玉米转基因和育种改良.pdf

玉 米 科 学 2 0 0 3，1 1(3)：9-1 2 J o u r n a l o f Ma i z e S c i e n c e s 玉米转基因和育种改良 白云凤 1,2王 国英(1 Ola f 农业大学农业生物技术国家实验室，北京 1 0 0 0 8 1；2 山西农科院作物遗传研究所，山西 太原 0 3 0 0 3 1)摘要：玉米转基因技术的开拓和重要农艺性状的遗传改 良取得了重大进展，在育种改良中起着愈来愈重要 的作用，有些成果已进入商业应用阶段。论述了玉米转基因的研究进展，对在育种利用中存在的问题提出了一些看 法。关键词：玉米；基因转化；育种改 良 中图分类号：$5 1 3 0 3 5 3 文献标识码：A Maiz e Gen e t i c Tr an s f o r ma t io n a n d I mp r o v e me n t B AI Yu n-f e n g ，W ANG Gu o-y i n g (1 S t a t e K e y L a b o r a t o ry f o r A g r o b io t e c h n o l o g y,C h in e s e A g r i c u l t u r a l U n iv e r s it y,B i n g 1 0 0 0 8 1，C h i n a；2 C r o p G e net ic s I n s t i t u t e，S h a n x i A c a d e m y of A g r i c ul t ur a l S c ie n c e s，T a iy u a n 0 3 0 0 3 1，C h i n a)Ab s t r a c t：Ge n e t i c t r a n s f o r ma ti o n t e c h n o l o g y h a s b e e n u s e d i n ma i z e i mp r o v e me n t T h e p r o g r e s s ma d e o n ma i z e t r a n s f o r ma ti o n，i n c l u d i n g e s t a b l i s h me n t o f c o mp e t e n t r e c e p t o r s y s t e m，a p p r o a c h e s o f t r a n s f o r ma t i o n，b ree d i n g i m p r o v e me n t t h r o n g g e n e t r a n s f o r ma t i o n a r e r e v i e we d a n d t h e p r o s pe c t s o f a p p l i c a ti o n o f g e n e ti c t r a n s f o r ma ti o n i n ma i z e i mp r o v e me n t a r e d i s c u s s e d i n thi s p a p e r Ka y wo r d s：Ma i z e；G e n e t i c t r a n s f o r ma ti o n；Maiz e i mp r o v e me n t 玉米是现代食品、医药、化学工业的重要原料作 物，也是植物遗传研究的模式植物。自从 1 9 8 8 年 R h o d e s等首次获得玉米转基因完整植株以来，玉米 转基因在受体系统的建立，转化技术的开拓和重要 农艺性状的遗传改良等方面都取得重大进展，在育 种改 良中起着愈来愈重要的作用，有些成果已进入 商业应用阶段。本文论述了玉米转基因的研究进展，对在育种利用中存在的问题提出了一些看法。1 玉米转基因的受体 实现玉米基因转化，首先需建立良好的受体系 统。玉米转基因的有效受体主要包括以下四种。1 1 愈伤组织 外植体经过脱分化培养诱导出愈伤组织，再经 过分化培养获得再生植株。至今除幼胚外，已从幼 穗、叶片、花药、胚叶等外植体诱导出愈伤组织并获 得再生植株。但外植体不同，愈伤组织的诱导和再生 能力不同。玉米幼胚具有强烈的分生状态，容易诱导 愈伤并且再生植株，使用的也最多。玉米愈伤组织再 收稿 日期：2 0 0 2 一l 1 2 O 作者简介：白云凤(1 9 5 7-)，女。