转座酶可及性染色质测序法联合RNA测序探究解旋酶样转录因子基因的缺失对肝细胞癌的影响.pdf

论 著7肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期转座酶可及性染色质测序法联合 RNA 测序探究解旋酶样转录因子基因的缺失对肝细胞癌的影响张艺旋，马亚锐，王小兵，焦宇辰*（国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院细胞生物学及分子生物学研究室，北京100021）摘要目的：探究解旋酶样转录因子（helicaseliketranscriptionfactor，HLTF）基因在肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）中潜在的调控机制。方法：构建 HLTF 基因稳定敲除的 HCC 细胞株。应用 RNA 测序法（RNAsequencing，RNA-seq）检测并分析肝癌细胞 HLTF 基因敲除前后的差异表达基因。应用转座酶可及性染色质测序法（assayfortransposase-accessiblechromatinusingsequencing，ATAC-seq）检测 HLTF 基因敲除前后肝癌细胞染色质可及性的改变。采用 RNA-seq 和 ATAC-seq 多组学数据进行联合分析，寻找 HLTF 基因潜在的下游调控通路和关键基因。结果：癌症基因组图谱（thecancergenomeatlas，TCGA）数据库分析表明 HLTF基因在 HCC 组织中的表达水平升高，且其高表达与 HCC 预后不良有关联；RNA-seq分析结果显示，与野生型肝癌细胞相比，HLTF 基因敲除细胞中有 563 个基因的表达水平上调，656 个基因的表达水平下调；ATAC-seq 分析结果显示，共 27818 个区域在 HLTF 基因缺失时染色质可及性发生显著改变，其中 14225 个区域染色质可及性增强，13593 个区域染色质可及性减弱；对染色质可及性改变的区域进行 motif 富集分析，数据显示在染色质可及性增强的区域，Atf3、Fra1 和 BATF 等被富集，在染色质可及性减弱的区域，Fra1、Fra2和JunB等被富集；RNA-seq和ATAC-seq多组学数据联合分析表明，重叠基因主要富集在花生四烯酸代谢通路、Wnt 信号通路、钙离子信号通路和转化生长因子（transforminggrowthfactor，TGF-）信号通路等。HLTF 基因的缺失使核 RNA 输出因子 3（nuclearRNAexportfactor3，NXF3）基因表达水平升高。NXF3 基因高表达的 HCC患者的预后较 NXF3 基因低表达的 HCC 患者好。结论：在 HCC 中，HLTF 基因可能参与调控花生四烯酸代谢通路、Wnt 信号通路和 TGF-信号通路等，NXF3 基因可能是 HLTF 基因的潜在下游基因。关键词：转座酶可及性染色质测序法；RNA 测序法；肝细胞癌；解旋酶样转录因子Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing combined with RNA sequencing to explore the effect of helicase like transcription factor deletion on hepatocellular carcinomaZhang Yixuan,Ma Yarui,Wang Xiaobing,Jiao Yuchen*(Department of Cell Biology and Molecular Biology,National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital,Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College,Beijing 100021,China)AbstractObjective:To investigate the potential regulatory mechanism of helicase like transcription factor(HLTF)in hepatocellular carcinoma(HCC).Method:HLTF was knockout through clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated protein 9(Cas9)in HCC cell line.RNA sequencing(RNA-seq)was applied to detect and analyze the differentially 张艺旋国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院细胞生物学及分子生物学研究室基金项目：国家自然科学基金面上项目（82172988）*通信作者：焦宇辰，E-mail：论 著8肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，2020 年全球约有 90 万人确诊为肝癌。肝癌最常见的亚型是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）1，其死亡率居全球癌症死亡率第 3 位，5 年生存率仅 18%2。大多数 HCC患者确诊时已处于癌症晚期，无法采用手术切除术、肝移植术或局部经皮消融术等方式进行治疗3。