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中国农业科学 2008,41(10):3249-3255 Scientia Agricultura Sinica doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2008.10.043 收稿日期：2007-08-27；接受日期：2007-10-30 基金项目：国家科技部奶业支撑计划（2006BAD04A12，2006BAD04A01）作者简介：狄和双（1979-），女，河北南皮人，博士研究生，研究方向为动物生殖生理与调控。Tel：[phone]；E-mail：。通讯作者王根林（1957-），男，江苏靖江人，教授，研究方向为动物生殖生理与调控。Tel：[phone]；E-mail：glwang TGF-1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及 HSP70 蛋白表达的影响 狄和双，杜 娟，张中霞，黄静燕，崔群维，程凯宁，王根林（南京农业大学动物科技学院，南京 210095）摘要：【目的】探讨 TGF-1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和 HSP70 蛋白表达的影响。【方法】TGF-1作用乳腺上皮细胞不同时间，收集细胞及培养液，应用 MTT 检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡率、比色法检测 LDH 活性、琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 完整性、Western bolt 技术分析 HSP70 蛋白的表达量。【结果】1、5、10 ngml-1的TGF-1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖，且随浓度增加抑制作用加大，呈现剂量依赖性，其中10 ngml-1 TGF-1组与对照组差异显著（P0.05）；10 ngml-1 TGF-1作用于乳腺上皮细胞,随着作用时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高，其中 6、12 和 24 h 与对照组相比差异极显著（P0.01）；LDH 活力随作用时间延长而升高，12、24 h与对照组差异极显著（P0.01）；DNA 完整性随 TGF-1作用时间的延长发生不同程度降解；TGF-1作用 26 h细胞大量表达 HSP70，6 h 达到高峰，而后下降，212 h 的表达量均极显著高于对照组（P0.01）。【结论】TGF-1可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖，具有浓度依赖性。10 ngml-1 TGF-1可以显著增加细胞凋亡率，提高细胞培养液中 LDH 活力，使细胞 DNA 发生不同程度的降解，同时 HSP70 蛋白随 TGF-1作用时间发生显著的表达变化。本试验结果表明，TGF-1可以以促进上皮细胞凋亡的方式，促进奶牛乳腺发生退化。关键词：TGF-1；乳腺上皮细胞；细胞凋亡；HSP70 Effects of TGF-1 on Proliferation,Apoptosis and HSP70 Expression of Mammary Epithelial Cells of Dairy Cow DI He-shuang,DU Juan,ZHANG Zhong-xia,HUANG Jing-yan,CUI Qun-wei,CHENG Kai-ning,WANG Gen-lin(Animal Science and Technology College of Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095)Abstract:【Objective】The aims of present study were to investigate the effects of TGF-1 on proliferation,apoptosis and HSP70 expression of the mammary epithelial cells of dairy cow.【Method】Bovine mammary epithelial cells were cultured in DMEM/F12+10%CS medium with TGF-1 and cells and supernatant were collected.The cell proliferation and apoptosis,activity of LDH,integrity of DNA,and expression of heat shock protein 70(HSP70)were detected by MTT,Flow cytometry,lactate dehydrogenase(LDH)kit,agarose gel electrophoresis and Western bolt,respectively.