山西农科院作物遗传研究所研究员，中国农业大学在职博士生，主要从事作物遗传育种研 究。生系统也明显受基因型限制，B mn s d e ma 等【q 的研究 表明，玉米愈伤组织再生系统中的基因型效应既存 在核效应，也存在核质互作效应。愈伤组织再生系统外植体取材广，但受基因型 限制，获得的再生株无性变异大，嵌合体多。1 2 原生质体 原生质体是最早用于玉米转基因的受体。由于 有可行的物理或化学方法(如电击法、P E G法等)使 外源 D N A有效地通过玉米裸露的原生质体膜，原生 质体再生系统在上世纪 8 O年代就开始大量用于玉 米的遗传转化。1 9 8 6 年，F mm m 等翻 制备了玉米原 生质体，首次用电击法转化成功。S u k h a p in d a等 从 玉米花粉愈伤组织获得原生质体，电击处理得到单 倍体转化株。Gel o v k i n 等问 和 O m i r u ll e h 等四 分别获得 了玉米原生质体，P E G介导得到了转化株。原生质体被除去了细胞壁这一天然屏障，能直 接高效地摄取外源 D N A，转化株来 自一个细胞，嵌 合体少。该受体系统适用于各种转化方法，花粉管导 人也是利用了卵细胞是原生质体的原理。但是原生 质体分离困难，培养周期长，技术复杂，再生频率低。1 3 种质 种质受体指转基因利用的受体是植物自身的生 殖系统，如花粉粒、卵细胞，也称生殖细胞受体系统，9 维普资讯 玉米科学2 0 0 3 年第 1 1 卷第 3 期 主要从两个途径利用种质受体进行基因转化。一是 利用组织培养技术进行花粉和卵细胞的单倍体培 养，诱导出胚性细胞或愈伤组织，进一步分化发育成 单倍体植株，建立单倍体转基因受体系统；二是直接 利用花粉和卵细胞受精过程实现转基因，主要是花 粉管导人法和子房注射法。由于以生殖细胞直接作 为受体细胞，外源基因导人后会随着正常的受精过 程而得到稳定转化，因此，是很有潜力的受体系统。1 4 直接分化 直接分化指叶片、幼茎等外植体细胞越过脱分 化产生愈伤组织而直接分化出不定芽获得再生植 株。玉米茎尖是比较好的直接分化再生系统。李学 红等61 用玉米茎尖离体培养直接产生了雌雄花序；Z h o n g 等17 1用茎尖培养产生了丛生不定芽，基因枪轰 击得到了转化株。G o u l d等i s 用玉米茎尖与农杆菌共 培养获得了转化株和后代；L o w e 等19 把 D N A 转移 到早期合子胚的分生组织中，获得了转基因玉米茎。直接再生分化系统省去了愈伤诱导培养过程，体细胞无性变异小，获得再生株的周期短，但玉米茎 尖培养困难。2 玉米转基 因技术 应用转基因技术将 目的基因导人合适受体获得 稳定 的转基 因植株是转基 因的重要环节。玉米 已开 拓建立了多种转基因技术，分别适应于不同的受体。2 1 载体转化技术 载体转化系统指将 目的基因插入农杆菌质粒或 病毒 D N A上，即转移的 D N A不是裸露的，而是插在 载体上，随载体 D N A的转移而转移。玉米主要是农 杆菌 T i 质粒介导的转化系统。G r a v e s 等【蛔 用农杆菌转化玉米萌发的幼苗，证 明农杆菌可以进入玉米苗的盾片节和中胚轴的受伤 部位，使这些部位表现出与 T-D N A转录产物有关的 酶的活性。G r i m s l e y 等【“将条纹病毒(M S V)D N A插 入农杆菌 T i 质粒的 T-D N A上，然后接种不感病的 玉米，结果玉米全株布满病毒侵染的症状，这些结果 大大鼓舞了人们用农杆菌转化玉米的信心。S c h l a p p i 等发现不同基因型及不同发育时期的玉米幼胚对农 杆菌侵染的感受性有差别，如 A 1 8 8的感受性最高。后来，I s h i d a 等(1 9 9 6)把 A 1 8 8 基因型幼胚的农杆菌 转化效率提高到 5 3 0，而其它基因型的转化效 率仍然较低。I s h r i g e报道了 I I 型愈伤组织用于农杆 菌 的转 化。这些 报道所用 材料 多为 自交 系 A1 8 8、B 7 3 及其衍生系。1 9 9 9 年，黄璐等在国内首次报道 了农杆菌转化玉米杂交种成功。2 0 0 1 年张荣等首次 1 0 将农杆菌转化玉米的基因型拓宽到常规 自交系综 3、综 3 1。2 0 0 2年，张艳贞等用农杆菌将 B t毒蛋白 基 因导人玉米优 良 自交系 3 4 0和 4 l 1 2。农杆菌 T i 质粒介导的转基因系统是一种天然 有效的遗传系统，操作简单，可转移 5 O k b 大的 D N A 片断，整合稳定，拷贝数少，有可能成为玉米转化的 首选方法。