肠道粘膜屏障功能及其临床检测.pdf

肠 道 粘 膜 屏 障 功 能 及 其 临 床 检 测收稿日期:2004-07-01作者简介:尉秀清(1975-),男,山东人,主治医师,博士研究生;姚集鲁(1939-),男,广东人,教授,博士生导师;文卓夫(1961-),男,湖南人,副教授,硕士生导师尉秀清1,2 综述 姚集鲁2,文卓夫1 审校(中山大学附属第三医院 11 消化内科;21 传染科,广东 广州 510630)摘要:肠道粘膜屏障主要由肠道粘膜机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障四部分组成,这些功能分别有相应的结构基础;采用光学显微镜、电子显微镜及免疫组化等方法观察肠道粘膜的显微、超微结构的变化或通过分子探针检测肠道通透性、粪便细菌选择性培养等,可从不同方面反映肠道粘膜的屏障功能;细菌培养、标记菌示踪、聚合酶链反应等检测肠道细菌移位可间接反映肠粘膜的整体屏障功能。这些方法为我们进一步深入研究肠道粘膜屏障在防治内源性感染的作用提供了依据。关键词:粘膜屏障功能;肠道通透性;临床检测中图分类号:R446 文献标识码:A 文章编号:1004-2369(2004)10-0415-04 肠道除消化吸收功能外,在防止感染方面具有非常重要作用。正常情况下肠腔内细菌不能透过肠壁进入全身脏器和组织,这有赖于肠道的屏障功能的完整,肠道粘膜屏障主要由四部分组成:即肠道粘膜的机械屏障、肠道粘膜免疫屏障、肠道化学屏障和生物屏障。肠道屏障功能对防止肠源性感染具有重要意义。1 肠道粘膜屏障的结构111 机械屏障由肠道粘膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成,能有效阻止细菌穿透粘膜进入深部组织,肠道粘膜上皮的完整性及正常的再生能力是肠粘膜屏障的结构基础。肠上皮为单层柱状上皮细胞,由 吸收 细胞、杯状 细 胞及 潘氏 细 胞(Paneth cell)等组成。吸收细胞侧面和质膜在近肠腔侧与相邻的细胞连接形成紧密连接复合体,包括两类:绒毛上皮间紧密连接,孔径较小,结构层次复杂,只允许水分子和小分子水溶性物质有选择性通过;腺管细胞间紧密连接孔径较大而层次较简单,可容许较大的分子通过1。潘氏细胞具有一定的吞噬细菌的能力,并可分泌非特异性的溶菌酶,调节肠道菌群。近年研究发现,潘氏细胞还分泌天然抗生素肽(Antibiotic peptide)人类防御素 5(human defensin5,HD-5)和人类防御素 6-(human defensin-6,HD-6),都是由 32 36 个氨基酸残基组成的小分子肽,其抗菌谱广,杀灭微生物作用强大,在抑制细菌移位、防治肠源性感染方面日益受到重视2。杯状细胞分泌的粘液在粘膜表面形成疏水的粘液凝胶层,主要成分是粘液糖蛋白,它覆盖肠上皮表面,可阻抑消化道中的消化酶和有害物质对上皮细胞的损害。粘液糖蛋白本身的结构和带有负电荷的特性,有利于包裹细菌;粘膜糖蛋白暴露的化学基团与肠上皮表面结构类似,易于细菌识别和粘附3;粘液糖蛋白还与病原微生物竞争抑制肠上皮细胞上的粘附素受体,抑制病菌在肠道的粘附定植4。另外,肠道的液体动力系统也是肠道机械屏障的一部分,肠道节律性的定向蠕动,使肠内容物不停地下行冲刷,在这种动力推动下,肠上皮表面的粘液#415#国外医学内科学分册2004年 10 月第 31 卷第 10期分泌物也形成了定向下行的粘液流,这两种定向下行的动力就构成了肠道液体动力系统,整个粘膜表面都处在这种动力的冲刷之下,松弛粘附在粘膜上的细菌容易被清除,从而可预防小肠细菌过度增生和肠源性感染。