理盐水1次，壮通饮联合阿司匹林组予壮通饮溶液1次及阿司匹林溶液1次。2.2神经功能评估各组实验动物在造模成功后8 h以及此后每天参照Zea Longa5分评分法进行神经功能缺损评分，评分者为3人，每人独立评分后汇总，求其平均值作为该小鼠神经功能得分。2.3脑梗死体积百分比测定到达相应各组时间点后随机选取5只小鼠，采用TTC染色法测定脑梗死体积百分比。小鼠麻醉后心脏灌注冰生理盐水，而后快速断头取脑，去除嗅脑、小脑和低位脑干，置于-2 0 冰箱中冷冻2 0 min，从额极开始，每隔2 mm切1片。将切片置于2%TTC染液中，置于37 温箱30 min，每隔10 min翻面1次。染色结束后,将切片放置于多聚甲醛溶液中，固定2 4h后,白光下拍照。拍照结果用Image-proplus6.0扫描并计算脑梗死体积百分比。校正脑梗死体积百分比=总梗死体积-（梗死侧半球体积-梗死对侧半球体积)/梗死对侧半球体积10 0%9 2.4HE染色小鼠麻醉后心脏灌注冰生理盐水，而后快速断湖南中医药大学学报http:/2023年第43卷头取脑，将梗死侧脑组织保存于多聚甲醛溶液中静置2 4h后，制成石蜡块。制作成石蜡切片后将其依次放人二甲苯、无水乙醇中，而后将切片放人苏木素染液染3 5min，再用分化液分化，返蓝液返蓝，每个步骤后都使用纯水冲洗切片。将切片人梯度乙醇脱水，人伊红染液中染色5min。将切片依次放入无水乙醇、二甲苯中使其透明,中性树胶封片。使用显微镜镜检，采集图像进行分析。2.5TUNEL法检测小鼠神经细胞凋亡将制好的石蜡切片依次放入二甲苯、梯度乙醇中脱水，按照TUNEL试剂说明书依次进行操作，将最终的切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。随机选择5个视野,计算凋亡细胞核(绿色荧光)与细胞核总数（蓝色荧光)的百分比。即TUNEL指数=(凋亡细胞数/总细胞数)10 0%。2.6透射电镜观测线粒体结构小鼠麻醉后心脏灌注冰生理盐水，而后快速断头取脑,避免牵拉与挤压,剪下相对小的梗死侧脑组织置于戊二醛电镜固定液中室温固定2 0 min，使组织变硬后修剪成1mmxl mmx1 mm大小的组织块，置于充足电镜固定液中4固定2 h，室温固定、脱水、包埋后使用超薄切片机切制成6 0 8 0 nm的超薄切片。铀铅双染色后，透射电子显微镜下观察神经细胞的线粒体结构,采集图像，分析结果。2.7免疫印迹技术检测梗死侧P62、LC 3II/LC 3I情况小鼠麻醉后心脏灌注冰生理盐水，而后快速断头取脑，取梗死侧大脑皮层组织，使用液氮转移至-8 0 冰箱中保存。取出组织样本,提取总蛋白后使用BCA法测定总蛋白浓度，使用雅酶预制胶试剂盒制作12.5%电泳胶，以7 5V/0.5h-110V/1.0h条件电泳,2 0 0 mA/1h条件转膜，一抗4孵育过夜，二抗常温孵育1h,使用雅酶ECL超敏化学发光液显影,以-actin为内参对照进行条带的数据标准化，使用Image lab对条带信号进行分析。2.8RT-PCR检测梗死侧P62、Bc 1-2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirusE1B19kDainter-acting protein3,BNIP3)的表达取出保存在-8 0 中的组织样本,使用Promega2023年第43卷RNA提取试剂盒，按说明书逐步进行总RNA的提取，变性后使用Roche试剂盒进行逆转录及上机，以-actin为内参,在Roche LC96 PCR仪上扩增进行反应，引物序列详见表1。记录ct值作为统计参数，用比较2-ACT 法计算mRNA相对表达水平。