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壳聚糖基分子印迹磁性微凝胶的制备及释药特性
唐春燕 王红飞 张黎明
中山大学化学与化学工程学院 广州510275
摘要：分子印迹凝胶(MIHs)在分离、催化、传感等领域有重要应用，近年倍受关注。本研究以羧甲基壳聚糖为功能聚合物母体，京尼平为交联剂，经硅氧烷改性的Fe3O4粒子为磁性组分，采用油包水（W/O）反相乳液法制备新型咖啡因印迹磁性微凝胶（Fe3O4@SiO2@MIHs）和非分子印迹磁性微凝胶（Fe3O4@SiO2@non-MIH）。用红外IR、XRD、SEM、荧光光谱和磁学性能测量系统对微凝胶的组成、结构和性能进行了表征。释放实验表明，咖啡因在印迹微凝胶中的释放速率要比在非印迹微凝胶中的慢，且释放速率受模板分子和咖啡因负载量的影响。茶碱在咖啡因印迹微凝胶中的释放实验表明微凝胶对咖啡因有特异选择吸附性。
关键词:分子印迹微凝胶 壳聚糖;京尼平;药物释放

前言
分子印迹技术（molecular imprinting technique, MIT）是制备在空间结构和结合位点上与模板分子相匹配的材料，即分子印迹材料(molecularly imprinted materials , MIMs)的技术，常被形象的描述为制造识别“分子钥匙”的“人工锁”技术。分子印迹材料由于制备简单、功能可设计、坚固耐用而被誉为“万能的分子识别材料”，在传感、模拟酶、催化、离等领域得到了广泛的应用。[1-2]
传统方法制得的MIHs多为块状，需经粉碎、过筛等工序，获得的材料形状不规则、粒径分布宽，且粉碎过程中会破坏部分识别位点，产率较低。 [3]因此，制备结构规整、小尺寸，并具有更高的亲和力、选择性的MIHs是未来发展的趋势。
近年来，具有超顺磁性的材料在生物医学和生物科技方面收到人们的广泛关注，包括靶向药物输送、核磁共振成像（MRI）对比增强、生物传感器、快速环境和生物分离、痕量特定目标物质的浓缩。[4]赋予分子印迹材料磁性能，将有助于扩大其应用范围。
MIHs的传统应用领域是基于他们的选择吸附特性，但对MIHs的解吸附性能的研究则是一个相对较新的领域。一些早期的研究表明这些具有亲和性的材料可能在药物控制输送中具有潜在的应用价值。[5]将MIHs应用于药物输送上可能实现药物智能释放或者药物靶向输送。
多糖类天然高分子材料在药物输送领域得到了广泛的应用，因此，使用多糖为原料制备分子印迹材料引起人们极大的兴趣。壳聚糖是通过碱化处理几丁质而部分去乙酰基的聚多糖，而几丁质是自然界中最丰富的生物材料之一，它在生物医学上的应用已经得到了广泛的研究。京尼平作为一种新的天然交联剂，可以从栀子的果实中分离得到。与戊二醛相比，京尼平的细胞毒性要小10000倍。[6]
本研究将分子印迹技术与磁性、药物释放相结合，用油包水反相乳液法制备了分子印迹磁性微凝胶。
实验部分
1. 实验材料
壳聚糖（Mr=190000-310000，85-90%的脱乙酰度）Aldrich，京尼平Wako Pure Chemical Industries Ltd，KH-550江汉化学厂有限公司，吐温、司班、茶碱、咖啡因均由Alfa Aesar提供，其他未列出的试剂均为分析纯，由广州光华化学厂有限公司提供。
2. Fe3O4纳米粒子的制备
将1.99 g FeCl2·4H2O、5.41 g FeCl3 ·6H2O分别溶于20 mL水中，然后在强烈的机械搅拌下把两种铁盐溶液混合均匀。在室温下将200mL 0.6 M的NH4OH溶液加入到混合溶液中去，然后加入30 mL浓缩的氨水（25 w/w %）以保持反应的pH值在11到12之间。生成的棕褐色物质继续在室温下搅拌1 h后升温回流1 h，整个制备过程都是在氮气的保护下进行的。生成的Fe3O4纳米粒子用永久磁铁分离，倾去上层液，然后用水和乙醇洗涤所得的粒子，最后把它重新分散在50 mL纯水中。
3. Fe3O4@SiO2-NH2粒子的制备
将2 mL氨水(25 %)、10 mL水、3 mL先前制备的磁性纳米粒子溶液、10 mL乙醇溶液混合均匀，在机械搅拌的情况下向混合溶液中加入KH-550的乙醇溶液（1mL KH-550溶于15 mL乙醇中），室温下持续反应6 h。生成的粒子用磁铁分离，水洗去过量的反应物，然后重新分散在25 mL纯水中。
