卫茅碱对人血管内皮细胞及血管平滑肌细胞增殖、迁移及细胞周期的影响.pdf

卫茅碱对人血管内皮细胞及血管平滑肌细胞增殖、迁移及细胞周期的影响张莉1），赵熙2），赵华祥3），熊宝1），徐洁1），汤广平1），喻卓4），陈鹏1）（1）昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明650500;2）昆明市第一人民医院甘美医院心内科，云南 昆明650224;3）文山州人民医院心内科，云南 文山663007;4）昆明医科大学第一附属医院心内科，云南 昆明650500）摘要 目的探讨卫茅碱（Euonymine）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及人血管平滑肌细胞（VSMCs）的影响，以明确其防治冠脉支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）的可能机制。方法台盼蓝检测 Euonymine 对HUVECs 成活率的影响；MTT 法检测 Euonymine 对 HUVECs 及 VSMCs 增殖的影响；划痕法检测 Euonymine 对VSMCs 迁移的影响。结果MTT 结果显示，卫茅碱干预后,HUVECs 和 VSMCs 的吸光度降低。另外，Euonymine 分别作用 HUVECs 24 h，VSMCs 48 h 后，测的半数有效抑制浓度（IC50）分别为 28.6 g/mL 和 33.92g/mL。流式细胞结果显示，Euonymine（25 g/mL）使 HUVECs 和 VSMCs 的细胞周期阻滞于 G0/G1期，而Euonymine（100 g/mL）使 VSMCs 有丝分裂被阻断于 G0/G1期及G2/M 期。结论Euonymine 主要通过抑制 VSMCs的增殖和迁移，影响细胞周期，对于抑制经皮冠状动脉介入治疗术（percutaneous coronary intervention，PCI）后新生内膜形成有潜在的临床应用价值。关键词卫茅碱；血管内皮细胞；血管平滑肌细胞；抗增殖；抗迁移；细胞周期中图分类号 R956.1 文献标志码 A 文章编号 2095 610X（2023）07 0001 08Effects of Euonymine on Proliferation，Migration，and CellCycle of HUVECs and VSMCsZHANG Li1），ZHAO Xi2），ZHAO Huaxiang3），XIONG Bao1），XU Jie1），TANG Guangping1），YU Zhuo4），CHEN Peng1）（1）School of Pharmaceutical Sciences and Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for NaturalProducts，Kunming Medical University，Kunming Yunan 650500;2）Dept.of Cardiology，GanmeiHospital of Kunming 1st Peoples Hospital，Kunming Yunnan 650224;3）Dept.of Cardiology，Wenshan Peoples Hospital，Wenshan Yunnan 663007;4）Dept.of Cardiology，The 1st AffiliatedHospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032，China）Abstract ObjectiveTo investigate the effects of Euonymine on isolated cultured human umbilical veinendothelial cells（HUVECs）and human vascular smooth muscle cells（VSMCs），so as to elucidate the possiblemechanism of Euonymine in prevention and treatment of ISR.MethodsThe effect of trypan blue assay on theviability of HUVECs.MTT assay was used to observe the effect of Euonymine on the proliferation of normal HUVECsand VSMCs.A wound healing assay was performed to