2 2 DN A直接导入转化技术 亦称无载体 D N A介导转化技术，不需依赖生物 媒体，而将特殊处理的裸露的 D N A 直接导人玉米 细胞，实现基因的转化。2 2 1 基 因枪 法基本原理是将外源 D N A包裹在 微小金粒或钨粒表面，高压作用下微粒被高速射人 受体细胞或组织，微粒上的外源 D N A进入细胞后，整合到染色体上，实现基因转化。基因枪是玉米基因转化常用的方法，也是效果 最好的方法，1 9 8 7 年由美国康乃尔大学 S a n f o r d等 人发明，并很快用于玉米基因转化研究。有关基因枪 转化玉米的报道不断出现，受体类型包括了悬浮细 胞、幼胚、愈伤组织、茎尖和花粉等，已转化的基因主 要有 G u s，Hp t，N t p 2，B a r，L y s o，D H P S，B-p e r o，S a c B，A p r o t i n i n，AD A，A L S，C r y l A(b c)，G F Mc r y l A，G u t D，Mt L D，P i n 2，B a r n a s e，B t-C p T i，MDM V-C p N p t 2等。基因枪转化无宿主限制，靶体类型广泛，操作简 便，但转化频率低，插入位点、插入拷贝数不定。2 2 2 P E G法P E G法建立较早，它随原生质体的 发展而发展。P E G是细胞融合剂，能促进 细胞膜 间 融合，利于外源 D N A进入原生质体。这种方法成本 低，结果 比较稳定，存在的问题是建立可靠高效的原 生质体再生系统比较困难。2 2 3 电击法 电击法是利用高压电脉冲作用对细 胞“电击穿孔”，形成可逆 的瞬间通道，促进外 源 D N A的摄取。电击法可以用于原生质体，还可以用 于胚性悬浮细胞系、愈伤组织和幼胚等，操作比较简 单，但转化效率低。2 2 4 超声波介导法原理是利用低声强脉冲超声 波的物理作用，击穿细胞膜造成通道，使外源 D N A 进入细胞。超声波介导法转化效率较高，但操作繁琐，载体 D N A在处理时易断裂。2 2 5 碳化硅 纤维介 导法碳化硅在震动条件下可 以使细胞穿孔，使外源 D N A 进入受体细胞。K a e p-p l e r 等介绍了这种奇特的简便经济的介导方法。他 们将质粒 D N A混入悬浮培养细胞，培养基中含有 碳化硅纤维，然后旋涡处理，得到了可育的玉米转化 株。碳化硅晶体纤维在操作时易吸人肺内。维普资讯 白云凤等：玉米转基因和育种改良 2 3 种质转化技术 种质转化技术指外源 D N A借助生物自身的种 质系统或细胞结构功能实现的转化，进展比较大的 是花粉管通道法和子房注射法。2 3 1 花粉 管通道 法 基本原理是授粉后外 源 D N A沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转 化尚不具备正常细胞壁的细胞、合子或早期胚胎细 胞。D e w e t 等n 啁 花粉管通道法转化玉米叶斑病基因 得到了令人心服的证据。O h t a 等将外源 D N A 溶液 与花粉粒混合后立即授粉，获得了高频率的转化。王 罡等在玉米授粉后剪短花丝和苞叶，将 B t 毒蛋白基 因滴在花丝上，得到了转基因后代。花粉管通道法与 其它方法结合也有报道。董云州等用基因枪将 G u s 基因射入玉米花粉，然后人工授粉，后代检测到了 G u s 基因的表达。王景雪等把玉米花粉和质粒 D N A 混合后超声波处理，然后人工辅助授粉，将几丁质酶 基 因导入 了玉米。玉米为穗状花序，小花丛生，具有发达的有性繁 殖系统，每穗结实粒多，花粉易于采集，体外存活时 间长，花粉管通道法介导基因转化具有便利的条件。2 3 2 子房注射法子房注射法指使用微玻针把外 源 D N A 注入子房，由于子房或胚囊产生高的压力 以及卵细胞的吸收，使外源 D N A进入受精的卵细胞 中，实现基因的转化。丁群星 3】在国内外首次报道了用子房注射法 将毒蛋 白基 因导入玉米 自交系的全过程，重复试验 也获得了成功。沈世华等对上述子房注射法作了改 进，用离体注射代替了非离体注射，获得种子，得到 了阳性转化株。种质转化 以子房和花粉为受体，避开了组织培 养过程，利用植物本身的有性繁殖过程进行繁殖，避 免了转化体早期天亡、不孕和不育等，比较容易得到 种子，但转化后代群体大，需要有简便可靠的筛选方 法。3 玉米转基因在育种中的应用 转基因技术已广泛用于玉米育种，涉及诸多目 标性状，有些性状的基因转化取得了突破性进展，如 抗虫、抗除草剂基因工程已进入商业化应用阶段。