4. 羧甲基壳聚糖CMCS的制备
在室温下，将5.0 g壳聚糖加入到50 mL的异丙醇中，搅拌30 min后加入12.5 mL的氢氧化钠溶液。然后向混合溶液（其中氢氧化钠的浓度为13.3 M）中逐滴加入含25 g氯乙酸的异丙醇溶液，然后升温到60 ◦C继续反应4h。产物用乙醇沉淀后洗涤至中性，真空干燥。
5. Fe3O4@SiO2@MIH磁性微凝胶的制备
将一定量的Fe3O4@SiO2-NH2粒子和咖啡因加入到2%的CMCS水溶液中进行充分的相互作用，然后在搅拌下将混合溶液加入到正己烷（含有2%的Span80和1%的Tween20）中乳化半小时。将一定量的京尼平甲醇溶液（100mg/mL）逐滴加入到混合液中，室温下反应24 h。反应结束后用永性磁铁分离产物，并用乙醇和水反复洗涤以去除表面活性剂和未包裹Fe3O4@SiO2的MIHs。在相同的实验条件下，不加模板分子咖啡因制得非印迹的微凝胶Fe3O4@SiO2@non-MIH。将制得的MIH及non-MIH用乙酸/甲醇溶液（体积比为1/9）浸泡24 h洗脱，之后用甲醇洗，最后用去离子水洗至在溶液中检测不到咖啡因。过滤后在40 oC下真空干燥。
6. 咖啡因的释放实验
研究咖啡因在不同条件下制备的分子印迹微凝胶中的释放特性，改变的实验条件包括模板分子的用量和咖啡因的负载量等。具体的实验过程如下：将0.1 g干燥的印迹微凝胶或非印迹微凝胶分别浸泡在一定浓度的咖啡因水溶液中2 d，然后经分离、干燥得到负载咖啡因的微凝胶。将负载咖啡因的微凝胶置于50 mL pH=7.4的磷酸缓冲溶液中，并于30 oC及缓慢搅动条件下，每隔一定时间采用紫外-可见分光光度法测定释放量。咖啡因的测量波长为261.0 nm，咖啡因的最初负载量可以视为与实验结束时咖啡因的总释放量相等。不同时间的咖啡因释放百分比可以通过下式计算：
Percent release（%）=（Mt/M∞）×100 (1)
其中Mt是在t时刻咖啡因的累积释放量，M∞是在无限长的时间后咖啡因的累积释放量。
7. 茶碱的释放实验
为了表征制得的微凝胶对分子具有特异选择性，我们选择了分子结构几乎和咖啡因一样的茶碱做对照实验。咖啡因和茶碱的结构式见图1。将0.1 g干的Fe3O4@SiO2@MIH 和Fe3O4@SiO2@non-MIH分别浸泡在一定浓度的茶碱水溶液中2 d。然后经分离、干燥得到负载茶碱的微凝胶。将负载茶碱的微凝胶置于50 mL pH=7.4的磷酸缓冲溶液中，并于30 oC及缓慢搅动条件下，每隔一定时间采用紫外-可见分光光度法测定释放量。茶碱的测量波长为272.0 nm，茶碱的最初负载量可以视为与实验结束时茶碱的总释放量相等。不同时间茶碱的释放百分比可以通过下式计算：
Percent release（%）=（Mt/M∞）×100 (1)
其中Mt是在t时刻时茶碱的累积释放量，M∞是在无限长的时间后茶碱的累积释放量。

图1 咖啡因和茶碱的结构
结果和讨论
1. 红外光谱分析
图2 红外光谱图
图2中a、b、c、d分别为Fe3O4，Fe3O4@SiO2，Fe3O4@SiO2@MIH在模板分子洗脱前和洗脱后的红外光谱图。图a中586.0cm-1 是氧化物的吸收峰，本实验中是Fe3O4特征峰。b、c、d分别在1116 cm-1 、1114cm-1、1115 cm-1处存在着Si-O-Si的伸缩振动峰吸收峰，但a在1115 cm-1附近并没有相应的吸收峰。这证明了Fe3O4改性的成功。c在1209，1374，1725 cm-1处存在着吸收峰，但是在d却没有相应的吸收峰，表明了d中的模板分子咖啡因已被完全洗脱。另外，d中Fe3O4@SiO2@MIH中羧甲基壳聚糖中羧基的特征吸收峰1603和1401 cm-1，在c中已经分别移到了1630和1435 cm-1处。这是由于在未洗脱模板分子的印迹微凝胶中咖啡因通过弱的非共价作用（例如静电相互作用、范德华力和氢键）而与功能基团羧基间存在着一定的相互作用，即存在识别位点而使吸收峰偏移。
2. 荧光分析