detect the effect of Euonymine on the migration of VSMCs.ResultsThe MTT results showed that the absorbance of HUVECs and VSMCs decreased after the Euonymineintervention.In addition，the IC50 of Euonymine on HUVECs after 24 hours and on VSMCs after 48 hours were收稿日期20230417基金项目国家自然科学基金资助项目（81860641）；云南省基础研究计划重点项目（202001AS070035）；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目（202101AY070001-015）；云南省高层次人才培养支持计划“名医”专项基金资助项目（RLMY20200013）作者简介张莉（1984），女，河南南阳人，医学博士，讲师，主要从事天然药物药理学研究工作。通信作者喻卓，E-mail：dr_；陈鹏，E-mail：昆明医科大学学报2023，44（7）：18JournalofKunmingMedicalUniversityDOI:10.12259/j.issn.2095-610X.S20230723CN531221/R28.6 g/mL and 33.92 g/mL，respectively.Flow cytometry results showed that Euonymine（25 g/mL）arrested thecell cycle of both HUVECs and VSMCs at the G0/G1 phase，while Euonymine（100 g/mL）blocked the mitosis ofVSMCs at both the G0/G1 and G2/M phases.ConclusionEuonymine affects the cell cycle mainly by inhibiting theproliferation and migration of VSMCs and has potential value of clinical applications in inhibiting neointimahyperplasia after percutaneous coronary intervention（PCI）.Key words Euonymine；HUVECs；VSMCs；Anti-proliferative；Anti-migratory；Cell cycle冠 状 动 脉 粥 样 硬 化 性 心 脏 病（coronaryatherosclerotic heart disease，CAHD）是冠状动脉血管粥样硬化导致的血液循环障碍，以血管腔狭窄或阻塞为特征，致使心肌缺血、缺氧而引起的一系列临床症状，简称冠心病12。经皮冠状动脉介入治疗术（percutaneous coronary intervention，PCI）是目前全球范围内应用最广泛的心肌再灌注疗法，可有效提高冠心病和心肌梗死患者的生存率，改善患者的生存质量34。然而，PCI 术后新生内膜病理性增生，管腔直径的丢失而引起的支架内“再狭窄”（in-stent restenosis，ISR），严重影响其临床疗效及患者预后5。临床上常口服氯吡格雷和阿司匹林以防治支架内再狭窄的发生，虽然有一定疗效，但对 ISR 致急性冠脉事件发生的预后仍不乐观。PCI 术后的 ISR 是血管对损伤的一种病理反应，支架扩张后造成的血管内皮细胞（vascularendothelial cells，VECs）损伤，VSMCs 过度增殖、迁移而导致血管新生内膜形成，支架附近的血栓形成是导致 ISR 病程进展的 3 个主要原因67。冠脉支架植入后内皮细胞间连接受损，脂蛋白和单核细胞侵入内皮下，抗栓剂表达减少，一氧化氮（nitric oxide，NO）生成减少，屏障功能受损引发一系列复杂的事件，包括内皮剥脱、血栓前内膜暴露和随后的炎症、生长因子和细胞因子的释放、血小板活化及 VSMCs 增殖和迁移还能促进损伤部位的血栓形成811。综上，VECs 的损伤是 ISR 的启动因素；VSMCs 的过度增殖、迁移与凋亡不足造成支架内膜的逐渐增厚，演变为不稳定的动脉粥样硬化斑块，是 ISR 形成的中心环节；血管壁重构和局部血栓形成是 ISR 的最终结果。因此，关注 VSMCs 的增殖及迁移并尽快恢复 VECs 的活性将成为研究药物对 ISR 作用的关键靶标。