尾叶桉叶绿体ROS代谢相关基因表达与不定芽分化的关系.pdf

为研究不同类型愈伤组织的叶绿体活性氧()代谢相关基因表达探讨尾叶桉再生型愈伤组织转绿和不定芽分化之间的关系将 苗龄的尾叶桉(.)幼苗下胚轴接种在添加 苯基噻唑基脲、苄氨基腺嘌呤、吲哚乙酸的标准平板计数琼脂培养基()中外植体先膨大形成白色愈伤组织 周后分化形成不同类型的愈伤组织(绿色带芽点愈伤组织、绿色愈伤组织、红色愈伤组织、白色愈伤组织)种愈伤组织中叶绿素质量分数分别为.、.、.、./实时荧光定量多聚核苷酸链式反应()检测叶绿体 基因和 个 代谢相关基因(、)的表达 检测到 周前的白色愈伤组织中 个叶绿体基因、和 的转录 其中、的转录水平随愈伤组织块的膨大不断升高 基因转录水平则较低 周后叶绿体 基因和 个活性氧代谢相关基因均在绿色带芽点愈伤组织、绿色愈伤组织、红色愈伤组织中转录 设定红色愈伤组织中对应基因的表达量为 绿色愈伤组织中上述 个叶绿体基因(、)相对表达量分别为.、.、.、.、.、.和.绿色带芽点愈伤组织中 个基因的相对表达量分别为.、.、.、.、.、.和.结果表明愈伤组织转绿和不定芽分化过程中叶绿体发育开始启动、叶绿素大量合成、转录显著增强叶绿体中与活性氧代谢相关基因的表达水平升高关键词 尾叶桉愈伤组织叶绿体基因表达活性氧分类号./(.)()()/():././()()()()()()().().桉树属桃金娘科()包括杯果木属()、伞房属()和桉树属()具有生长速度快、轮伐期短、耐干旱、耐瘦瘠、适应性广等特点是我国重要的造林树种之一 第九次中国森林资源清查报告数据显示我国桉树人工林面积已达 万 桉树木材年产达 多万 产业链年产值超 亿元培育优良桉树种质已成为桉树产业可持续发展的迫切需要 转基因技术能避开常规育种中桉树杂合度高、育种周期长等难题同时具备转基因性状可期、优良基因来源广泛等优点因而前景广阔建立高效组培再生系统是作物遗传改良的前提和基础 桉树是木本植物组织培养过程中易发生褐变、不定芽分化率低的情况限制了桉树遗传改良的进程 具再生能力的尾叶桉(.)愈伤组织启动芽原基分化后先形成肉眼可见的绿色芽点芽点再伸长长出不定芽 叶绿体基因的表达水平显著影响植物生长发育 核酮糖 二磷酸羧化酶/加氧酶()是叶绿体基质中重要的可溶性蛋白由大亚基()和小亚基()组成 核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基由叶绿体基因组的 基因编码是全酶的底物活化和催化中心通过催化固定 参与碳代谢促进植物生长桉树不定芽分化受活性氧()调控 叶绿体、线粒体和过氧化物酶体是植物细胞中活性氧主要产生部位活性氧包括单线态氧()、超氧阴离子()、过氧化氢()和羟自由基()等 适量活性氧作为第二信使介导细胞伸长与分裂、细胞程序性死亡、生长发育等多个重要生理过程 桉树中酚类化合物质量分数高、酚氧化酶活性高外植体切伤刺激和离体培养易导致活性氧过度积累引发大分子功能丧失如脂质过氧化、蛋白质变性、核酸损伤及细胞结构氧化损伤最终引起褐变植物体内活性氧平衡由酶促清除系统和非酶促清除系统共同作用 叶绿体含有/和 基因编码并调控超氧化物歧化酶()的活性 超氧化物歧化酶能将体内的超氧阴离子歧化为 和 减轻或消除过量积累的自由基对机体的损害作用 基因编码脱氢抗坏血酸还原酶()通过催化脱氢抗坏血酸()生成抗坏血酸()抗坏血酸还原 从而清除过剩氧自由基维持植物体内活性氧平衡 硫氧还蛋白()是广泛存在的酶通过催化可逆的二硫键形成调节许多蛋白质的结构和功能 叶绿体 能够激活果糖 二磷酸酶()而 优 先 激 活 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酰 磷 酸()依赖性苹果酸脱氢酶()和 都通过铁氧还蛋白依赖性 还原酶()使用铁氧还蛋白()提供的光合电子被还原参与调节卡尔文 本森循环、腺嘌呤核苷三磷酸()合成和适应光的还原机制 硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶()是过氧化物酶超家族()成员在动物、酵母和植物中二硫化物通过硫氧还蛋白()还原从而再生活性过氧化物酶将 氧化还原为 目前鲜有叶绿体活性氧代谢相关基因表达与愈伤组织不定芽分化关系的报道 本研究比较不同时期和不同类型的尾叶桉愈伤组织叶绿体 基因和活性氧代谢相关基因的表达变化探讨尾叶桉不定芽分化与叶绿体基因表达间的关系 材料与方法尾叶桉(.)