【Result】The results showed that cells proliferations were inhibited after treated with TGF-1 in dose dependent way.The rate of apoptosis cells significantly increased after treatment with TGF-1 for 6,12,24 hours（P0.01）.The activity of LDH was significantly higher in the treated groups than that in the control group（P0.01）.The nucleotide of DNA was degradated gradually as treatment time increased.The expression of HSP70 increased after TGF-1 treatment for more than 2 hours and it reached the highest level when treated for 6 h,then decreased.【Conculsion】TGF-1 could inhibit the proliferation of bovine mammary epithelial cells in a dose-dependent way.At a dose of 10 ngml-1,TGF-1 could significantly stimulate cell apoptosis and increase LDH activity,which were resulted in degradation of DNA.3250 中 国 农 业 科 学 41 卷 Long-term culture of bovine mammary epithelial cells with TGF-1 could lead to the up-regulation of the expression of HSP70.It is suggested that TGF-1 could promote the apoptosis pathway of bovine mammary epithelial cells,and accelerate the involution of bovine mammary.Key words:TGF-1;Bovine mammary epithelial cells;Apoptosis;HSP70 0 引言【研究意义】在动物哺乳周期中，乳腺经历发育、分化和退化的循环过程，乳腺细胞数量的变化与动物的妊娠期、哺乳期和退化期有密切关联，而且决定了哺乳期间的产奶量，因此，退化期的幸存细胞数量可能影响哺乳期的产奶量。研究表明，啮齿动物、断奶后母猪1、山羊2和牛3乳腺退化期主要是通过细胞凋亡减少乳腺细胞数量。目前国外学者多采用啮齿动物退化期的乳腺作为凋亡模型来研究治疗人的乳腺癌，因此阐明退化期乳腺凋亡的调节机理对乳用动物生产力的提高及乳腺癌的治疗意义重大。【前人研究进展】乳腺内乳汁积滞是诱导退化期乳腺凋亡的主要原因，退化期的乳腺凋亡除受到内分泌激素的调节外，局部细胞因子也成为研究退化期乳腺凋亡的焦点。乳腺退化期 TGF-三种亚型的 mRNA（TGF-1、2、3）表达上调4,5，通过它们共同的受体发挥作用。鼠、羊、牛和猪等动物乳腺积滞乳汁期间过度表达 TGF-，同时检测到乳腺凋亡（乳腺组织呈现 DNA 断裂、TUNEL染色阳性等凋亡特征）水平增加13，而大鼠的 TGF-基因敲除后乳汁积滞期间乳腺组织块的凋亡水平较低。转染 TGF-1基因到大鼠妊娠期和哺乳期的乳腺中，与野生型大鼠相比，转基因大鼠的乳蛋白合成减少，产乳量下降，分泌上皮细胞的生存能力下降6。用小鼠和牛的乳腺上皮细胞系体外建立退化模型，也发现乳腺上皮细胞出现 DNA 断裂、形成凋亡小体等明显的凋亡特征，同时 TGF-及其受体水平表达增 加7。可见，TGF-是乳腺退化期细胞凋亡的重要介导者。【本研究切入点】TGF-主要通过线粒体凋亡路径诱导啮齿动物和猪的乳腺上皮细胞凋亡1,8,9，有关奶牛乳腺退化期是否与TGF-过度表达从而诱导凋亡有关的研究报道较少，TGF-对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响及作用机理有待研究。