3 1 抗虫性 虫害是制约玉米生产的一大因素。1 9 8 1 年，S c h n e p f 等首次成功地克隆了一个编码为 B t杀虫 晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物 的序幕。现已分离到上万个 B t 菌种。根据杀虫谱的 不同，将杀虫基因分成 7大类，又根据结构基因中的 限制性酶切图谱和它们之间的同源性，分成了2 9 个 亚类，统称 C r y 基因【。1 9 9 6 年，美国正式批准转 B t 基因玉米进入商品化生产。国内在“8 6 3”高新技术计 划的资助下，全合成了C ryl A基因。王国英等【坷 把 C ryl A(b)基因导入玉米，育成了稳定的抗虫玉米。李慧芬等1 61把抗虫融合基因 c ryl A c 3 一 e p t i 导入了玉 米。目前我国的转基因玉米已开始环境释放试验。3 2 抗除草剂 化学控制杂草是现代农业不可缺少的一部分。目前，抗除草剂转基因玉米已进入商业化生产阶段，主要有美国孟山都公司(M o n S a n t o)的抗草甘磷玉米(R o u n d u p R e a d y e o r n)，氢胺公司(A m e r ic an C y a n a m i d)的抗咪挫啉酮(I M I e o m)玉米，艾格福公司(A s r E o)的抗草甘磷铵磷玉米(L i b e r t y L i n k C o r n)，巴斯夫公 司(B A S F)的抗拿扑净玉米(P o a s t P r o t e c t e d C o r n)等。3 3 抗病性 抗病性是转基因玉米的目标之一。研究发现玉 米矮花叶病毒(M D M V)B株系外壳蛋白在转基因植 株中表达出对 MD MV的抗性。王景雪等阎把几丁质 酶基 因导入玉米 自交系，获得了转化株。3 4改良品质 赖氨酸是玉米蛋白质中的限制性氨基酸，含量 高低直接关系到玉米的营养价值。孙学辉等通过基 因工程提高了玉米的赖氨酸含量。H o o d s 等报道了 通过转基因玉米生产鸡蛋抗生素蛋白 并已进入商 业化生产。3 5 杂种优势利用 利用基因转化方法创造植物不育系和恢复系，为杂种优势利用提供了新途径。通过 B a r n a s e 基 因、B a r s t a r 基因和除草剂 B a r 基因创造不育系、恢复系 以及不育保持方式是目前作物杂种优势最为完美的 策略。Ma r i ani 等在这一领域做了开创性的工作。转 b a r n a s e 基因的玉米已进入田间评估阶段。利用反义基因技术也是创造雄性不育的一个有 效途径。美国一种子公司利用这一途径获得了转基 因玉米雄性不育系，育性可用化学药剂恢复，称之为 条件雄性可育。4 玉米转基因存在的问题和育种应对 策略 转基因的最终 目的是将 目的基因插入、整合到 受体基因组，在后代植株中稳定遗传和表达，通过选 择和鉴定，得到具有应用价值的新品种(系)。也就是 说，通过基因转化的新材料，还必须通过育种程序的 检验才能获得商业价值。目 前，玉米转基因已建立了 1 1 维普资讯 玉米科学 2 0 0 3 年第 l l 卷第3 期 一套比较完整的理论和技术体系，转基因玉米已走 向商业化。但在利用上还存在一些问题：比如表达量 低，达不到应用标准；基因型的限制，目前仅有少数 基因型转化较易成功；昆虫、病菌协同进化造成的抗 性丧失，缩短了转基因玉米的使用年限，甚至造成生 态问题；转基因玉米在 目的性状表达或强化的同时 往往带来其它农艺性状的衰退等。关于表达量低的问题，人们探索了多条途径，如 对目的基因的修饰改造，使用强启动子、特异性启动 子、增强子、内含子等，都取得了很好的效果。基因的 表达需要适宜的内环境，包括插入的位置、插入 的拷 贝数等，现在转基因还无法做到定点、定拷贝数插 入，扩大群体、淘汰选择是常规而有效的方法之一。目前，生产对品种的要求越来越高，品种更新换 代很快。如果基 因转化仅 限于少数几个基因型，再通 过 回交或其它途径转到推广种上，会推迟 目的基 因 的应用甚至赶不上应用，基因型限制是必须跨越的 障碍。在寻找新的转化途径时，可以考虑用不同的途 径同时转化有直接应用价值或潜在应用价值的基因 型，或不同方法交叉使用，如前面提到的超声波介导 和花粉管通道的结合使用。玉米病虫的适应性很强，在杀虫剂的选择压力 下可以形成新的生物型，在转基因玉米的抗性选择 压力下也会形成新的生物型，导致转基 因玉米的抗 性丧失。