虾肝肠孢子虫病及其防治手段的研究进展_韦秀颖.pdf

虾肝肠孢子虫病（Hepatopancreatic microsporidiaosis，HPM）是由虾肝肠孢子虫（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）感染引起的一种虾类专性细胞内寄生的寄生虫病。近年来该病在全世界对虾养殖区域内广泛流行，造成对虾生长缓慢综合症（MSGS），损失堪比白斑综合症病毒病（WSSV），严重影响对虾养殖业的健康与持续发展，引起了广泛关注。本文就 HPM 的病原、流行情况、传播途径、预防与检测手段及相关药物研究进展进行综述，以期为 HPM 防控提供参考。关键词：对虾；虾肝肠孢子虫；预防与检测；药物研究中图分类号：S851.34+7.34文献标识号：A文章编号：1003-4374（2023）02-0045-05Research Progress on Hepatopancreatic Microsporidiaosis and Its Control MethodsWei Xiu-ying1,2,Du Hong-ming2,Qin Shao-min1,Liu Jin-feng1,Wu Jian-min1*（1.Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology,Guangxi Veterinary Research Institute,Nanning,Guangxi 530001,China；2.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Nanning,Guangxi 530004,China）Abstract:Hepatopancreatic microsporidiaosis is an obligate intracellular parasitic disease of penaeid caused by Enterocytozoon hepatopenaei infection.In recent years,the disease has been widely prevalent in important penaeid farming areas around the world,causing Monodon Slow Growth Syndrome（MSGS）,and the loss has been comparable to with White Spot Syndrome Virus（WSSV）,seriously affecting the health and sustainable development of the penaeid farming industry,which has caused widespread concern.In this paper,the pathogen,epidemic situation,transmission route,prevention and detection methods,and related drug research progress of HPM are reviewed in order to provide a reference for the prevention and control of HPM.Key words:penaeid,enterocytozoon hepatopenaei,prevention and detection,drug research虾肝肠孢子虫（EHP）是近年来发现的一种对对虾养殖行业危害较大的寄生虫病病原，最早于 2003 年在泰国生长缓慢的斑节对虾（Penaeus monodon）中被发现，直至 2009年才被成功分离，并被定义为孢子虫属的一个新物种。1EHP 隶属于真菌界（Fungi kingdom）2微孢子虫门（Microspora）单倍期纲（Haplophase）微孢子虫目（Microsporida）微孢子虫科（Enterocytozoonidae）肠孢虫属（Entero-cytozoon）3，是一种专性的细胞内寄生虫，具有高度的传染性。EHP 可感染真核细胞宿主，在宿主细收稿日期：2023-02-16 修回日期：2023-03-09基金项目：广西北部湾海洋生物多样性重点养护实验室开放项目（2019KB03，2020KA04）。