解 旋 酶 样 转 录 因 子（helicase like transcription factor，HLTF）是 核 小 体 重 塑 复 合 物（Switch/sucrose nonfermentable，SWI/SNF）家族的成员，含有一个 ATP酶结构域和一个 E3 泛素连接酶结构域4。这两个蛋白都含有一个 HIRAN（HIP116 and RAD5 N-terminal）结构域，该结构域专门与 3-OH 端单链 DNA 结合以维持基因组稳定性5-6。有研究在 40%的结直肠癌患者中观察到 HLTF 基因高度甲基化，同时这些患者肠道肿瘤的发生加速7，提示 HLTF 是一种肿瘤抑制因子。此外，在胃癌和宫颈癌患者中也存在 HLTF 基因高度甲基化8-10。然而两项关于 HLTF 基因的肝癌研究11-12显示，仅 6.3%和 9.8%的肝癌患者 HLTF 基因启动子甲基化。因此，HLTF 基因在 HCC 中的作用机制仍需要进一步研究。染色质可及性是指细胞核内大分子能够物理接触染色质化 DNA 的程度。绝大多数转录因子（transcription factor，TF）几乎只与开放染色质结合13。TF 能够对转录进行动态调控，并建立和维持一个持久的表观遗传环境。因此，染色质的可及性反映了 TF 结合和对一个基因位点的调控潜力。最近开发的转座酶可及性染色质测序法（assay for transposase-accessible chromatin using sequencing，ATAC-seq）可以对全基因组的染色质进行分析，将染色质可及性与转录组数据相结合，能够确定可能参与调控细胞内信号通路的关键基因，有助于阐明疾病发生的分子调控机制。本研究利用 ATAC-seq 联合RNA 测序法（RNA sequencing，RNA-seq）初步探究HLTF 基因在 HCC 中可能的调控机制，旨在初步揭示其功能。1 材料与方法1.1 细胞和试剂 HepG2 肝癌细胞系，HEK-293T 细胞系（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）；DMEM 培养基，RPMI 1640 培养基，胎牛血清，青霉素-链霉素混合液，胰酶细胞消化液（0.25%）（北京细工生物科技有限公司）；LentiCRISPR V2 载体 质 粒，psPAX2 质 粒，pMD2.G 质 粒（Addgene 公司）；sgRNA 序列由北京擎科生物科技有限公司合成；Neofect DNA Transfection Reagent 转染试剂（零客创智生物科技有限公司）；蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（MedChenExpress 公司）；RIPA 蛋白裂解液（北京普利莱基因技术有限公司）；PVDF 膜（Millipore 公司）；NanoDrop 核酸定量仪（Thermo Fisher Scientific 公司）；Tn5 转座酶（Vazyme Biotech 公司）；Zymo DNA Clean&ConcentratorTM-5 试剂盒（Zymo Research 公司）。1.2 实验方法1.2.1 解旋酶样转录因子基因敲除细胞系的构建 根据HLTF基因序列，设计得到3对sgRNA序列并合成（表1）。将LentiCRISPR V2载体线性化之后与sgRNA连接，将连接后的质粒转入DH5后扩增，测序鉴定无误后，使用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒后进行慢病毒的包装。表 1 sgRNA 序列序列名称碱基序列sgRNA1-F5-GTT GGA CTA CGC TAT TAC A-3sgRNA1-R5-TGT AAT AGC GTA GTC CAA CC-3sgRNA2-F5-GTC CAT TAC ATA GCA TAA GG-3sgRNA2-R5-CCT TAT GCT ATG TAA TGG AC-3sgRNA3-F5-AAG GCA GAT GGA CTA AGC AA-3sgRNA3-R5-TTG CTT AGT CCA TCT GCC TT-3expressed genes of the wild type and HLTF knockout cells.Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing(ATAC-seq)was applied to detect the changes in chromatin accessibility of the wild type and HLTF knockout cells.The multi-omics analysis of RNA-seq and ATAC-seq was used to find the key signaling pathways and downstream genes of HLTF.Result:The cancer genome atlas(TCGA)database analysis showed that HLTF was highly expressed in HCC and was associated with poor prognosis;RNA-seq sequencing showed that 563 genes were up-regulated and 656 genes were down-regulated in HLTF knockout cells compared to wild-type cells;ATAC-seq analysis showed a total of 27 818 regions had significantly altered in chromatin accessibility