1 9 9 6年，美国的 B t 玉米开始商业化应用，后来害虫产生了抗性，影响了它的持续利用。除利用“避难所”策略外，联合使用二种或二种以上不同杀 虫机理的抗性基因，使玉米获得水平抗性也是很重 要的。李慧芬等田 将 B t 毒蛋白质基因 c r y l A c 3 和豇 豆胰蛋白酶抑制剂基因 c p t i 插入同一载体，二者位 于同一读码框，转化玉米表达了 B t C p T I 融合蛋白，部分转化株有较强的抗玉米螟性。不同抗性基因可 以位于同一载体也可位于不同载体，同时导人受体，会使玉米获得水平抗性或获得抗不同病虫的能力，也可将不同的抗性基因分别导人父母本，使杂交种 获得水平抗性或多抗性。转基 因植株 的目标性状得 到表达或得 以强化时 伴随其它农艺性状的变化，多数情况下是向着不利 的方向变化。已有研究表明，T-D N A的插入往往导 致靶位处小的缺失，或在 T-D N A和植物 D N A连接 处出现“填充 D N A”，还发现 T D N A左右边界重复 序列以外的D N A也能整合进基因组中。外源基因的 插入也有可能引起相邻或相关基因发生易位、倒位 和重复等，影响基因的表达。应对策略之一是通过转 1 2 化株和同群体未转化株多次姐妹交，类似 回交策略，通过 同源染色体之间的易位，有可能选择得到除了 整合进目的基因外，染色体其它部位都正常的后代。玉米是异花授粉作物，生产用种是杂交种，比之 其它 自 花授粉作物如小麦、谷子等，在利用基因转化 进行育种改良方面具有更广阔的应用前景。可以设 想将多个 目的基因分别转化到父母本中，有可能培 育出“超级”杂交种。参考文献：【1 1 B r o n s d e ma TBF v s n O o s t v e e nW J G v a n，I J 8 珊n e r e nAAM v a n，e t a 1 Co mp a r a t i v e a n a l y s i s o f c a l l us f o r ma t i o n a n d r e g e n e r a t i o n o n c ul-t u r e d i mma t u r e ma i z e e mb r y o s o f t h e i n b r e d l i n e s A1 8 8 and A1 6 3 P l ant C e l l，T i s s u e and O r g E m Cu l t u r e，1 9 9 7，5 0(1)：5 7-6 5 2】F r o m mM E T a y l o r L P，V01 b o t V S t a b l et r a n s f o r m a t i o no f ms i ze a f t e r g e n e t r a n s f e r b y e l e tr o p o ra t i o n,Na t u r e，1 9 8 6，31 9：79 1-7 9 3 【3】S u k h a p i n d a K o z u e hM E，B R u h i n-Wi l s o n,e t 01 T ran s f o r ma t i o n o f ma i z e(Z e a，M L)p r o t o p l a s t s and reg e n e rati o n o f h a p l o i d t ran 8-g e ni e p l a n t s Pl a n t Ce l l Re p o r t，1 9 9 3，1 3：6 3-6 8 4】G o l o v k i n M V，A b r a h a m M，Mo r o c z S，e t 01P r o d u c ti o n o f t r a n e me r n a i z e p l a n t s b y d i r e c t DNA up t a ke i n t o e mb r y o g e n i c p r o t o p l a s t s P l an t S c i e n c e，1 9 9 3，9 o：41-5 2 【5】O mi r u l l e hSM，A b r a h a mM，G o l o v k i nk e t 01 A c t i v i t yo f B c h i me r i c p r o mo t o r wi