图3 荧光发射光谱
图3分别展示了在激发波长为360 nm、不同条件下微凝胶的荧光发射光谱。a、b、c分别是印迹微凝胶在模板分子洗脱后、洗脱后再次吸附、第二次洗脱的荧光光谱。d、e则分别是非印迹的微凝胶在模板分子加入前后的荧光光谱。a、c和d是在纯水中测定的，而b和e则是在0.5 mg/mL的咖啡因水溶液中测定的，并且事先平衡24 h。从图中可以看出，最大发射波长在465 nm左右。对印迹微凝胶Fe3O4@SiO2@MIH而言，模板分子被第一次洗脱后的荧光强度最大（曲线a），重新吸附模板分子后出现了荧光猝灭现象（曲线b），但是第二次洗脱模板分子后（曲线c），荧光强度较吸附后有所增强，但仍比第一次模板分子洗脱后的荧光强度要弱。但是对非印迹微凝胶Fe3O4@SiO2@non-MIH而言，模板分子咖啡因的加入对其荧光强度几乎没有影响。分析以上现象可以得出荧光的淬灭是由于所加入的模板分子与微凝胶上的功能基团相互作用、相互识别的结果，由此也证明了聚合物中识别位点的存在。
3. X射线衍射分析
图4 X射线粉末衍射图
图4中a、b、c分别为Fe3O4，改性Fe3O4和印迹微凝胶Fe3O4@SiO2@MIH的X射线衍射图。a、b、c在2θ=30.1, 35.5, 43.1, 53.4, 57.0, 和62.6，都显示了比较强的峰，这些信息和标准数据库JCPDS file (PDF No. 85-1436)中的信息相符。这六个可辨别的特征峰分别对应着（220）,（311）, （400）,（422）,（511）和（440）晶面，制得的Fe3O4为尖晶石结构。而且，由此也证明了在Fe3O4上包裹硅层和交联的壳聚糖后，并未导致Fe3O4发生相变。
4. 磁性能分析
图5 Fe3O4@SiO2（a）和Fe3O4@SiO2@MIH（b）在300 K条件下的磁滞回线

图6 磁场作用下MIH的分离效果图
对于磁性材料来说，磁响应是磁性材料的一项至关重要的性能。[7]磁滞回线表征了磁性材料对外加磁场的响应能力。图5分别为Fe3O4@SiO2（a）和Fe3O4@SiO2@MIH（b）的磁滞回线。从图5可以看出两者的形状很相似，都呈S形。当外加磁场强度减小至零时，剩余磁化强度Mr为零，矫顽力也为零。这说明制备出的微凝胶具有超顺磁性，保持磁化强度的能力很小，有利于外磁场撤去后的重新分散。Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@MIH的饱和磁化强度Ms分别为59.6 emu/g和32.0 emu/g。虽然Fe3O4@SiO2@MIH的饱和磁化强度与Fe3O4@SiO2相比有所下降，但是它对外加磁场仍有十分好的磁响应性，在其完成对模板分子的主动吸附与识别后便可在外加磁场作用下很容易地将其固、液相分离。图6为在外加磁场作用下Fe3O4@SiO2@MIH的分离、重新分散效果图。当外加磁场不存在时，瓶子中黑色均一液能够稳定的存在。但当在瓶子右边放置一块永久磁铁时，原来的黑色粒子就被吸引到有磁铁的一边，溶液就变得澄清透明了。由于Fe3O4@SiO2@MIH具有超顺磁性，因此制得的微凝胶不会聚集在一起，当外加磁场撤离后，又能够很好的的分散在溶液中。
5. 扫描电镜