表1RT-PCR检测引物序列引物名称引物序列53P62正向：GAACTCGCTATAAGTGCAGTGT反向：AGAGAAGCTATCAGAGAGGTGGBNIP3正向:CTGGGTAGAACTGCACTTCAG反向:GGAGCTACTTCGTCCAGATTCAT-actin正向:ATCATTGCTCCTCCTGAGCG反向：CAGCTCAGTAACAGTCCCCC2.9统计学处理实验结果采用SPSS25.0统计软件分析处理。所有数据均以“x土s”表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett-t法或S-N-K法，以P0.05)。与同时点空白组、假手术组比较,模型组小鼠在1、3、7 d时体质量均下降(P0.05)。与同时点模型组比较，给药组小鼠在3、7 d时体质量均上升(P0.05）。与同时点阿司匹林组比较，壮通饮联组别空白组假手术组模型组壮通饮组阿司匹林组壮通饮联合阿司匹林组注：与空白组、假手术组比较，P0.05；与同时点模型组比较，P0.05；与同时点阿司匹林组比较，*P0.05。组别模型组壮通饮组阿司匹林组壮通饮联合阿司匹林组注：与同时点模型组比较，P0.05；与本组造模后比较，P0.05)。与同时点模型组比较,给药组小鼠在1、3、7 d 时ZeaLonga评分均下降(P0.05)。各组扩增片段大小/bp3、7 d 时的ZeaLonga评分均较造模后下降(P0.05)。131详见表3。3.2壮通饮对小鼠脑梗死体积百分比的影响124与模型组比较,在1d时,壮通饮联合阿司匹林163组脑梗死体积百分比下降,在3、7 d时,给药组脑梗死体积百分比均下降(P0.05)。与模型组1d时比较,同组3d时升高,7 d时下降(P0.05)。给药组脑梗死体积百分比与同组前一时间点比较，均下降(P0.05)。详见表4。3.3壮通饮对小鼠病理改变及神经细胞凋亡率的影响HE染色结果如图1所示。与空白组及假手术组比较,造模组、给药组在1d时均呈中度异常,其后给药组病理改变均得到缓解,至7 d时脑组织结构轻度异常，少量神经元变性，被胶质细胞吞噬，给药组之间未见明显差异。模型组病理改变在3d时加重，在7 d时缓解。TUNEL调亡结果详见图2、表5。与空白组、假手术组比较，模型组神经细胞凋亡率升表2 各组小鼠各时间点体质量(xs,g,n=10)造模前18.960.5818.700.5818.830.5518.700.5718.810.5618.910.44表3各组小鼠行为学评分（xs，分，n=10）造模后2.600.482.370.492.450.502.420.541159合阿司匹林组小鼠在3、7 d时的体质量均上升(P1d3d19.900.6221.450.8319.110.6820.660.7717.720.64417.780.484*17.340.5418.430.62*17.490.6518.710.69#18.350.5919.720.70*1 d3d2.330.531.800.34*41.680.44#1.130.28*41.530.47#1.080.18*41.670.50*1.100.21*7d24.260.7023.510.4919.740.59420.220.81#21.371.06*21.930.53*7d0.700.48*40.100.32*40.100.32*0.100.32*41160表4各组小鼠各时点的TTC脑梗死体积百分比变化(xs,%,n=5)组别1 d模型组29.521.98壮通饮组28.471.38阿司匹林组27.122.12壮通饮联合阿司匹林组2 6.7 8 2.0 0#注：与模型组比较，P0.05；与阿司匹林阳性对照组比较,*P0.05；与本组1d时比较，P0.05;与本组3d时比较，AP0.05。高(P0.01)。与模型组比较,在1 d时,壮通饮联合阿司匹林组神经细胞凋亡率下降,在3、7 d时,给药湖南中医药大学学报http:/3d37.171.47*420.792.04#421.452.09*419.592.29#2023年第43卷组的神经细胞凋亡率均下降(P0.05)。