种子由国家林草局桉树研究开发中心提供尾叶桉愈伤组织的诱导方法:用蒸馏水浸泡尾叶桉种子 再用体积分数为.的曲拉通溶液浸泡 然后用蒸馏水冲洗干净 在无菌条件中用体积分数为 的酒精浸泡 再用体积分数为的 溶液消毒 次每次 消毒期间用无菌水漂洗每次 将种子点播到播种培养基(.倍的 蔗糖 /琼脂./为.)置于 暗处萌发 后在 的光强下照光 切取 长的幼苗下胚轴切段作为外植体接种于添加 苯基噻唑基脲()./、苄氨基腺嘌呤()./和吲哚乙酸()./的标准平板计数琼脂()诱导培养基温度()、暗处培养 周然后转移至温度为、光周期为 光照、黑暗、光照强度为 的培养箱中继续培养叶绿素质量分数测定方法:称取 愈伤组织置于试管中加入 无水乙醇于()、暗处浸泡 测量在波长、的吸光度()将测得的值代入公式 .(、分别为在波长、的吸光度)计算得出叶绿素总质量浓度()结合溶液的体积和愈伤组织的质量计算叶绿素质量分数 提取与反转录:称取 愈伤组织使用 试剂盒()按照说明书中 法提取总 使用超微量分光光度计()检测质量浓度 和 质 量 使 用 试剂盒()进行反转录得实时荧光定量多聚核苷酸链式反应()扩增:从 数据库检索出基因序列用 设计 引物(表)以 作为内参基因三步法扩增目的片段 扩增程序为:每步扩增完后读板 在 区间检测融链温度用 .软件判断产物特异性 采用相对定量的 法计算各基因在不同愈伤组织中的相对表达量 东 北 林 业 大 学 学 报 第 卷表 尾叶桉叶绿体基因的 引物序列基因序列号基因名称上游引物()下游引物().注:基因名称与缩写为核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基()硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶()铁超氧化物歧化酶()脱氢抗坏血酸还原酶()型硫氧还蛋白()硫氧还蛋白()硫氧还蛋白()蓖麻属假定的转录延申因子()结果与分析.不同类型尾叶桉愈伤组织的分化将尾叶桉幼苗下胚轴切段 接种在添加了、的 培养基中外植体膨大后先形成白色愈伤组织愈伤组织诱导率高达 培养 周后.的白色愈伤组织开始褐化未褐变白色愈伤组织分化出绿色、绿色带芽点、红色、白色四种类型的愈伤组织 白色愈伤组织(图)颜色较浅表面光滑细胞团较为疏松比例为.红色愈伤组织(图)整体呈粉红色表面光滑细胞团稍致密比例为.绿色愈伤组织(图)呈浅绿至深绿色色泽鲜亮表面有众多不规则突起细胞团致密比例为.带芽点绿色愈伤组织(图)顶芽和幼叶清晰可见比例为.后续培养时其芽点伸长形成不定芽(图)为白色愈伤组织 为红色愈伤组织 为绿色愈伤组织 为带芽点愈伤组织 为不定芽图 尾叶桉 类愈伤组织分化和不定芽形成.不同类型尾叶桉愈伤组织的叶绿素质量分数不同类型愈伤组织叶绿素质量分数差异显著(表)叶绿素质量分数由大到小依次为绿色带芽点、绿色、红色、白色愈伤组织 绿色带芽点愈伤组织叶绿素质量分数最高为./白色愈伤组织叶绿素质量分数最低为./白色愈伤组织分化成绿色及绿色带芽点愈伤组织过程中叶绿素质量分数显著升高预示愈伤转绿及不定芽分化过程伴随着叶绿体的发育和叶绿素合成表 尾叶桉 类愈伤组织的叶绿素质量分数愈伤组织类型叶绿素质量分数/绿色带芽点愈伤组织(.)绿色愈伤组织(.)红色愈伤组织(.)白色愈伤组织(.)注:表中数据为平均值标准差数据后同列不同小写字母表示差异显著(.).