112 化学屏障由胃肠道分泌的胃酸、胆汁、各种消化酶、溶菌酶、粘多糖、糖蛋白和糖脂等化学物质组成。胃酸能杀灭进入胃肠道的细菌,抑制细菌在胃肠道上皮的粘附和定植;溶菌酶能破坏细菌的细胞壁,使细菌裂解;粘液中含有的补体成分可增加溶菌酶及免疫球蛋白的抗菌作用;其中,肠道分泌的大量消化液可稀释毒素,冲洗清洁肠腔,使潜在的条件致病菌难以粘附到肠上皮上。113 生物屏障肠道常驻菌群中 99%左右为专性厌氧菌,与其它细菌构成一个相互依赖又相互作用的微生态系统,这种微生态平衡构成了肠生物屏障5。专性厌氧菌(主要是双歧杆菌等)通过粘附作用与肠上皮紧密结合,形成菌膜屏障,可以竞争抑制肠道中致病菌(如某些肠道兼性厌氧菌和外来菌等)与肠上皮结合,抑制它们的定植和生长;也可分泌醋酸、乳酸、短链脂肪酸等,降低肠道 pH 值与氧化还原电势及与致病菌竞争利用营养物质,从而抑制致病菌的生长。114 免疫屏障肠道粘膜免疫屏障是区别于系统性免疫的功能发达的局部免疫系统。根据功能和分布,可将肠道粘膜免疫系统分成肠相关淋巴组织(gu-t associated lymphoid tissue,GALT)和弥散免疫细胞。肠相关淋巴组织主要指分布于肠道的集合淋巴小结,即 Peyer 结(Peyer.s patches),是免疫应答的诱导和活化部位;弥散免疫细胞则是肠粘膜免疫的效应部位。11411 M 细胞:为一种特化的扁平上皮细胞,是位于粘膜淋巴结的滤泡上皮中的抗原递呈细胞6,它与邻近上皮细胞间可通过桥粒紧密连接,形成上皮障碍,将肠道内抗原物质与上皮下淋巴组织隔开;能摄取和运输多种大分子物质,如微生物和微粒等颗粒性抗原,把它们传递给粘膜下的淋巴组织,淋巴滤泡生发中心的上皮内专有抗原递呈细胞如巨噬细胞、树突状细胞,处理经 M 细胞转运来的抗原然后呈递给 T、B淋巴细胞,产生抗原特异性 B 淋巴细胞,在生发中心繁殖后,通过血流迁移到远处的粘膜和腺体组织,进一步分化成熟为浆细胞,产生分泌型 IgA,跨越 M 细胞转运抗原为启动肠粘膜免疫应答的最重要的第一步,因而,M 细胞起/第一信息 通道0(first information conduct)的作用7。11412 粘膜层淋巴细胞(LPL):LPL 位于粘膜固有层,T、B细胞均很丰富,已发现在粘膜部位的免疫应答以 Th2型为主,定居在固有层的CD4+Th2细胞可分泌多种 Th2型细胞因子如转化生长因子(TGF)-B、白介素(IL)-4、IL-5、IL-6及 IL-10,固有层浆细胞所分泌的大量 IgA 可通过分泌片的介导进入粘膜表面,中和抗原物质,起到清除外来抗原,保护机体的作用 8。11413 肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lym-phocytes,IEL):是免疫效应细胞,是一组 CD8+细胞,具有细胞毒作用,主要位于肠道上皮之间和绒毛顶端,被激活后可释放 IL-2,3,4,5,10、干扰素(IFN)-A、IFN-C,TGF-B等多种细胞因子;IEL 有与细胞毒 T 细胞及自然杀伤细胞(NK)相似的胞内颗粒,如穿孔素、端粒酶和丝氨酸酯酶,故 IEL 的主要功能是细胞杀伤作用,因此在防御肠道病原体入侵方面发挥重要的作用9。另外,它对抑制粘膜过敏反应及肠上皮细胞的修复10也具有重要意义。11414 肠巨噬细胞:肠巨噬细胞(M)是骨髓干细胞发育成熟进入血液后定位于肠道的巨噬细胞,大多位于固有层。