昆明山海棠 Tripterygium hypoglaucum（Levl）hutch，THH 属卫茅科雷公藤属植物，民间用于治疗类风湿性关节炎、肾小球肾炎等免疫系统疾病具有较好的临床疗效12。卫茅碱（Euonymine，C38H47NO18，分子量：805.783）是从 THH 根木中提取活性最高的雷公藤次碱化合物，见图 113。课题组前期研究发现，昆明山海棠提取物抑制VSMCs 的增殖，提示昆明山海棠在 PCI 术 ISR 方面的具体机制有进一步深入研究的价值；而作为THH 中活性最高的雷公藤次碱化合物卫茅碱，是否具有抗 ISR 的作用值得关注。因此，本实验培养与 ISR 密切相关的 VSMCs 和 HUVECs，进一步探讨卫茅碱对 VSMCs 和 HUVECs 增殖、迁移及细胞周期的调控作用，为卫茅碱临床应用于涂层支架提供理论和实验依据。ONOCOCOOHOOAcAcOAcOAcOAcOOAc图1卫茅碱的化学结构式13Fig.1ChemicalstructuralofEuonymine1材料与方法1.1药物与试剂卫茅碱由云南省中医药大学周志宏老师馈赠，纯度为 98.8%；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），DMEM 高糖培养基购自 Gibico 公司；0.25%胰酶购自 BI 公司；双抗青链霉素溶液购自 Hyclone 公司；DMSO 购自 Solarbio 公司。1.2细胞系HUVECs 购自中国典型培养物保藏中心，人脐动脉来源 VSMCs 购自中国科学院昆明动物研究所。1.3仪器CK-40 显微镜购自 Olympus 公司，荧光显微镜购自尼康有限公司。2昆明医科大学学报第 44 卷1.4方法1.4.1卫茅碱的配制用 DMSO 溶液完全溶解卫茅碱后，加入 PBS 配成 2 mg/mL 母液，临用前稀释成所需浓度。1.4.2台盼蓝检测卫茅碱对 HUVECs 成活率的影响取 HUVECs 单细胞悬液，浓度 106/mL 移入EP 管中，加入 0.4%台盼蓝溶液后混匀，用血球计数板对拒染细胞和蓝染细胞计数，实验重复6 次，取其平均值，求活细胞率14：活细胞率(%)=拒染细胞总数拒染细胞总数+蓝染细胞总数100%1.4.3MTT 法检测卫茅碱对 HUVECs 及 VSMCs增 殖 的 影 响 实 验 分 组 如 下：正 常 对 照 组（0.2%DMSO）、HUVECs 及 VSMCs 实验组分别加入卫茅碱至终浓度为 12.5，25，50，100 g/mL。取第 8 代细胞制备悬液，培养箱中（37、5%CO2、95%湿度）孵育 24 h 后，弃液，无血清培养基同化 24 h。加药前及加药后 1 d、2 d、3 d 及 4 d 各取一块板，实验结束前 4 h 加入 20 L MTT 溶液，置于 CO2培养箱孵育 4 h 后，每孔加入 100 L 三联液，直到紫蓝色结晶溶解，放培养箱过夜。隔日在酶标仪波长 570 nm 处测 OD 值。计算细胞生长抑制率 IR（%）14：生长抑制率=实验组OD值空白组OD值对照组OD值空白组OD值100%1.4.4迁移实验实验分组如下：正常对照组（0.2%DMSO），模型组（20%FBS 诱导），20%FBS+Euonymine 25 g/mL，20%FBS +Euonymine 100g/mL。将 VSMCs 的悬浮液以 5104个/mL 的比例放入 Culture Insert-2 Wells（Ibidi，NO：81176，Martinsried，德国）中，在标准条件下培养 24 h，根据制造商的说明移除插件，创造一个 500 m 宽的无细胞空间（又称划痕），并在 0 h 时间点拍照。细胞迁移距离（d）=0 h 距离-24 h 距离，单位m。1.4.5流式细胞仪分析将准备好的 1106个VSMCs 细胞悬液以 1000 r/min 离心 5 min，然后用 PBS 清洗。将细胞悬液在 4 下用 70%的乙醇进行过夜固定，然后在 4 下用 PBS 洗涤 2 次；加入终浓度为 50 mg/L 的 RNaseA，在 37 的水浴中孵育30 mins。用终浓度为50 mg/L 的PI 在4下孵育 30 min。通过流式细胞仪测量荧光强度，并通过流式细胞仪分析 DNA 含量。1.5统计学处理 xs所有实验数据采用均数标准差（）表示，使用 SPSS 19.0 版统计软件包处理数据。各组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P 0.05 认为差异有统计学意义。2结果2.1HUVEC 和 VSMCs 的细胞培养结果正常组 HUVECs 细胞贴壁生长，细胞呈梭形或不规则三角形，核清晰，呈圆形或椭圆形;正常的 VSMCs 多数呈梭形或长梭形，“峰、谷”生长状态明显，见图 2。