with HLTF deletion,including 14 225 regions with enhanced chromatin accessibility and 13 593 regions with weakened chromatin accessibility;motif enrichment analysis showed that Atf3,Fra1 and BATF were enriched in regions with enhanced chromatin accessibility,Fra1,Fra2 and JunB were enriched in regions with weakened chromatin accessibility;the combination of RNA-seq and ATAC-seq analysis showed that the overlapping genes were mainly enriched in the arachidonic acid metabolism pathway,Wnt signaling pathway,calcium signaling pathway and the transforming growth factor (TGF-)signaling pathway;the deletion of HLTF increased the expression of nuclear RNA export factor 3(NXF3)and highly-expressed NXF3 was associated with better prognosis in HCC patients.Conclusion:Our study pointed out that HLTF may be involved in regulating arachidonic acid metabolism pathway,Wnt signaling pathway,TGF-signaling pathway,etc.NXF3 may be a potential downstream gene of HLTF,and our study provided directions and ideas to elucidate the mechanism of HLTF in HCC.Key words:Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing;RNA sequencing;Hepatocellular carcinoma;Helicase like transcription factor论 著9肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期将 HepG2 细胞铺在 6 孔板中培养，当细胞生长融合达到 70%80%时，取 500l 病毒加入细胞中，24h后换成完全培养基，48h 后每孔加入含有 2g/ml 的嘌呤霉素培养基筛选阳性细胞，筛选 48h 后，将阳性细胞进行单克隆筛选，并测序验证。1.2.2 免疫印迹法 胰酶消化收集 HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞，用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的 RIPA蛋白裂解液裂解细胞，在 4条件下以 12 000r/min（r=8.5cm）离心 15min，分离上清液，使用 BCA 法行蛋白定量后进行 SDS-PAGE 蛋白电泳。然后将分离的蛋白质转移到 PVDF 膜上。用 5%的脱脂奶粉封闭1h，一抗 4孵育过夜。第 2 日用同种属的 HRP 结合的二抗室温孵育 2h，之后使用超敏发光液进行化学发光检测。本研究中使用的抗体为：重组 Anti-HLTF 抗体（Abcam 公司，ab183042，1:1 000）；GAPDH 兔多克隆抗体（Abclonal 公司，AC001，1:1 000）；HRP 羊抗兔（H+L）（Abclonal 公司，AS014，1:1 000）。1.2.3 转座酶可及性染色质测序法分析 在 4下，将 HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞 500g 离心 10min 后收集 50 000 个细胞。用含 10mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、10mmol/L NaCl、3mmol/L MgCl2和 0.1%（V/V）Igepal CA-630 的缓冲液裂解细胞，使用 Tn5 转座酶对细胞核进行标记，然后用 Zymo DNA Clean&ConcentratorTM-5试剂盒纯化被标记的 DNA。使用 NEBNextQ5Hot Start HiFi PCR Master Mix 扩增标记的 DNA 片段以制备文库。使用 Zymo DNA Clean&ConcentratorTM-5 试剂盒纯化文库。将文库整合在 Illumina Hiseq X Ten 上进行量化和测序。1.2.4 转座酶可及性染色质测序法数据处理 使用FastQC 软件评估测序质量。使用质控合格的序列进行下一步分析。使用 TrimGalore 软件去除接头和低质量序列。使用 Bowtie2 软件将序列比对到 hg19 参考基因组上，并去除比对质量低的序列和比对到线粒体 DNA上的序列。使用 Picard 软件中的 MarkDuplicates 算法去除由于 PCR 产生的重复序列。