M 起抗原呈递的作用,又具有吞噬灭菌的功能,因而也是肠道粘膜免疫屏障的重要组成部分;当它活化时可分泌血小板激活因子和肿瘤坏死因子,后两者可损伤肠道粘膜,因而 M 过度激活、活化时反而可造成肠道粘膜屏障功能损伤。当M 丧失杀菌功能时,M 可将其内吞噬的细菌带到肠外,到肠系膜淋巴结,并释放活菌,从而引发肠源性细#416#国外医学内科学分册 2004 年 10 月第 31卷第 10 期 菌移位。11415 分泌型 IgA(secretory immunoglobulin A,sIgA):是机体内分泌量最多的免疫球蛋白,是胃肠道和粘膜表面主要免疫效应分子,对消化道粘膜防御起着重要作用,其中以 sIgA 为主的体液免疫起主导作用,它是防御病菌在肠道粘膜粘附和定植的第一道防线11。肠道中的sIgA 可阻止病原体在肠粘膜表面的粘附,可中和细菌产生的毒素,中和病毒,可以增强具有FC 受体细胞的吞噬功能,并与补体和溶菌酶协同抗菌。sIgA 主要由肠道粘膜固有层内 IgA+的浆细胞合成、分泌,因而 IgA+的浆细胞的数量、功能的改变,势必影响肠道粘膜的免疫功能。11416 淋巴细胞归巢:肠粘膜淋巴细胞进入血循环参加淋巴循环,记忆淋巴细胞可通过肠粘膜的高内皮静脉重新回到原来所在的肠粘膜和肠系膜淋巴结的现象叫淋巴细胞的归巢。淋巴细胞的归巢则主要取决于淋巴细胞上的粘附分子与靶器官血管内皮细胞上配体之间的相互作用,这种归巢特性对于肠道粘膜免疫屏障的维持具有重要意义。2 肠道屏障的临床检测211 反映肠道粘膜机械屏障的指标21111 肠道通透性:正常情况下,肠道粘膜对许多物质并不吸收或吸收量极少,但当肠道粘膜机械屏障功能受损时,这些物质通过肠道的量会增加,显示肠道通透性增高,因而肠道通透性增高是肠道粘膜机械屏障功能受损的间接反映指标。通常可用各种核素标记肠道不吸收的大分子物质(如 DTPA 或 EDTA 等),通过检测尿中核素标记物的排泄量来确定肠道通透性是否增高;也有学者以 非代谢性 多糖聚乙二 醇(PEG)后检测尿中 PEG 排泄率反映肠道通透性是否增高;以非代谢性的低聚糖为探针的肠道通透性检测方法在临床最为常用,其中又以乳果糖/甘露醇双糖分子探针为代表和最常用,尿中两者比值增高表明肠道通透性增高,粘膜机构屏障功能受损1。21112 光镜检查:内镜下取粘膜活检或大体标本常规固定、制片、HE 染色后,利用图像分析系统,可定量测定肠粘膜绒毛高度、宽度和隐窝深度及记数 1 mm 内绒毛数量等。这些指标的变化,在一定程度上可反映肠道粘膜机械屏障的损伤。21113 电子显微镜检查:在电镜下对肠道粘膜上皮层结构进行观察,并经图像分析系统定量分析,可对肠粘膜上皮细胞内线粒体体密度、数密度、比面积进行定量分析;也可对微绒毛的长度、宽度、长/宽比及密度和上皮细胞间隙、紧密连接的结构等指标进行观察12,这些指标可从超微病理的角度对肠道粘膜机械屏障的损伤进行检测。212 反映肠道粘膜生物屏障的指标主要通过对大便进行选择性细菌培养了解肠道菌群变化,尤其是双歧杆菌等厌氧菌的变化,能够反映肠道粘膜生物屏障功能的变化。213 反映肠道粘膜免疫屏障的指标肠道粘膜免疫功能主要包括肠道粘膜浆细胞分泌 sIgA 和上皮内淋巴细胞的细胞毒样功能等。21311 sIgA 表达水平的检测:可通过免疫组化法观察检测粘膜下固有层 IgA+浆细胞表达水平来检测,计算平均每个肠绒毛表达 IgA+的浆细胞数或单位长度粘膜内 IgA+的浆细胞数,可以量化反映肠道粘膜浆细胞分泌 sIgA 的能力13,14;也可通过检测粪便中 sIgA 含量来反映肠道粘膜免疫功能15。