第一作者简介：韦秀颖，女，1997 年生，硕士研究生，主要从事动物传染病研究工作。*通讯作者：吴健敏，女，1963 年生，博士，研究员，主要从事动物疫病预防与控制研究工作。广西农学报462023 年胞质中生活，无需中间宿主。它既可通过受精卵或种苗垂直传播4，又可通过摄食被污染的饲料、生物饵料、死虾及生活在含有 EHP 孢子的水体中造成水平传播，该病原主要侵染凡纳滨对虾、南美白对虾、斑节对虾、日本对虾、罗氏沼虾和南美蓝对虾（P.stylirostris）导致肝肠孢子虫病，俗称“棉虾病”。EHP 主要寄生于虾肝胰腺上皮细胞，使肝胰腺小管上皮细胞与小肠上皮细胞脱落，肌肉发白，导致虾生长缓慢，增重停滞，虽不引起死亡，却极大影响生产性能，造成严重经济损失。本文就HPM的病原、流行情况、传播途径、预防与检测手段及相关药物研究进展进行综述，以期为 HPM 防控提供参考。1 EHP 形态特征EHP 成熟的孢子呈卵圆形或梨形，大小约0.7m1.1m。孢子在包囊内生长发育，由胞壁、锚定盘、孢原质、56 圈极丝、细胞核、极膜层、多个核糖体、1 个后液泡等组成。孢子具有折光性，革兰氏染色为阳性1。胞壁由 3 层结构组成，从外到内依次为高电子密度外壁，以及由蛋白质和几丁质组成的低电子密度的内壁和原生质膜。EHP 外壁上有大量白色瘤状物,疑似胞壁蛋白5。该蛋白在微孢子虫侵染宿主细胞的过程中扮演着重要的角色6-8，与孢子壁的通透性相关，很可能是控制孢子与外界物质交换的通道。微孢子虫的孢子内具有独特的侵染装置极管，与孢子顶端的锚定盘相连接。它能通过挤压穿透宿主细胞膜，将具感染性孢子体转移到宿主细胞中从而实现自身繁殖。92 流行情况与传播途径自 2003 年泰国首次报道以来，多数对虾养殖国家如印度、文莱、越南、委内瑞拉、印度尼西亚、马来西亚、泰国、澳大利亚等均陆续发现 EHP的感染10-12。中国首次报道是在 2013 年，随后在主要的对虾养殖区域先后都发现 EHP 的流行。陈禄芝等13针对粤西地区凡纳滨对虾长不大的情况进行检测，结果发现 EHP 的阳性检出率为 41.38%，其 中 成 虾 的 检 出 率 最 高 达 93.75%。许 杰 等14 于 20152017 年在天津 7 个对虾养殖主产区采集对虾及饵料生物等样品进行分批检测，结果三年EHP 阳性率分别为 56.96%、69.52%、29.28%。据2017 年国家虾蟹产业技术体系开展的被动监测结果显示，EHP 已在我国虾类主要养殖区广泛分布，在山东、河北、江苏、上海、浙江、福建、广东、海南和新疆均有不同水平的检出。15全国水产技术推广总站于 2017 年将 EHP 列为新发的重大水生动物疫病，要求重点防控。许昊川等16在 2020 年对浙江省宁波市南美白对虾虾苗主要病原携带情况进行调查，发现 EHP、虾血细胞虹彩病毒（SHIV）、WSSV 以及副溶血弧菌（VP）4 种病原中感染率最高为 EHP（8.96%）。谢艳辉等17在 2021 年对湛江地区养殖水体（高位池和低位池）EHP 感染情况进行检测，结果均为阳性。2021 年国家水生动物疫病检测计划中也把 EHP 列为检测对象18，由此说明目前为止 EHP 仍然是对虾养殖中最主要的疫病之一。虾肠肝孢子虫病一年四季都会发生，59 月是高发季节。由于 EHP 生活史较为简单，整个生命周期仅为 511d，因此，一旦有对虾染病很快会引起暴发流行，通常在养殖 40d 左右会出现 1 个暴发的高峰期。对虾感染 EHP 时其死亡率与正常虾没有显著差异，但会出现摄食减少或者摄食后生长缓慢甚至停止生长的情况。此外病虾还表现出免疫功能下降，增加了细菌、病毒和其他微生物的继发感染的概率。EHP有两种传播途径：一种是垂直传播，即通过侵染亲虾的卵巢传播给子代。另一种是水平传播，即健康虾经口摄食携带 EHP 的介体,包括寄生 EHP 的鲜活饵料、病虾、死虾或环境中的孢子体而感染。19EHP 先在虾肝胰腺细胞内形成孢原质，待孢子成熟，可通过粪便排出体外，在水环境中形成孢子体，分布于水体或附着于饲料表面、藻类、碎屑及养殖塘底泥环境中，孢子可在养殖环境中累积进行传播。3 检测手段与防治方法EHP 感染隐蔽性强，无特定示病症状，当虾出现采食减少、增重缓慢、生长迟缓时应该怀疑感染EHP。关于 EHP 检测可用组织病理学方法、原位杂交技术（Insituhybridization，ISH）与分子生物学技术等。