2.2Euonymine 对 HUVECs 的存活率影响将不同浓度的 Euonymine（10，50，100 g/mL）分别与 HUVECs 共同孵育后，实验结果提示Euonymine 干预后，HUVECs 的存活率降低，时效关系明显，见图 3。不同浓度的 Euonymine 在72 h 可使细胞存活率分别减少 11.9%、22.4%和33.8%（P 0.01）。2.3MTT 法检测 Euonymine 对 HUVECs 及 VS-MCs 增殖的影响2.3.1Euonymine 抑制 HUVECs 增殖分别用不同浓度的 Euonymine（12.5，25，50，100 g/mL）与 HUVECs 共同孵育后，MTT 结果显示，不同浓ABHUVECsVSMCs图2正常 HUVECs 和 VSMCs 形态（100）Fig.2TypicalappearanceofHUVECsandVSMCs（100）A:正常对照组 HUVECs 的形态；B:正常对照组 VSMCs 的形态。第 7 期张 莉，等卫茅碱对人血管内皮细胞及血管平滑肌细胞增殖、迁移及细胞周期的影响3度的 Euonymine 和对照组相比，OD 值分别减少16.1%，25.0%，43.5%，87.0%（P 0.01）。实验结果提示，Euonymine 抑制 HUVECs 增殖，见表 1。以 HUVECs 的生长抑制率对 Euonymine 浓度的自然对数值（LN）做量效 Logistic 回归分析（=0.98，S=7.59），求得 Euonymine 对 HUVECs 的生长抑制率曲线，IC50为28.6 g/mL，见图 4。2.3.2Euonymine 抑制 VSMCs 增殖分别用不同浓度的 Euonymine（12.5，25，50，100 g/mL）与 VSMCs 共孵育 2 d，与对照组相比，MTT 提示各浓度 OD 值减少（P 0.01），见表 2。另外，Euonymine（25，50，100 g/mL）对 VSMCs 的抑制率在96 h 分别达到43.9%、63.2%、88.9%，见表2。以 VSMCs 的生长抑制率对 Euonymine 浓度的自然对数值（LN）做量效 Logistic 回归分析（=0.99，S=4.62），IC50为33.92 g/mL，见图 5。2.4Euonymine 抑制 VSMCs 迁移迁移实验结果显示，各实验组的迁移距离分别是：正常对照组（77.339.02）m，模型组（260.0526.12）m，Euonymine 25 g/mL 组（189.3615.68）m，Euonymine 100 g/mL（135.3311.04）m。实验 结 果 提 示，与 模 型 组 相 比，不 同 浓 度 的Euonymine 均 抑 制 VSMCs 迁 移（P 0.01），见图 6。2.5Euonymine 对细胞周期的影响2.5.1Euonymine 对血清诱导的 HUVECs 的细胞周期影响实验结果显示，与模型组相比，低剂量 Euonymine 组（25 g/mL）升高 G0/G1期的细胞，而 降 低 S 期 和 G2/M 期 的 细 胞 数；高 剂 量Euonymine 组（100 g/mL）S 期细胞数进一步减少，G2/M 期 细 胞 数 减 少（P 0.01）。结 果 提 示，Euonymine 干预后，HUVECs 有丝分裂被阻断于024487260708090100110*Cellular survival(%)ControlEuonymine(10 g/mL)Euonymine(50 g/mL)Euonymine(100 g/mL)h图3Euonymine 对 HUVECs 活性的影响Fig.3ViabilityofHUVECstreatedwithEuonymine xs表1不同浓度 Euonymine 对 HUVECs 增殖的影响（，n=6）xsTab.1EffectofdifferentconcentrationsofEuonymineontheproliferationofHUVECs（，n=6）分组OD（570nm）IR（%）FP正常对照组DMSO0.7680.06Euonymine（g/mL）12.50.6540.0816.1250.5910.1925.05.970.030*500.4600.0743.51000.1520.1287.0*P0.05；与正常对照组相比较，P0.05。