不同时期尾叶桉白色愈伤组织叶绿体基因表达变化以白色愈伤组织 为模板 难以有效扩增到全部 个叶绿体基因只有、和 个基因能被有效扩增 推测白色愈伤组织中叶绿体前体或叶绿体数量少、表达水平低难以有效扩增 检测第、周的白色愈伤组织中、和 的转录水平变化发现叶绿体发育相关的 基因及两个叶绿体活性氧()相关基因、随着愈伤组织的膨大其转录水平显著上升(表)但 基因转录水平则较低 可见愈伤组织暂未分化转绿的生长初期与叶绿体发育相关的 基因及叶绿体活性氧相关基因已经启动表达且随着愈伤组织的膨大其表达水平不断上升.不同类型尾叶桉愈伤组织的 个叶绿体基因表达分析以红色、绿色及带芽点绿色愈伤组织 为模板 均能有效扩增到全部 个叶绿体基因设红色愈伤组织中基因表达量为 计算培养 周时尾叶桉不同类型愈伤组织 和 个活性氧代谢相 关 基 因(、)相对表达量(表)结果显示叶绿体发育相关的 基因在绿色带芽点愈伤组织中相对表第 期 杨玉红等:尾叶桉叶绿体 代谢相关基因表达与不定芽分化的关系达水平最高为红色愈伤组织的.倍 叶绿体活性氧代谢相关的 个基因中除 基因外其他 个基因均是在绿色带芽点愈伤组织中表达量最高 基因在绿色愈伤组织中表达量最高 总体来看叶绿体基因转录水平由强到弱依次为绿色带芽点愈伤组织、绿色愈伤组织、红色愈伤组织 结合形态学观察、叶绿素质量分数和 基因表达水平结果可知绿色愈伤组织启动芽原基的分化后其表面形成突出芽点期间叶绿体活性氧代谢相关基因的表达水平整体上调清除叶绿体多余活性氧使叶绿体中活性氧的种类和质量浓度维持在合适水平有利于不定芽的分化表 不同时期尾叶桉白色愈伤组织 个叶绿体基因相对表达量培养时间基因相对表达量 周(.)(.)(.)(.)周(.)(.)(.)(.)周(.)(.)(.)(.)周(.)(.)(.)(.)注:基因名称与缩写为核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基()硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶()铁超氧化物歧化酶()脱氢抗坏血酸还原酶()设 周白色愈伤组织中基因表达量为 表中数据为平均值标准差数据后同列不同小写字母表示差异显著(.)表 不同类型尾叶桉愈伤组织的 个叶绿体基因相对表达量愈伤组织类型基因相对表达量红色愈伤组织(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)绿色愈伤组织(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)绿色带芽点愈伤组织(.)(.)(.)(.)(.)(.)(.)注:基因名称与缩写为核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基()硫氧还蛋白依赖性过氧化物酶()铁超氧化物歧化酶()脱氢抗坏血酸还原酶()型硫氧还蛋白()硫氧还蛋白()硫氧还蛋白()设红色愈伤组织中基因表达量为 表中数据为平均值标准差数据后同列不同小写字母表示差异显著(.)结论与讨论叶绿体在协调植物不同器官生长、适应环境变化等方面发挥重要作用 核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶()存在于叶绿体基质中是光合碳同化过程中固定 的关键限速酶其在光呼吸过程中固定 防止强光对植物光合结构的伤害减少光抑制 叶绿体 基因编码 大亚基其与核基因编码的小亚基组成 全酶本研究中白色愈伤组织分化成绿色愈伤和不定芽的过程中叶绿体基因组编码的 转录显著增强与其他类型的愈伤组织相比绿色带芽点愈伤组织中的叶绿素质量分数和 基因转录水平均显著升高 结合愈伤组织块上清晰可见的芽点和幼叶可推知愈伤组织细胞中叶绿体大量形成 质量分数增加可进行光能吸收和碳同化开始由异养向自养状态转变愈伤组织分化和不定芽的诱导与活性氧的清除有关适宜质量浓度的活性氧是调节植物生长发育的重要信号分子作为第二信使介导多种信号通路保证愈伤组织正常生长和代谢促进芽原基的形成 