与本组1 d时比较,模型组在3d时神经细胞调亡率升高,在7 d7d时神经细胞凋亡率下降,给药组在3、7 d时均下降27.551.93*4(P0.05)。与本组3d时比较,给药组在7 d时神经13.371.74#4细胞凋亡率均下降(P0.05）。9.981.48#3.4壮通饮对小鼠神经细胞线粒体结构的影响本实验中线粒体电镜超微结构显示，空白组、假手术组神经元细胞线粒体结构尚可，膜完整，平行排列，偶见个别膜内基质变淡、减少，未见典型自噬小体及自噬溶酶体形成。在各造模组中可观测到NormalShamMZAZ+A1d图1HE病理染色结果(10 0)注：Normal.空白组；Sham.假手术组；M.模型组；Z.壮通饮组A.阿司匹林组；Z+A.壮通饮联合阿司匹林组。黑色箭头：细胞核，红色箭头：细胞水肿，绿色箭头：胶质细胞。3d7d表5各组小鼠各时点神经细胞凋亡率比较（xs，%,n=5)组别空白组假手术组模型组壮通饮组阿司匹林组壮通饮联合阿司匹林组注：与空白组、假手术组比较，AAP0.01。与同时点模型组比较，P0.05；与本组1d时间点比较，P0.05；与本组3d时间点比较，P0.05。1 d1.611.251.740.5531.523.994口26.942.0825.402.4622.982.36*3d1.611.252.050.7640.492.1544*419.843.29*20.474.69*418.622.52*47d1.611.251.750.3427.322.1444*413.813.44*13.122.90*10.871.89#4口2023年第43卷线粒体肿胀、空泡变性和消失等损伤现象。模型组线粒体受损程度明显较给药组严重，在1d时可见较多受损线粒体，仅偶见线粒体自噬小体存在，在3d时可见较多线粒体自噬小体，在7 d时可见自噬小体及自噬溶酶体存在。各给药组在电镜结果上未见明显差异,均在1d时可观测到线粒体自噬小体较模型组多，在3d时可见自噬溶酶体及脂滴,在7 d时大多数线粒体结构完整，可见被溶酶体消化完成的脂滴，壮通饮联合阿司匹林组的神经元细胞在第7 天时已未见明显损伤。详见图3。3.5壮通饮对MCAO小鼠P62、LC 3、LC 3I、BNIP3表达的影响与假手术组比较，同时点模型组P62蛋白表达下降(P0.05)。与模型组比较,给药组的P62蛋白表达均在1 d时降低,在3、7 d时升高(P0.05)。与阿司匹林组比较，壮通饮联合阿司匹林组的P62蛋白表达在1 d时降低,在3、7 d时升高(P0.05)。与本组1d时比较，壮通饮组在3、7 d时的表达差异无统计学意义，而阿司匹林组、壮通饮联合阿司匹林组P62蛋白表达升高(P0.05)。与本组3d时相比,壮1dTUNELDAPIMERGENormal1d3dTUNELDAPIMERGETUNELDAPIMERGE图2 各组小鼠各时点神经细胞凋亡情况（10 0)注：Normal.空白组；Sham.假手术组；M.模型组；Z.壮通饮组；A.阿司匹林组；Z+A.壮通饮联合阿司匹林组。湖南中医药大学学报http:/MA1161通饮联合阿司匹林组在7 d时P62蛋白表达降低(P0.05)。详见图4、表6。与假手术组比较,同时点模型组LC3I/LC 3I蛋白比值上升(P0.05)。与模型组比较,给药组LC3/LC 3I 蛋白比值均在1 d时上升,在3d时下降(P0.05）。与阿司匹林组比较，壮通饮联合阿司匹林组LC3/LC 3I 蛋白比值在1d时升高,在3、7 d时降低(P0.05)。与本组1d时比较,在3、7 d时模型组蛋白比值均上升，各给药组蛋白比值均下降(P0.05)。与本组3d时比较，除假手术组、壮通饮联合阿司匹林组外,其余各组蛋白比值均上升(P0.05)。详见图4、表7。与同时点假手术组比较,模型组P62mRNA,BNIP3mRNA表达在3、7 d时升高(P0.05）。