a b

c d
图7 印迹微凝胶（a、b、c）和非印迹微凝胶（d）的扫描电镜照片
图7为印迹微凝胶和非印迹微凝胶的扫描电镜图。从图中可以看出，制得的微凝胶大部分呈球形，粒径在2到 8 μm之间，表面比较粗糙。在更高的放大倍数下可以看出，印迹微凝胶的表面呈现出不规则的疏松多孔结构，这在非印迹微凝胶的表面却并没有观察到。这是由印迹分子进出微凝胶的传质过程造成的，这不仅说明在微凝胶内形成了真正的分子识别位点，而且模板分子还会改变微凝胶的形态，进一步影响吸附速率和吸附量。
6. 模板分子用量对释放速率的影响
图8为模板分子用量对咖啡因释放速率的影响分析图。从图中可以看出，随着咖啡因与氨基葡萄糖单元的摩尔比从0：10增加到1：10，咖啡因的释放速率不断减小。分子印迹微凝胶的制备过程中有一个预组装的过程，在这个过程中，模板分子与功能基团通过非共价相互作用而形成复合物，然后再用交联剂进行交联反应。当模板分子洗脱后，在聚合物中就留下了模板分子的特殊识别位点。[8]咖啡因的释放速率图可以证明，这些特殊识别位点的多少与交联之前加入的模板分子的量成一定的正比例关系。模板分子越多，则特殊识别位点也越多。而特殊识别位点越多，则被印迹的分子就越难从聚合物中释放出来。但是，当咖啡因与氨基葡萄糖的摩尔比上升到2.0:10时，可以发现咖啡因的释放速率反而变快的现象。这是由于模板分子过量，在聚合物中形成了一部分的非特异识别位点。

图8 模板分子用量对释放速率的影响（吸附量：10 mg咖啡因每克干凝胶，京尼平：氨基葡萄糖=1/2）
7. 负载量对释放速率的影响

图9 负载量对释放速率的影响（咖啡因：氨基葡萄糖=1：10，京尼平：氨基葡萄糖=1：2）
咖啡因的负载量不同，则释放速率也会不同。图12为不同咖啡因负载量时的释放速率图，咖啡因的负载量从2 mg一直增加到20 mg每克干凝胶。当咖啡因的负载量较低为2 mg时，印迹凝胶显示出较好的控制释放能力。当咖啡因的吸附量增加时，释放速率也随着增加。咖啡因是通过两种作用被吸附到微凝胶的网络中去的，一种是特异性吸附，另一种是非特异性。[9]由于印迹微凝胶中特异识别位点的数目是一定的，当负载量增加时，非特异吸附的比例也将随之增加。非特异吸附的比例增加，将导致咖啡因释放速率的增大。
8. 茶碱的释放实验
图10为茶碱在咖啡因印迹的微凝胶和非印迹微凝胶中的释放速率图。从图中可以看出，对非印迹微凝胶Fe3O4@SiO2@non-MIH而言，咖啡因和茶碱的释放速率并没有什么明显的差异。但是，对于咖啡因印迹的微凝胶Fe3O4@SiO2@MIH而言，两者的释放速率则存在着明显的差异。茶碱的释放速率明显比咖啡因的释放速率快很多。虽然咖啡因和茶碱的分子结构十分相似，但是印迹微凝胶还是对咖啡因显示出了高度的选择性。这些都表明了制得的印迹微凝胶对咖啡因具有选择吸附性，这对在控制药物释放体系中的应用提供了良好的保障。

图10 茶碱的释放速率（咖啡因：氨基葡萄糖=1：10京尼平：氨基葡萄糖=1：2 吸附量：10 mg茶碱每克干凝胶）
结论
本研究采用反相乳液法制得了粒径较均一，并具有超顺磁性的微凝胶。该磁性微凝胶对咖啡因具有较好的选择性，有望用于药物的传输体系。
致谢：感谢中山大学化学与化学工程学院第九届创新化学实验与研究基金项目对本研究工作的资助。

参 考 文 献
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Preparation and Drug Release Properties of Molecularly Imprinted Magnetic Microgels based on Chitosan
TANG Chun-yan, WANG Hong-fei，ZHANG Ling-ming
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)
Abstract Molecularly imprinted hydrogels (MIHs) have attracted more and more attention because of their enormous potential applications in the area of biosensor, separation and catalysis during the past decade. Caffeine imprinted magnetic microgel (Fe3O4@SiO2@MIH) and non-imprinted magnetic microgel (Fe3O4@SiO2@non-MIH) were prepared by water in oil reverse emulsion method, using carboxymethyl chitoan (CMCS) as the functional polymer，genipin as the cross-linker，and silica-modified Fe3O4 as the magnetic component. The structures of Fe3O4@SiO2@MIH were characterized by IR and XRD analyses. Fluorescence spectra confirmed the presence of the recognition sites. The microgels were well-shaped beads with the diameter distribution from 2 to 8 μm and were superparamagnetic. By in-vitro release study, the release rate of caffeine from Fe3O4@SiO2@MIH was much slower than that from Fe3O4@SiO2@non-MIH, and the release rate was dependent on the amounts of the template, and loading amount. The release test of theophylline from the caffeine imprinted microgel exhibited an inherent selectivity to caffeine.
【Keywords】Molecularly imprinted microgels ; Chitosan ; Genipin ; Drug release