使用 MACS2 寻找峰值。使用 DiffBind 识别差异性 ATAC-seq 峰，阈值设置为错误发现率（false discovery rate，FDR）0.05。使用ChIPseeker 对峰进行注释，基因转录起始点上游或下游3kb 内的区域被视为启动子。1.2.5 RNA 测序法分析 从样本中提取总 RNA，NanoDrop 测定 RNA 浓度。利用带有 oligo-dT 的磁珠从总 RNA 中分离 mRNA，并将捕获的 mRNA 进行片段化处理。然后利用逆转录酶合成 cDNA 并对逆转录产物进行末端修复，然后在 3 末端加 A 碱基。随后，将该片段与测序接头相连接。连接产物经过纯化，去除连接不完整的产物及接头自连产物后，使用与接头序列互补的引物进行 PCR 扩增。最后用磁珠纯化得到测序文库。库检合格后，用 Illumina Novaseq 6000 测序平台对文库进行 PE150 测序。1.2.6 RNA 测序法数据处理 利用 FastQC（v0.11.9）软件对高通量测序平台的原始数据进行质量检测。使用fastp（v0.22.0）软件14对原始测序数据中可能出现的测序接头进行剪切去除，同时去除原始序列中低质量碱基序列和模糊碱基比例较高的序列，同时要求质控后序列长度至少为 75bp，剩余的高质量数据用于后续的生信分析流程。本研究使用 STAR（v2.4.2a）软件15比对 RNA 测序数据到参考基因组（hg19）。本研究以所有修剪平均 M 值（trimmed mean of M values，TMM）和每百万计数（counts per million，CPM）标准化的基因表达量为输入文件，筛选在至少 2 个样本表达量都大于 1 的基因进行聚类分析。本研究以原始的序列数表格为输入文件，应用 R 语言（3.5.1）软件中的 edgeR 包进行数据的校正和标准化，然后筛选至少一个样本中表达值CPM大于1的基因进行差异分析。应用edgeR（v3.28.1）软件16使用 over dispersed Poisson 模型统计序列数，并应用 empirical Bayes 对所有基因表达量的离散度进行校正。最终显著差异表达基因的筛选标准为：P adj0.05 且差异倍数（fold change，FC）的绝对值|FC|2。1.2.7 RNA 测序法和转座酶可及性染色质测序法数据的联合分析 将 RNA-seq 的差异基因和 ATAC-seq 的差异表达峰进行联合分析，得到在 RNA-seq 和 ATAC-seq 中调控一致的下游基因。使用 DAVID 生物信息学数据库（https:/david.ncifcrf.gov/）对重叠基因进行基因本体论（gene ontology，GO）分析及京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路分析，注释基因功能。1.3 统计学方法 采用 R 语言（3.5.1）软件进行统计学分析。RNA-seq 差异基因筛选标准为 P adj0.05且|FC|2，ATAC-seq 差 异 可 及 峰 筛 选 阈 值 为FDR 0.05，KEGG 和 GO 富 集 分 析 筛 选 标 准 为P0.05，FDR0.25。通过 TCGA、UALCAN 等在线数据库统计数据，两组间的比较采用 Wilcoxon 秩和检验；通过 Kaplan-Meier plotter 数据库进行生存分析，并采用log-rank 检验进行比较；相关性分析采用 Pearson 相关分析。以 P0.05，图 1a）。Kaplan-Meier 生存分析结果显示，HLTF 基因甲基化水平较高的 HCC 患者与 HLTF 基因甲基化水平较低的 HCC 患者的预后差异无统计学意义（图 1b）。为进一步分析 HLTF 基因在 HCC 中的表达及对 HCC 患者预后的影响，使用在线 UALCAN 数据库分析癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）-HCC 队列的 HLTF 基因表达水平，结果显示 HLTF 基因在 HCC论 著10肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期组织中高表达（图 1c），HLTF 基因高表达的 HCC 患者的预后较 HLTF 基因低/中表达的 HCC 患者更差（P0.05，图 1d），提示 HLTF 基因在 HCC 中可能具有促癌作用。2.2 解旋酶样转录因子基因敲除前后基因表达谱分析 为进一步探究 HLTF 基因对 HCC 中基因表达谱的影响，本研究利用成簇规律间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和 CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR-associated protein 9，Cas9）系统在 HepG2 细胞中稳定敲除了 HLTF 基因。免疫印迹法检测结果显示，与 HepG2-WT 细胞相比，HepG2-KO 细胞中 HLTF 蛋白几乎不表达（图 2a）。单克隆细胞测序结果表明，HepG2-KO 细胞中 HLTF 基因序列存在 5 个碱基缺失，形成移码突变（图 2b）。这些结果证明 HLTF 基因稳定敲除的 HCC 细胞系成功构建。为研究 HLTF 基因调控的转录组改变，本研究对HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞进行了转录组测序分析。差异表达基因分析结果显示，在HLTF基因敲除细胞中，563 个基因的表达水平显著上调，656 个基因的表达水平显著下调（图 2c、2d）。