组织病理学方法：可取虾肝胰腺进行切片，用HE 染色，但该染色法对孢子的染色效果较差、与背景颜色对比不明显且单个视野检出率较低；如用荧光染色剂（calcofluorwhite，CFW），能使孢子发47韦秀颖等：虾肝肠孢子虫病及其防治手段的研究进展第 2 期出白色荧光，可明显检出20；用 Masson 染色可看到虾肝肠孢子虫被染成红色，而虾肠细胞则被染成蓝色，镜下对比明显，更易检出21，这类方法的缺点是麻烦、耗时长且难以区分 EHP 与其他微孢子虫。原位杂交技术：利用带有地高辛标记的 EHP-18SrRNA 探针建立了地高辛标记核酸探针原位杂交法，可以特异性检出 EHP 感染且可以定位19，该方法不足之处操作仍比较繁琐。分子生物学技术：主要有 PCR、NestedPCR、荧光定量PCR（qRT-PCR）、LAMP 等，这些技术具有灵敏度高、特异性强的特点。可采集虾的肝胰腺匀浆或粪便进行检测。而近期建立的重组酶介导的核酸技术（Recombinase-aid-amplification,RAA）22，除了特异、敏感外还具有操作简便、快捷、低成本的优点，非常适用于基层及现场 EHP 的检测。对于虾疫病原微生物采取早期检测，从而尽快切断重大和新发病原的传播，被认为是当前水产养殖中降低病原流行风险，减少病害大面积流行造成严重经济损失的有效手段。由于目前还没有特效药物用于 EHP 治疗，因此在养殖过程中预防与控制显得尤为重要。首先从虾种源控制。购买 SPF 虾苗并用 PCR 等方法检测虾粪，阴性者方可引入生产（SPF级虾还未将虾肝肠孢子虫检测纳入标准）。其次做好养殖环境控制。虾塘有机质越多，患孢子虫病的风险越高，因此在放虾苗前要彻底清塘消毒。用 2.5%的氢氧化钠浸泡饲养池 3 小时后冲洗，干燥 7d，再用含有效氯 200ppm 以上的氯溶液（pH4.5）冲洗，方可开始养殖。亦可用生石灰以 0.6kg/m2的用量混入池底加水淋湿，使池塘底 pH 值升至 12，静置一周可有效杀灭大部分 EHP。禁止用生饵料喂虾苗（如必须使用，需在-20冷冻至少 48 小时）23。养殖废水不能直接排放，必须经过严格处理。生物类产品应经过 75，1 分钟以上加热能使 EHP 孢子灭活，使 EHP 失去感染能力23，用 15mg/L 高锰酸钾、65%有效氯或 20%乙醇处理养殖池水 15 分钟均可减少、抑制 EHP 极丝释放。4 EHP 相关药物的研究尽管世界上科学家们对 EHP 治疗药物进行了大量研究，但是由于 EHP 具有几丁质的孢子壁，有很强的抗逆性，一般药物很难穿透孢子壁杀灭孢子，到目前为止尚未找到一种低廉、安全、高效可以治疗虾肝肠孢子虫病的药物，使 EHP 防治成为一个难题。虽然 Tang 等12尝试用对微孢子虫有一定作用的烟曲霉素（Fumagillin-B）治疗 EHP，结果发现对EHP无效，但是相关药物研究还是取得一定进展。Aldama-cano 等9通过体外研究表明，低温及用高锰酸钾（15mg/L）等化学物质处理，可以通过抑制极管的弹出而有效抑制 EHP。Jaroenlak 等发现24，EHP 能够利用肝素结合蛋白（EhSWP1）与对虾肝胰腺细胞的肝素结合从而入侵细胞。这种入侵方式与克氏锥虫、疟原虫和利什曼原虫相似。因此构建针对肝素结合蛋白的抗体可以减少一部分孢子黏附25，26，更深入研究还待进一步实验。赵若恒27 将明胶作为包裹材料对 17 种潜在控制 EHP 药物进行筛选，结果筛选出 4 种能降低 EHP 载量的药物。周志刚等28利用分子生物学技术克隆表达来源于气单胞菌（Aeromonassp）的 ChiCD3 几丁质酶，该酶具有降解几丁质的活性，并可以破坏粘孢子虫孢子壁，可以用于防治粘孢子虫病，特别是鱼类的粘孢子虫病。此外科学家们也利用中草药防治 EHP，进行了大量的试验。高永刚等29以苦楝、贯众、百部、雷丸、青葙子、钩吻、槟榔为主要成分，预防与治疗 EHP 取得一定效果。姜宗然等30用苦参、贯众、雷丸配伍保肝健脾胃药物，先通过纳米低温破壁技术粉碎药物，再添加乳酸杆菌发酵，最后将得到的发酵产物用复合酶分解后，再添加天然虾青素、葡萄糖醛酸内酯以提高对 EHP 免疫力。江晓等31以阿苯达唑、青蒿粉和胆汁酸为主要成分合成饲料添加剂，各组分协同驱杀 EHP，以期达到提高虾成活率、体长和体重，并降低 EHP 阳性率的目的。