酶和非酶物质构成的抗氧化保护系统维持叶绿体活性氧平衡超氧化物歧化酶()的主要功能是清除超氧阴离子叶绿体中存在 和/协同发挥作用 武立权等发现水稻突变体叶色转绿后出现 谱带该过程伴随着较高的 酶活性和叶片色素增加说明叶绿体在不断地发育本研究中发育初期的白色愈伤组织叶绿素质量分数最少且 基因表达量在 周时处于较低水平随着愈伤组织的不断生长分化属于 的 基因表达水平不断增加推测由白色愈伤组织分化为绿色愈伤组织再到绿色带芽点愈伤组织的过程中 基因的上调促进了相关 酶活性的增加清除了由切伤刺激产生的活性氧伴随叶绿素的生物合成促进叶绿体的发育抗坏血酸()是植物体内主要的抗氧化剂具有分解活性氧、维持光合功能的作用 脱氢抗坏血酸还原酶()负责从氧化状态再生抗坏血酸其表达调节细胞抗坏血酸氧化还原状态进而影响细胞对环境活性氧的反应性和耐受性 在水 稻 中 过 表 达 脱 氢 抗 坏 血 酸 还 原 酶 基 因()激活抗坏血酸谷胱甘肽循环酶提高了抗坏血酸水平进而调控体内的活性氧代谢水平提高植物抗性 本研究中绿色愈伤组织和绿色带芽点愈伤组织中 基因的表达量较高推测 基因的表达激活了脱氢抗坏血酸还原酶促进抗坏血酸生成抗坏血酸还原 维持了活性氧水平稳定限制活性氧介导的损伤硫氧还蛋白系统()对清除 起重要作用且广泛参与植物体生长发育、叶绿素和淀粉合成、逆境胁迫应答等 .在水稻中发 东 北 林 业 大 学 学 报 第 卷现硫氧还蛋白()是叶绿体中一种活性二硫氧化还原酶在光合作用和叶绿体发育中起重要作用 在 植株中观察到的严重表型和生理变化表明硫氧还蛋白可能通过减少参与各种叶绿体过程(如类异戊二烯生物合成、卡尔文循环和磷酸戊糖循环等)靶标的半胱氨酸二硫键来调节靶蛋白 结合本试验绿色带芽点愈伤组织中 和 的基因表达量均比绿色和白色愈伤组织高推测在由白色愈伤组织分化至绿色带芽点愈伤组织的过程中 和 可能通过控制二硫键的形成与断开来调控叶绿体酶的活性进而调控叶绿体的相关生理反应 有趣的是仅 在绿色愈伤组织中表达水平最高说明由绿色愈伤组织向不定芽分化还受到其他代谢途径的影响综上所述绿色愈伤形成和不定芽分化过程中叶绿体发育开始启动、叶绿素大量合成、叶绿体基因组编码的 转录显著增强叶绿体中与活性氧代谢相关基因的表达水平升高 此结果可为探讨不定芽分化与叶绿体基因表达间的关联提供参考参 考 文 献 徐建民白嘉雨陆钊华.华南地区桉树可持续遗传改良与育种策略.林业科学研究():.谢耀坚.中国桉树育种研究进展及宏观策略.世界林业研究():.():.黄真池李柳如钟子倩等.尾叶桉叶组织中 个人工启动子转录特性.东北林业大学学报():.().:./.()():.黄永健蔡冠龙潘东阳等.盐胁迫对桉树 个叶绿体基因表达的影响.东北林业大学学报():.韩雨昕南芳茹巩超彦等.弯枝藻属 基因的适应性进化分析.热带亚热带植物学报():.黄博瑜方函陈璇等.诱导尾叶桉愈伤分化过程中 活性及基因表达的变化.东北林业大学学报():.汪锦陈平杜青等.活性氧调控豆科植物早期结瘤的研究进展.中国生态农业学报(中英文)():.():.马丹颖季东超徐勇等.活性氧调控植物细胞自噬的研究进展.植物学报():.()():.().():./.():.袁进成马海莲宋晋辉等.玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和特性研究.西北植物学报():.():.():.():.():.黄真池欧阳乐军张龙等.桉属植物内参基因的筛选及评估.西北农林科技大学学报(自然科学版)():.().().:./.():.:.:./.武立权尤翠翠柯建等.叶色白化水稻突变体转绿中若干生理与叶绿体发育特型的研究.热带作物学报():.().:./.():.秦童黄震康振辉.叶绿体硫氧还蛋白系统的调节机制.植物学报():.():.第 期 杨玉红等:尾叶桉叶绿体 代谢相关基因表达与不定芽分化的关系