21312 IEL 计数:通过对 HE 染色粘膜组织随机计数 500 1 000 个粘膜上皮细胞,同时计数其间的淋巴细胞数,取百分比即为 IEL 计数值,可反映上皮内淋巴细胞的数目变化并反映出粘膜细胞免疫功能的变化。21313 固有层巨噬细胞表达水平:CD68 系巨噬细胞标记性分子,用抗 CD68 抗体作为一抗进行免疫组化法观察,可检测巨噬细胞的分布规律和数量,通常利用图像分析系统,通过随机观察 10 个高倍镜视野计算出 CD68+细胞的面积百分比,作为肠粘膜巨噬细胞水平的量化指标16,17。#417#国外医学内科学分册2004年 10 月第 31 卷第 10期214 反映肠道屏障功能完整性的综合指标肠粘膜屏障的完整性的损伤也可用细菌移位来表示,所谓移位,即为肠内细菌经肠粘膜至局部淋巴结或血液,发生细菌转位表明肠粘膜抵抗细菌的屏障功能减退。细菌移位常用的诊断方法有细菌培养、荧光或特殊质粒标记细菌示踪法等。21411 细菌培养法:通常是在无菌条件下取肠系膜淋巴结等进行细菌培养,培养到细菌即为阳性,该法主要用于动物实验,开腹或腹腔镜手术等少数情况下可用于人体研究,但这一方法有相当大的创伤性,难以在人体广泛应用。21412 标记细菌示踪法:荧光或同位素标记细菌示踪法通常采用荧光或同位素标记大肠杆菌,给动物模型口服标记菌后,可根据标记菌的体内分布情况,判断有无细菌移位及移位的过程,但由于荧光及同位素标记菌与非标记菌间相互染色及体内非特异性荧光等可造成假阳性。质粒标记细菌示踪法常用带 PUC19质粒大肠杆菌作为示踪菌 18,动物模型口服标记菌后,根据标记菌的体内分布情况进行判断,由于PUC19质粒不通过细菌接合作用转移,因而特异性较高,由于带有抗氨苄青霉素基因、具有多克隆酶切位点从而易于确定移位菌同源性。这两种方法由于能确定移位菌同源性问题,因而是研究动物模型的良好手段;但由于需要口服大肠杆菌活菌,安全性问题目前尚无完全解决,目前暂时不适宜在人体应用。21413 聚合酶链反应(PCR)法检测细菌移位:临床及动物实验均发现肠道细菌移位最常见的是大肠杆菌,占 50%以上 19,而厌氧菌血症中50%90%为脆弱类杆菌。据此,Kane 等20提出用 PCR 法检测外周血大肠杆菌以诊断肠道细菌移位;随后,Kane 等21又提出同时用 BG-1/BG-4、BFR-1/BFR-1 及共同引物 16SrRNA-/16SrRNA-三对引物对每个外周血样品进行DNA 扩增,分别检测外周血大肠杆菌、脆弱类杆菌及多种肠源性细菌,以诊断肠道细菌移位。PCR 法检测到血液中肠源性细菌,可间接反映粘膜屏障功能的异常。3 结 语肠道的粘膜屏障功能对于预防肠源性感染具有重要意义,目前对粘膜屏障的结构已经具有相当程度的了解;临床上已经可以对肠道的粘膜屏障功能进行专项或综合性的检测,这些为我们进一步深入研究是否可以从维护肠道的粘膜屏障角度防治内源性感染提供了手段。参考文献:1 Bjarnason I,MacPherson A,Hollander D1 J1 Gas-troenterology,1995,108:1566-15811 2 Cunliffe RN1 J1 Mol Immunol,2003,40:463-4671 3 Mantis NJ,Cheung MC,Chintalcharuvu KR,et al1J1 J Immunol,2002,169:1844-1851 1 4 Specian RD,Oliver MG 1 J1 Am J Physiol,1991,26(2,Pt l):183-1931 5 Fooks 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