图 1 HCC 中HLTF基因的甲基化程度、表达水平和预后注：在线EWAS Data Hub数据库（https:/ HCC组织和癌旁正常组织HLTF甲基化水平（a）和Kaplan-Meie生存曲线（b）；在线 UALCAN 数据库（http:/ualcan.path.uab.edu/）中 HCC 组织和癌旁正常组织中 HLTF 基因的表达（c）和 Kaplan-Meie 生存曲线（d）。论 著11肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期2.3 转座酶可及性染色质测序法分析 使用 HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞的 ATAC-seq 分析进一步探究HLTF 基因缺失对肝癌细胞染色质可及性影响。质控结果显示酶切片段长度频率分布正常（图 3a），回帖序列主要富集在转录起始位点（transcription start site，TSS）（图 3b），随后对细胞间的差异可及峰进行聚类分析（图 3c）和差异分析，发现 27 818 个区域在 HLTF基因缺失时染色质可及性显著改变，其中 14 225 个区域染色质可及性增强，13 593 个区域染色质可及性减弱（图 3d）。比较注释结果在全基因组范围相互位点数据发现，位于 TSS 上游 3kb 以内的区域占比在 HLTF 基因缺失后上调了 33.45%，这些区域富含启动子和增强子，表明由于调控区域 HLTF 基因缺失，其下游调控基因表达可能发生改变（图 3e、3f）。为探究 HLTF 基因缺失引起的转录因子改变，本研究对染色质区域的可及性改变进行了 motif 富集分析，显示 Fos 在染色质可及性增强和减弱的富集的motif中均为首位。Fos是一种核磷蛋白，与 c-Jun 形成异二聚体，而后形成激活蛋白 1（activator protein-1，AP-1）复合物，该复合物与靶基因启动子和增强子区域特定位点处的 DNA 结合，将细胞外信号转化为基因表达的变化。此外，在染色质可及性增强的区域，Atf3、Fra1、BATF、AP-1 被富集；在染色质可及性减弱的区域，Fra1、Fra2、JunB、Atf3 被富集（图3g、3h）。这些转录因子可能在调节 HLTF 基因缺失的肝癌细胞反应中发挥核心作用。图 2 HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞的 RNA-seq 分析注：a.免疫印迹法分析 HepG2-WT 和 HepG2-KO 中 HLTF 蛋白表达水平；b.HepG2-KO 单克隆细胞中 HLTF 基因的 sanger 测序结果比对；c.HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞的聚类分析；d.HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞差异表达基因的火山图。论 著12肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期图 3 HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞的 ATAC-seq 分析注：a.核小体片段长度分布图；b.TSS 处读数富集；c.具有显著差异（FDR 0.05）的峰的染色质开放水平热图；d.具有显著差异（FDR 0.05）的峰的火山图；e.HepG2-KO 细胞中染色质可及性增强峰在基因组上的分布；f.HepG2-KO 细胞染色质可及性减弱峰在基因组上的分布；g.染色质可及性增强的 motif 富集图；h.染色质可及性减弱的 motif 富集图。论 著13肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期2.4 解旋酶样转录因子基因的功能和通路富集分析 HLTF 基因缺失介导的调控区域中染色质状态变化可能会影响该区域转录因子结合，进而导致下游基因表达异常。本研究将 RNA-seq 分析结果中的差异表达基因与 ATAC-seq 分析结果中差异染色质开放区域进行联合分析，预测可能因 HLTF 基因缺失而表达改变的基因，与对照细胞相比，共有 292 个重叠基因，其中 132 个上调（图 4a），160 个下调（图 4b）。通过 DAVID 数据库对关联的 292 个基因进行 GO 分析（图 4c）和 KEGG信号通路富集分析（图 4d）。结果表明，上调的重叠基因主要富集的代谢通路包括花生四烯酸代谢通路（arachidonic acid metabolism）、Wnt 信 号 通 路（Wnt signaling pathway）和钙离子信号通路（calcium signaling pathway）等；下调的重叠基因主要富集在转化生长因子（transforming growth factor，TGF-）信号通路（TGF-signaling pathway），谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism）、癌 症 蛋 白 聚 糖 通 路（proteoglycans in cancer）和Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）等。这些数据揭示 HLTF 基因调控的基因可能通过多种生物学途径和信号通路参与 HCC 的发生和进展。图 4 基因启动子区域染色质可及性差异峰与基因表达差异基因的富集分析注：基因启动子区染色质可及性增强和基因表达上调（a）及染色质可及性减弱和基因表达下调（b）的韦恩图。重叠基因表达上调的基因富集分析（c）和表达下调的基因富集分析（d）。