【拟解决的关键问题】本试验以体外培养的 312 代的奶牛乳腺上皮细胞为材料，研究 TGF-1对于乳腺上皮细胞凋亡的影响及对细胞 HSP70 的表达效应，研究 TGF-与退化期乳腺凋亡的关系，为进一步阐明乳腺退化期细胞凋亡的机理提供理论依据。1 材料与方法 1.1 乳腺细胞培养 按照南京农业大学乳牛科学研究所试验室建立的方法，体外培养奶牛乳腺上皮细胞10。用含 10%小牛血清（GIBCO）的 DMEM/F12 培养液（GIBCO）作为基础培养基，于 37、5%CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于试验。1.2 MTT 法检测 TGF-1对乳腺上皮细胞增殖的影响 用 0.25%的胰蛋白酶和 0.02%的 EDTA 消化 80%融合的上皮细胞，用基础培养基调节细胞浓度为5104个/ml，按 100 l/孔接种于 96 孔板。24 h 后吸弃培养基，将细胞分为对照组（DMEM/F12+10%血清）、处理组为不同浓度 TGF-1（CYTOLAB）组（1、5、10 ngml-1）诱导培养 48 h。空白组为培养液无细胞，以空白调零。每个处理设 3 个复孔，试验重复 3次。培养结束后加入 MTT（5 mgml-1，Sigma）20 l/孔，继续培养 4 h，甩去培养液，加入 DMSO150 l/孔，静置 30 min，在酶标仪（芬兰 Labsystem 公司）上选择双波长模式，快速振荡 15 s 后，测定 490 nm处的吸光值。1.3 流式细胞仪检测 TGF-1对乳腺上皮细胞凋亡的影响 用基础培养基制备乳腺细胞悬着液，调整细胞浓度为5106个/ml，接种于25 cm2培养瓶,培养35 d，TGF-1（10 ngml-1）作用乳腺上皮细胞 24 h，在 0、6、12 和 24 h 分别收集细胞，以 Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡，按照试剂盒（BD Pharmingen，CAT：556547）说明进行操作。0 h 组不加 TGF-1作为对照组，以下相同。1.4 TGF-1对于乳腺上皮细胞培养液中 LDH 活力的影响 用基础培养基制备乳腺细胞悬浊液，接种 24 孔培养板，每孔 1104个细胞，培养 35 d，TGF-1（10 ngml-1）作用 24 h，在不同时间点收集细胞培养液，按 LDH 试剂盒（南京建成）使用说明检测。1.5 TGF-1对乳腺上皮细胞 DNA 完整性的影响 用基础培养基制备乳腺细胞悬浊液，接种 6 孔培 10 期 狄和双等：TGF-1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及 HSP70 蛋白表达的影响 3251 养板，每孔 1104个细胞，培养 35 d，TGF-1（10 ngml-1）作用 24 h，在不同时间点收集细胞，酚-氯仿-异戊醇法抽提细胞 DNA，于 1%琼脂糖凝胶中电泳，检测细胞 DNA 完整性。1.6 TGF-1对乳腺上皮细胞 HSP70 表达的影响 蛋白提取：制备乳腺细胞悬着液，调整细胞浓度为 5106个/ml，接种于 25 cm2培养瓶，每瓶 3 ml，待细胞长满后，弃去培养液，每瓶加入培养液 3 ml，然后加入 TGF-1至终浓度为 10 ngml-1，分别作用 0、2、4、6、12 和 24 h，弃去培养液，加入蛋白裂解液，冰浴作用 20 min，将细胞收集于 1.5 ml 离心管中，4，10 000 r/min 离心 10 min，收集上清，测定蛋白含量，70冻存备用。Western blot：取 50 g 提取的蛋白，加入等体积的蛋白变性液，煮沸 5 min 后进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，分别用抗 HSP70 的单克隆抗体（武汉博士德，1500）和抗 微管蛋白（-tubulin）的抗体（武汉博士德，1500）孵育膜，再加入辣根过氧化物酶标记的相应的二抗（110 000），最后加入化学发光剂 ECL（enhance chemiluminescen，化学发光增强剂，北京普利莱公司），在暗室中曝光，显影，定影，在胶片上获得相应的 HSP70（70 kD）和-tubulin（55 kD）的条带，照相保存结果，应用培清 GIS 凝胶图像处理系统（自动凝胶图像分析仪 JS-380，上海）进行分析，HSP70 蛋白表达以 HSP70 条带的强度与-tubulin 条带强度的比值来表示。1.7 数据分析 试验各处理组设置 312 个重复,每个试验独立重复 3 次。数据以平均数标准差表示，采用 SPSS11.0 软件进行单因素方差分析，差异显著表示为 P0.05，差异极显著表示为 P0.01。2 结果与分析 2.1 不同浓度 TGF-1对乳腺上皮细胞增殖的影响 本试验采用 MTT 法检测细胞总数（图 1）。结果表明：添加 1、5、10 ngml-1 TGF-1，乳腺细胞活性均低于对照组，其中 10 ngml-1TGF-1组与对照组差异显著（P0.05）。