与模型组比较,给药组P62mRNA、BNI P3m R NA 表达均在1d时升高,在7 d时降低(P0.05)。与阿司匹林组比较,壮通饮联合阿司匹林组P62mRNA、BNI P3m R NA表达在1d时升高,在3、7 d时降低(P0.05)。与同组1d时比较,7 d时模型组P62mRNABNIP3mRNA表达均上升，给药组P62mRNA、BNI P3m R NA 表达均下降(P0.05)。详见表8 一9。3d7dSham7d1d3dZZ+A7d1162湖南中医药大学学报http:/2023年第43卷空白组假手术组模型组壮通饮组阿司匹林组壮通饮联合阿司匹林组1 d图3各组小鼠各时点线粒体电镜超微结构（10 0 0)注：Normal.空白组；Sham.假手术组；M.模型组；Z.壮通饮组；A.阿司匹林组；Z+A.壮通饮联合阿司匹林组。红色箭头：正常线粒体；黄色箭头：受损线粒体；黑色箭头：自噬小体；绿色箭头：自噬溶酶体；紫色箭头：脂滴。3d7dP621dLC3 IILC3 I-actinP62LC3II3dLC3 I-actinP62LC3II7dLC3I-actinNormal Sham图4各组小鼠各时点P62、LC 3I、LC 3I 蛋白电泳图注：Normal.空白组；Sham.假手术组；M.模型组；Z.壮通饮组；A.阿司匹林组；Z+A.壮通饮联合阿司匹林组。4讨论脑梗死,在壮医学中称为“麻邦”,是由各种原因导致三道两路不通，三气不能同步，气血上逆冲击“巧坞”致使“巧坞 功能失调所致。壮通饮由扶芳藤、黄花倒水莲、参三七组成，是壮医治疗脑梗死的62kDa18 kDa14 kDa42 kDa62kDa18 kDa14kDa42kDa62 kDa18 kDa14 kDa42kDaMZAZ+A表6 各组P62蛋白相对表达情况(xs,n=5)组别1 d假手术组0.910.12模型组0.600.174壮通饮组0.450.09#阿司匹林组0.390.07#壮通饮联合阿司匹林组0.290.05*注：设置空白组相对表达量为1,其余各组为相对空白组的表达量；与假手术组比较，AP0.05；与模型组比较，P0.05；与阿司匹林组比较，*P0.05；模型组、给药组与同组1d时间点比较，-P0.05；模型组、给药组与同组3d时间点比较，P0.05。表7 各组LC3I/LC3I蛋白相对表达情况(xs,n=53)组别假手术组模型组壮通饮组阿司匹林组壮通饮联合阿司匹林组4.52 0.2 1*注：设置空白组相对表达量为1,其余各组为相对空白组的表达量；与假手术组比较，P0.05；与模型组比较，P0.05；与阿司匹林组比较，*P0.05；模型组、给药组与同组1d时间点比较，P0.05；模型组、给药组与同组3d时间点比较，P0.05。3d1.060.150.470.14440.570.12#0.600.12*0.920.10*41 d3d0.940.111.080.212.340.4243.710.17443.180.21#1.870.19*43.780.17#1.320.09#41.020.13*47 d0.930.130.330.08440.500.16#0.570.0740.680.16*口7d1.000.145.270.2144口2.150.17*4口1.530.28#口1.040.16*42023年第43卷表8 各组各时点P62mRNA相对表达情况（xs,n=5)组别假手术组模型组壮通饮组阿司匹林组壮通饮联合阿司匹林组1.7 30.32*（注：设置空白组相对表达量为1,其余各组为相对空白组的表达量；与假手术组比较，P0.05；与模型组比较，P0.05；与阿司匹林组比较，*P0.05；模型组、给药组与同组1d时间点比较，P0.05；模型组、给药组与同组3d时间点比较，P0.05。表9 各组各时间点BNIP3mRNA相对表达情况(xs,n=5）组别假手术组模型组壮通饮组阿司匹