1008060Rate of inhibition4020001.01.9The LN of TH-1concentration2.93.94.95.8图4Euonymine 作用 HUVECs 24 h 的生长抑制率曲线Fig.4Curve inhibition rate of Euonymine treatedHUVECsfor24h1008060Rate of inhibition40200012The LN of TH-1concentration3456图5Euonymine 作用 VSMCs 48 h 的生长抑制率曲线Fig.5CurveinhibitionrateofEuonyminetreatedVSMCsfor48h4昆明医科大学学报第 44 卷G0/G1期（P 0.01），见图 7。2.5.2Euonymine 对血清诱导的 VSMCs 细胞周期 影 响 实 验 结 果 显 示，与 模 型 组 相 比，Euonymine 25 g/mL 升高 G0/G1期的细胞数，而降低 S 期和 G2/M 期的细胞数；100 g/mL 组 S 期细胞数进一步减少，G0/G1期、G2/M 期细胞数增多（P 0.01）。实验结果提示，低剂量 Euonymine 组使 VSMCs 有丝分裂停滞于 G0/G1期，而高剂量Euonymine 组 VSMCs 有丝分裂阻滞于 G0/G1期和G2/M 期；将药物作用时间延长至 48 h，实验结果和 24 h 趋势保持一致，见图 8。3讨论PCI 术后 ISR 是一个多因素多环节参与的复杂病理生理过程。冠脉支架植入后可导致 VECs损伤，促进血管收缩，启动一系列血管损伤和炎症反应，还能促进损伤部位的血栓形成1519。因此，VECs 的损伤是 ISR 的启动因素；VSMCs 的过度增殖、迁移与凋亡造成支架内膜的逐渐增厚，是 ISR 形成的中心环节。目前，可供临床使用的支架涂层药物很少，包括紫杉醇和雷帕霉素及其400300Effect of EuonymineonVSMCs migration(m)200100*#0ControlModelEuonymine 25 g/mLEuonymine 100 g/mLEuonymine 25 g/mLEuonymine 100 g/mL对照组AB模型组 图6卫茅碱抑制 VSMCs 迁移Fig.6EuonymineinhibitsthemigrationofVSMCs xsA：划痕实验 24 h 后各实验组 VSMCs 迁移的图像；B：Euonymine 抑制 VSMCs 迁移距离的统计分析。与正常对照组比较，*P 0.01；与模型组比较，#P 0.05（，n=6）。xs表2不同浓度 Euonymine 对 VSMCs 增殖的影响（，n=6）xsTab.2EffectofdifferentconcentrationsofEuonymineontheproliferationofVSMCs（，n=6）分组OD（570nm）24h48h72h96h正常对照组DMSO0.7880.160.8410.140.8850.080.9250.20Euonymine（g/mL）12.50.6880.100.6800.130.6760.120.6370.04250.6260.080.6280.190.6070.100.5690.12500.5240.110.4250.150.4190.070.4020.181000.3120.070.2590.130.2190.170.1880.082000.2590.040.1850.160.1560.060.1370.18F6.216.496.616.76P0.041*0.041*0.031*0.028*P0.05；与正常对照组比较，P0.05。第 7 期张 莉，等卫茅碱对人血管内皮细胞及血管平滑肌细胞增殖、迁移及细胞周期的影响5衍生物，这些支架涂层药物降低了支架内再狭窄率，但内皮延迟愈合和支架内血栓形成增加等主要不良后果严重降低了其治疗效果20。本实验将卫茅碱作为研究材料，检测其对HUVECs 和 VSMCs 增殖的影响，探讨其在防治PCI 术后 ISR 中的潜在作用机制。本实验首先观察卫茅碱对 HUVEC 和 VSMCs 活性的影响。从MTT 法测定结果来看，卫茅碱可抑制 HUVECs 和VSMCs 增殖，IC50 分别为28.6 g/mL 和33.92 g/mL。接着笔者研究了卫茅碱对 VSMCs 迁移影响。结果表明，与模型组相比，卫茅碱在各个时间点对VSMCs 的迁移距离有明显的抑制作用（P 0.01），高剂量卫茅碱对 VSMC 的迁移抑制率最高达到79.1%。细胞周期作为增殖信号转导的最终共同路径，细胞周期的推进在血管增生性疾病中起着关键作用2129。为此笔者同时检测了卫茅碱对 HUVECs和 VSMCs 的细胞周期的影响。流式结果表明，HUVECs 与卫茅碱共孵育 24 h，低剂量卫茅碱组（25 g/mL）使 G1/G0期细胞增加，S 期及 G2/M 期细胞减少（P 0.01），随着卫茅碱浓度增加到100 g/mL，G1/G0期细胞增加明显，S 期及 G2/M期细胞减少，提示卫茅碱抑制 HUVECs 增殖可能主要通过抑制细胞周期由 G1/G0期向 S 期过渡，使之停滞于细胞周期的 G1/G0期。