论 著14肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期2.5 核 RNA 输出因子 3 可能作为解旋酶样转录因子基因的潜在靶基因在肝细胞癌中发挥调控作用 在联合分析中筛选出差异表达最显著的 20 个基因（P adj0.05，|FC|2，图 5a）。其中核 RNA 输出因子 3（nuclear RNA export factor 3，NXF3）基因可及性分析表明，HLTF 基因缺失的肝癌细胞中 NXF3 启动子区域可及性增强（图 5b），这提示 HLTF 基因的表达可能与 NXF3基因的表达呈负相关。NXF3 是核 RNA 输出因子家族的成员之一，可以在细胞核和细胞质之间穿梭，能与poly（A）RNA 结合并转运17。通过 UALCAN 数据库和基因表达谱交互分析（http:/gepia.cancer- Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库揭示在差异表达最显著的 20 个基因中，NXF3基因是敲除 HLTF 基因后唯一表达相反的基因。使用在线 UALCAN 数据库分析 TCGA-HCC 队列的 NXF3 基因表达水平，结果表明 NXF3 基因在 HCC 组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织（P0.001，图 5c）；通过 GEPIA 数据库进行相关分析结果显示，HLTF 基因的表达与 NXF3 基因的表达呈负相关（图 5d）。Kaplan-Meier plotter 数据库生存分析显示 NXF3 基因高表达的HCC患者的预后较NXF3基因低表达的HCC患者好（图5e）。这些结果进一步表明 HLTF 基因在 HCC 中可能扮演癌基因的角色，HLTF 基因的表达与 NXF3 基因的表达呈负相关，高表达 NXF3 基因的 HCC 患者较低表达 NXF3 基因的 HCC 患者的生存率更高。3 讨论HLTF 与染色质重塑分子 SWI/SNF 家族同源，参与DNA 损伤修复途径，维持基因组稳定性18-19。有研究表明，HLTF 的功能性失活促进肠癌发生及进展7。而在小鼠肾脏肿瘤模型中研究人员发现 HLTF 基因激活与肾脏肿瘤癌变有关20。除此之外，HLTF 基因在放射治疗复发的宫颈癌组织中过度表达，而敲降后，细胞增殖率降低，对X线照射引起的DNA损伤修复能力下降21。但是，HLTF 基因在 HCC 患者中启动子甲基化程度并不高11-12。本研究结果也同样强调 HCC 患者 HLTF 基因甲基化处于低水平，表达及预后分析揭示 HLTF 基因表达水平增高并与预后较差有关联，提示 HLTF 基因具有促癌作用。通过构建 HLTF 基因缺失的肝癌细胞系并采用ATAC-seq 和 RNA-seq 多组学联合分析的方法对 HLTF图 5 NXF3基因与HLTF基因的关联性注：a.联合分析中差异表达上调和差异表达下调最显著的 10 个基因，120 依次为 MYOCD、ZNF93、ZNF85、DERL3、ARHGAP20、NXF3、RAET1G、CES4A、FAM20A、NPR3、SNRPN、EPB41L3、SLFN11、SOX17、PTHLH、PDE3B、KRT5、MARK1、SPINK6、SESN3 基 因；b.ATAC-seq 分析比较 NXF3 基因在 HepG2-WT 和 HepG2-KO 细胞的染色质可及性；c.在线 UALCAN 数据库（http:/ualcan.path.uab.edu/）中 HCC 组织和癌旁正常组织中 NXF3 基因的表达；d.在线 GEPIA（http:/gepia.cancer- HLTF 基因和 NXF3 基因表达的相关性分析；e.在线Kaplan-Meier plotter（http:/ NXF3 基因的差异表达对 HCC 患者生存的影响。论 著15肝癌电子杂志2023 年 第 10 卷第 2 期基因进行了综合功能分析，发现共有 292 个重叠基因，其中 132 个上调，160 个下调。上调基因主要富集在花生四烯酸代谢通路、Wnt信号通路和钙离子信号通路等，Wnt 信号通路在调节肝癌上皮细胞-间充质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、HCC 转移和耐药过程中发挥关键作用22-24。下调基因主要富集在TGF-信号通路等，TGF-信号通路能够调节多种细胞过程，包括促进细胞分化和增殖、控制细胞凋亡和细胞周期、调节 EMT、血管生成、细胞外基质形成和抑制免疫反应等25-26。既往研究也证实 TGF-信号通路激活能促进肝癌侵袭转移27，并且能产生免疫治疗抗性，导致治疗失败28。NXF3 是核 RNA 输出因子家族的成员之一，能够调节小核糖核酸（small nucleolar RNAs）在细胞核与细胞质之间的分布29，能够作为一种生物标志物预测卵巢癌发生30，NXF3 还是长非编码 RNA-AF119895 下游靶点，抑制 NXF3 表达能够减少肝癌细胞迁移和侵袭31。本研究发现 NXF3 基因在 HCC 中可能是个抑癌基因，与 HCC 更好预后有关联，提示 NXF3 在不同实体癌症中可能具有多样性功能，未来需进一步实验验证。综上所述，ATAC-seq 和 RNA-seq 多组学数据分析初步确定 HLTF 基因具有促癌作用，通过多种生物学途径和信号通路参与调节，同时调控癌基因 NXF3 的表达，这为 HLTF 基因在 HCC 中的作用机制研究提供了研究方向。参考文献1 SUNG H,FERLAY J,SIEGEL R L,et al.Global Cancer Statistics 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