此外李宗全32报道一种综合防治的方法：开足增氧设备，降低水位至 3040cm，捞出死虾。用银花、五倍子、青蒿末煮沸 20 分钟后全塘泼洒。4%甘草、3维生素 C、维生素 B10、钙片、3盐酸土霉素、左旋咪唑适量混合拌料投喂。6 小时后注入 20cm 高的新水，用低压电网去除网衣全池拖动，来回 23 次，2 小时后加水至原水位，12 小时后重复 23 次，可有效控制 EHP 感染等。上述研究为EHP 预防与治疗打下了良好的基础，在养殖生产中具有很好的应用前景。广西农学报482023 年5 展望近年来有关 EHP 诊断技术的研究已经取得显著的进展，但防治技术的研究进展相对缓慢。由于EHP 抗原成分复杂且抗原性弱，较难制成高效疫苗，人们逐渐把眼光放到药物防治，但药物防治目前最大的难点是 EHP 有细胞壁，且细胞壁外有厚厚的几丁质包裹并寄生于宿主细胞内，对环境抵抗力强，外源药物对其作用甚微；其次对虾生活于水中，常规饲料混合给药方式在水中会由于溶解扩散作用而导致疗效大大减弱甚至消失；注射给药在对虾养殖中由于操作繁琐且死亡率高，所以一般较少使用，体外用药或饮水给药对水环境副作用大，不利于水产养殖的可持续发展。鉴于上述原因，有关防治药物的研究除了要筛选针对性药物、设计合理的剂型之外，还需研发合适的药物包裹技术以增加药物摄入量，降低药物在水中损耗。随着科技技术的发展，近年来利用分子生物学、生物信息学及免疫学等技术进一步探索 EHP 侵染宿主的分子机制，筛选和鉴定其黏附、侵染宿主细胞、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白的研究也在不断深入，期待不久的将来针对 EHP 侵染宿主细胞关键蛋白的靶向抑制药物开发出来，将有效控制虾肠肝孢子虫病的发生。参考文献：1Tourtip S，Wongtripop S，Stentiford G D，et al.Entero-cytozoon hepatopenaei sp.nov.（Microsporida：Enterocyto-zoonidae），a parasite of the black tiger shrimp Penaeus monodon（Decapoda：Penaeidae）：Fine structure and phylogenetic relationshipsJ.Journal of Invertebrate Pathology，2009，102（1）：21-29.2Hibbett D S，Binder M，Bischoff J F，et al.A higher-level phylogenetic classification of the FungiJ.Mycological research，2007，111（5）：509-547.3Franzen C.Microsporidia：A Review of 150 Years of ResearchJ.Open Parasitology Journal.2008，2（1）：1-34.4Vu-Khac H，Thanh T，Thu G，et 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311”“安吉白茶”“千年雪”“耶金香”“四季雪芽”“川茶 3 号”“鄂茶 1 号”“鄂茶 10 号”“金牡丹”“桂绿 1 号”“迎霜”“白毫早”“碧香早”“春波绿”“嘉茗 1 号”“桂红 4 号”“尧山秀绿”“桂香22 号”等 30 个品种，能适应贺州市的气候环境，作为品种结构调整的备选品种，可适当引进推广种植，用于制作名优绿茶抢占市场，提升贺州市的茶产业竞争力。参考文献：1江新凤，李文金，杨普香，等.茶树新品种引种试验 初 报J.南 方 农 业 学 报，2015，46（10）：1856-1861.2陈亮，杨亚军，虞富莲，等.茶树种质资源描述规范和数据标准M.北京：中国农业出版社，2005.3杨慈，李建明，伍彦知，等.11 个茶树品种在桂北山区三江县的适应性研究J.广西农学报，2011，26（2）：40-45.4刘黎，张锡友，胡春学，等.汉中引种 6 个茶树良种 的 试 验 初 报J 茶 业 通 报，2015，38（3）：114-117.5蓝庆江，韦雪英，韦持章，等.特早生早生茶树品种引种试种试验研究J.广西农学报，2008，23（5）：21-23.（责任编辑：黎月娟）（上接第 35 页）