说明 TGF-1抑制乳腺上皮细胞的增殖，并随浓度的增加其抑制作用加大，呈现剂量依赖性。2.2 TGF-1对乳腺上皮细胞凋亡的影响 使用 AnnexinV-PI 凋亡试剂盒定量检测凋亡细胞的数量。AnnexinV 和 PI 的双重染色将细胞分为 3 类：活细胞（AnnexinV、PI 均为阴性染色）、凋亡细胞 数据为平均值标准差 The results represent MeanSD,n=3 图 1 不同浓度 TGF-1对乳腺上皮细胞增殖的影响 Fig.1 Effect of different concentrations of TGF-1 on mammary epithelial cell proliferation in vitro （AnnexinV 阳性染色，PI 阴性染色）和晚期凋亡/坏死的细胞（AnnexinV、PI 均为阳性）。如图 2 所示。随 TGF-1作用时间的延长，上皮细胞凋亡比例逐渐增加，6 h 达到高峰，而后下降，6、12 和 24 h 均极显著高于对照组（P0.01）。晚期凋亡/坏死率的变化趋势与凋亡稍有不同，呈直线上升趋势，6、12 和 24 h均极显著高于对照组（P0.01）。统计结果显示，晚期凋亡/坏死的细胞是 TGF-1诱导乳腺细胞死亡的主要方式，早期凋亡相对较弱。2.3 TGF-1对乳腺上皮细胞培养液中 LDH 活力的影响 结果见图 3。随着 TGF-1作用时间的延长，LDH活力升高，12 和 24 h 与对照组差异极显著（P0.01）。2.4 TGF-1对乳腺上皮细胞 DNA 完整性的影响 如图 4 所示，乳腺上皮细胞 DNA 随 TGF-1作用时间的延长发生不同程度降解，6、12和24 h细胞DNA降解明显，均出现了 100 bp 左右的断裂条带。2.5 TGF-1对乳腺上皮细胞内 HSP70 蛋白表达的影响 如图 5 所示，TGF-1作用 26 h 细胞大量表达HSP70，净灰度值在 6 h 达到表达高峰，约为对照组的 4.4 倍，212 h 的表达量均极显著高于对照组（P0.01）。3 讨论 转化生长因子-是一组蛋白超家族，由 TGF-、骨形成蛋白（BMPs）、生长分化因子（GDFS）、活化素、抑制素、缪勒氏管抑制物质（MIS）等构成11，具有广泛的生物学活性，参与早期胚胎发育、软骨和 3252 中 国 农 业 科 学 41 卷 A：AnnexinV/PI 双染法检测 TGF-1（10 ngml-1）作用于乳腺上皮细胞不同时间（024 h）,乳腺细胞的凋亡率，FITC 标记的 AnnexinV 和 PI 染色将细胞分为四个象限，活细胞（FITC-，PI-）、早期凋亡细胞（FITC+，PI-）、晚期凋亡细胞/坏死细胞（FITC+，PI+）；B：细胞死亡率统计柱形图，数据表示为平均值标准差，*表示 P0.01 A:Cells were treated with TGF-1(10 ngml-1)for 0-24 h,With FITC-labeled annexin V and PI,it was possible to distinguish between intact cells(FITC-,PI-),early apoptotic(FITC+,PI-),and late apoptotic/necrotic cells(FITC+,PI+);B:The data are MeansSD,*P0.01 图 2 TGF-1对奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响 Fig.2 Effects of TGF-1 on apoptosis of dairy cow mammary epithelial cells 数据为平均值标准差 The results represent Mean SD,n=3 图 3 TGF-1对乳腺上皮细胞培养液中 LDH 活力的影响 Fig.3 Effects of TGF-1 on the LDH vigor of dairy cow mammary epithelial cells 骨的形成、胞外基质的合成、炎症、间质纤维化、免疫和内分泌功能的调节、肿瘤的形成和发展12。近年 图 4 TGF-1对乳腺上皮细胞 DNA 完整性的影响 Fig.4 Effects of TGF-1 on the DNA genome of dairy cow mammary epithelial cells 10 期 狄和双等：TGF-1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及 HSP70 蛋白表达的影响 3253 数据为平均值标准差 The results represent Mean SD,n=3 图 5 TGF-1对乳腺上皮细胞内 HSP70 蛋白表达的影响 Fig.5 Effects of TGF-1 on the HSP70 expression of dairy cow mammary epithelial cells 来研究发现，人初乳中 TGF-1浓度的高低决定了母亲的哺乳成败和哺乳持续时间的长短13，可见 TGF-1与乳腺的发育、分化及泌乳功能密切相关。