t h t h e d o u b l e d Ca MV e n h an c e r de me n t in p r o t o p l a s t-d e-r i v ed c e l l s and t r a mg e n i c p l a nt s i n ms i ze Hant Mo 1 Bi o 1 ，1 9 9 3，21：41 5-4 28 6】李学红，张举仁 玉米茎尖离体培养直接产生雌雄花序的研究【J】中国g t(c辑)，1 9 9 9，2 9(2)：1 8 6-1 9 3 【7】Z h o n gH，S u nB，Wa r k e mi nD，e t 01 T h e c o m p e t e n c eo f ma i z e s h o o t me fis t e ms f o r i n t e g r a t i v e t r a n s f o r ma t io n an d i n h e rit ed e x p res s i o n o f t r a n s g e n e s Hant P h y s i o l o g y，1 9 9 6，1 1 0：1 0 97-1 1 0 7 【8】G o u l d J，De v e yM，H a s e g a w a0 T r a n s f o r m a t i o no f Z e at n a$L u s i n g Ag r nh a e t e fiu m t u me f a c i e nt an d the s h o o t a p e x P l a n t Ph y s i o l o g y，1 9 91 9 5：4 2 6 4 23【9】1 o w eK B o w e nB，H oor s t e r G，e t a 1 G e md i n e t r a n sf o r ma ti o no f m a i ze f o l l o win g ma n i p u l a t io n o f c hi me r i c s h oot me r i s t e m Bi o Tech n o l o g y，1 9 9 5，1 3：6 7 7-6 8 2【1 0 Grav e s A C F and Go l d ma n S L The t r a n sfo r ma t i o n o f Z e a m s e e d l i ng wi t h Ag r o b a c t e fiu m t u me f a c i e n s P l a n t Mo 1 Bi o 1，1 9 8 6，7：43-5 0 【1 1 1 Gr i m s I e yN，Ho l mT，J e l f r e yW，e t a 1 A g r o h a c t e r iu m-m e d i a t ed d e-li v e r y of i n f e c ti o u s ma i ze s t r e a k v i r u s int o n l s i ze p l ant s Na t u r e，1 9 8 7，3 2 5(8)：1 7 7-1 7 9【1 2】D o w e r J M，E x p e rim e n t m a n i p ula t i o n o f t h e t i ssu e s Ne w Y o r k，I o n-g a n,1 9 8 4，1 9 7-2 07 【1 3】丁群星，谢友菊，戴景瑞，等 用子房注射法将 B毒蛋白基因导 人玉米的研究叨 中国科学(B 辑)，1 9 9 3，2 3(7)：7 07-7 1 3 【1 4】郭三堆 植物 B t 抗虫基因工程研究进展【J】中国农业科学，1 9 9 5，2 8(1 5)：8-1 3【1 5】王国英，谢友菊，戴景瑞，等 用基因枪将 B 毒蛋白基因转入玉 米及转基因植株再生们 中国科学(B辑)，1 9 9 5，2 5(1)：7 1 _ 7 6 【1 6 李慧芬，刘翔，曲强，等 转抗虫融合基因(c r y l A c 3-e p t i)K 米 o，n L 0 植株的获得及其抗虫性分析叽 自然科学进展，2 0 0 2，1 2(1)：3 7 4 0 联 系电话：[phone]，0 3 5 1 7 1 2 7 7 3 2 E mai l：b y t 5 7 ma f1 c h i n a oo m 维普资讯