同时笔者观察到 VSMCs 经卫茅碱处理 24 h 时，低剂量卫茅碱（25 g/mL）主要阻滞细胞于 G0/G1 期，而高剂量卫茅碱则阻滞于 G0/G1及 G2/M 期，延长卫茅碱与VSMCs 的孵育时间到 72 h，不同剂量组 VSMCs均体现为 G2/M 期阻滞，且剂量依赖性明显。因此，卫茅碱抑制 VSMCs 的增殖作用可能与其引起细胞 G0/G1和G2/M 期阻滞密切相关。综上所述，卫茅碱主要通过抑制 VSMCs 的增殖和迁移，同时影响细胞周期，对于抑制 PCI 术后 ISR 的形成有潜在的临床应用价值，但其对HUVECs 亦有非选择性的抑制作用，其机理可能与其抑制 HUVEC 细胞周期的 G1/G0期向S 期过渡，使之停滞于细胞周期的 G1/G0期有关。20%FBSABCD20%FBS+Euonymine(100 g/L)DNA contentCell numberCell numberCell numberDNA contentDNA content20%FBS+Euonymine(25 g/L)100G2/MSG0/G150FCM percentage0Control(DMSO)Euonymine 25 g/mLEuonymine 100 g/mL xs图7卫茅碱对血清诱导的 HUVECs 细胞周期影响（，n=6）xsFig.7EffectofEuonymineonthecellcycleofHUVECsinducedbyserum（，n=6）AC：不同浓度的 Euonymine 作用 HUVECs 后 24 h 的 DNA 直方图；D：Euonymine 处理 24 h 的 HUVECs 的细胞周期的统计学分析。6昆明医科大学学报第 44 卷 参考文献 Jensen L O，Thayssen P，Thuesen L，et al.Influence of apressure gradient distal to implanted bare-metal stent oninstent 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细胞周期影响（，n=6）xsFig.8EffectofEuonymineonthecellcycleofVSMCsinducedbyserum（，n=6）AC：不同浓度的 Euonymine 作用 VSMC 后 24 h 的 DNA 直方图；DE：Euonyming 处理 24 h 和 48 h 的 VSMCs 的细胞周期分布。第 7 期张 莉，等卫茅碱对人血管内皮细胞及血管平滑肌细胞增殖、迁移及细胞周期的影响7Glogov S.Intimal hyplasia，vascular remodeling and therestenosis problemJ.Circulation，1993，88：152-158.11Zhao J，Zhang F，Xiao X，et al.Tripterygium hypoglaucum（Levl.）hutch and its main bioactive components:Recentadvances in pharmacological activity，pharmacokineticsand potential toxicityJ.Front Pharmacol，2021，12：715359.12Zhang L，Tao Y，Yang R，et al.Euonymine inhibits in-stent restenosis through enhancing contractile phenotype ofvascular smooth muscle cells via modulating thePTEN/AKT/mTOR signaling pathwayJ.Phytomedicine，2022，107：154450.13陈妍.昆明山海棠提取物对人血管内皮及血管平滑肌细胞增殖的影响D.昆明:昆明医科大学，2012.14Pasterkamp G，Ruijter H M，Libby P.Temporal shifts inclinical presentation and underlying mechanisms of ather-osclerotic diseaseJ.Nat Rev Cardiol，2017，14（1）：21-29.15Heiden K V，Gijsen F J，Narracott A，et 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