本试验结果显示，添加 1、5、10 ngml-1TGF-1均能抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖，随浓度增加抑制作用加大，并呈现剂量依赖性。采用 AnnexinV-PI 双染法检测凋亡的结果显示，随 TGF-1作用时间的延长，早期凋亡细胞呈现先升高而后下降的趋势，而晚期凋亡/坏死细胞呈逐渐升高趋势，与 Ghjewska14及Bailey 等15报道相似，表明 TGF-1可诱导乳腺上皮细胞发生凋亡，同时也表明乳腺退化期过度表达 TGF-1是奶牛乳腺退化期乳腺细胞发生凋亡的原因之一。证明 TGF-1是啮齿动物和反刍动物乳腺退化期的重要调节因子。乳腺上皮细胞胞浆内含有 LDH（乳酸脱氢酶），其活性升高通常做为乳腺损伤程度的一个重要指标。在正常情况下，细胞内酶因细胞膜的屏障作用不易逸出，但当细胞受损时细胞膜通透性加大，酶就会释放出来，活性明显升高16。TGF-1对乳腺上皮细胞释放LDH 的影响未见相关报道。本试验结果显示，细胞培养上清液 LDH 酶活性随 TGF-1作用时间的延长呈现递增趋势，说明 TGF-1作用细胞一定时间后，可能影响了乳腺上皮细胞的膜完整性，导致膜通透性增加，胞浆内 LDH 酶释放出来。AnnexinV-PI 双染法检测细胞凋亡，可以反映出细胞膜磷脂层的不对称性受到破坏的程度。凋亡细胞膜在早期是完整的，而坏死细胞膜的完整性在早期就被破坏17。本试验利用流式细胞仪测定细胞凋亡的结果表明，TGF-1破坏了上皮细胞的膜完整性，导致细胞发生凋亡。LDH 酶活的升高与细胞凋亡的结果相吻合，因此细胞释放的 LDH 酶活有可能成为细胞膜完整性的一个新的检测指标。TGF-1是否加速了膜的流动，是否使膜上的离子或分子通道发生了改变，从而增加了膜通透性有待进一步研究。TGF-1作用于小鼠和猪的乳腺上皮细胞，Bax/Bcl-2比例升高，促进线粒体释放促凋亡因子AIF、细胞色素 C、活性氧及 Ca2+，进而活化凋亡执行者Caspases，后者降解其底物 PARP，导致 DNA 断裂，从而引发细胞凋亡1,18,19，本试验结果显示，TGF-1使奶牛乳腺上皮细胞 DNA 发生了不同程度的降解，具有时间依赖性。TGF-1可能首先与上皮细胞膜上受体结合，引发细胞内一系列的级联反应，细胞内 LDH释放，破坏了 DNA 完整性，最终导致细胞凋亡。研究发现，TGF-1促进母牛乳腺间质的发育20，本研究结果表明奶牛乳腺退化期过度表达 TGF-1是退化期乳腺组织出现 DNA 断裂特征21的重要原因，即过度表达 TGF-1可能主要选择性的诱导了上皮细胞 DNA发生断裂及凋亡。应激刺激、损伤因素可诱导生物细胞产生一组高度保守的蛋白质，即热休克蛋白（HSPs）。HSP 作为分子伴侣维持细胞蛋白的稳定性，提高细胞对应激原的耐受性，维持细胞正常的生理功能，促进细胞生 存22。目前，国内外关于 TGF-1对细胞内 HSP70 的影响未见报道。本试验结果表明，TGF-1诱导 HSP70高水平表达，2 h 的表达量约是对照组的 3 倍，6 h 达到高峰，约是对照组的 4.4 倍。结合细胞活性结果说明，TGF-1作用于乳腺上皮细胞前 6 h 的细胞的活性高于后 6 h，说明细胞在 TGF-1刺激后产生自我修复3254 中 国 农 业 科 学 41 卷 的能力，这可能与 HSP70 在 6 h 前保持高水平表达有一定的相关性。HSP70 的过度表达可能抑制了细胞凋亡通路中的某些环节，但当应激较强时 HSP70 的表达受到一定限制，使得细胞自我保护功能失效，发生凋亡或死亡。本试验室前期研究发现，奶牛乳腺上皮细胞受高温热刺激 36 h 内引发 HSP70 蛋白的过度表达23，双氧水、氨茶碱等应激也引发 HeLa 细胞 HSP70的表达增加24，细胞在适度应激预处理下产生HSP70，可保护细胞应对更严重的应激25。关于TGF-1在诱导乳腺上皮细胞凋亡过程中，通过何种通路影响 HSP70 的表达变化及 HSP70 如何影响凋亡通路来调节细胞的应激反应，需要进一步研究探讨。4 结论 TGF-1抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖，升高细胞内 LDH 的释放，使得上皮细胞 DNA 裂解，从而引发凋亡。TGF-1作用初期，HSP70 过度表达发挥了一定的自我保护。证明奶牛乳腺退化期的细胞凋亡与过度表达 TGF-1有关，说明 TGF-1可促进上皮细胞凋亡，从而促进奶牛乳腺发生退化。References 1 Motyl T,Gajkowska B,Wojewodzka U,Wareski 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