外成骨诱导培养与成骨细胞活性鉴定.doc

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究
张开刚1 张月东1 王玫2
（1.泰安市中心医院骨科，山东泰安271000 2.泰山医学院，山东泰安 271016）
【摘要】目的 体外分离培养兔脂肪干细胞，在成骨诱导条件下，鉴定其成骨活性。方法 取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞, 将第3代ADSCs消化后，加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Von Kossa（钙结节）染色鉴定分化结果.结果 体外分离培养的细胞增殖活跃，成骨诱导后检测碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Von Kossa（钙结节）染色均呈阳性表达。结论 脂肪干细胞具有成骨分化能力, 是一种理想的骨组织工程种子细胞。
【关键词】脂肪干细胞；成骨诱导；种子细胞
An experimental study of osteogenic culture in vitro and identificating the osteogenic activity of rabbit adipose-derived stem cells
ZHANG Kaigang1, ZHANG Yuedong1, Wang Mei2
（1.Department of Orthopedic Surgery,Taian Center Hospital,Shandong Taian, 271000 2. Taishan Medical College，Shandong Taian 271016）
【Abstract】Objective Separating and Culturing rabbit adipose-derived stem cells，
identificating the osteogenic activity in osteogenic conditions.Methods Extracting inguinal fat of New Zealand white rabbits aged 4 months, Using I collagenase digestiong, separating, culturing and passaging of the original cells, adding osteogenic medium to induce osteogenic differentiation after digesting the 3rd generation ADSCs, then identificating the differentiation results by alkaline phosphatase staining、alizarin red staining、Von Kossa (calcium nodules) staining.Results The cells of Separating and Culturing in vitro were active, the alkaline phosphatase staining、alizarin red staining and Von Kossa (calcium nodules) staining were both positive expression after osteogenic.Conclusion Adipose derived stem cells have the ability of Osteogenic differentiation,they are an ideal seed cells for bone tissue engineering.
【Keywords】Adipose-Derived Stem Cells; Osteogenic; Seed Cells
An Experimental study of Adipose stem cells cultured in vitro osteogenic and osteogenic activity identification
ZHANG Kaigang1, ZHANG Yuedong1, Wang Mei2
（1.Department of Orthopedic Surgery,Taian Center Hospital,Shandong Taian, 271000 2. Taishan Medical College，Shandong Taian 271016）
【Abstract】Objective Isolation and Culture of adipose stem cells in osteogenic conditions to identify osteogenic activity. Methods Extracting inguinal fat of New Zealand white rabbits aged 4 months, Using I collagenase digestion, separation, culture and passage of the original cells, the 3rd generation ADSCs after digestion, by adding osteogenic medium to induce osteogenic differentiation, alkaline phosphatase staining were performed, alizarin red staining, Von Kossa (calcium nodules) staining differentiation results. Results Proliferation of isolated and cultured cells cultured in vitro Active is active, Detection of bone alkaline phosphatase staining after induction, alizarin red staining, Von Kossa (calcium nodules) were both positive for expression. Conclusion Adipose derived stem cells have the ability to differentiate into bone, it is an ideal seed cells for bone tissue engineering.
【Keywords】 Adipose-Derived Stem Cells; Osteogenic; Seed Cells
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来发现的一种成体干细胞，2001年，Zuk〔1〕等首次从人的脂肪组织悬液中分离出了具有与骨髓间充质干细胞类似，可以在体外稳定增殖、具有多向分化潜能的脂肪干细胞。因具有来源丰富、取材方便、对机体的损伤小、增殖快、能多向分化等优点,迅速成为组织工程学、再生医学等领域的研究热点。本实验通过分离培养兔脂肪干细胞，研究其成骨分化能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。
1．材料和方法
1.1材料
1.1.1 主要试剂和仪器
I型胶原酶（sigma 美国）；胰蛋白酶（sigma 美国）；地塞米松（sigma 美国）)；维生素C（sigma 美国）；β－甘油磷酸钠（sigma 美国）；高糖DMEM （GibcoGibeo 美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司杭州四季青生物工程材料有限公司）；碱性磷酸酶染色试剂盒（华美生物工程公司）；四环素（华美生物工程公司）；茜素红 （Amersco 美国）；EDTA（华美生物工程公司）；恒温CO2培养箱（Queue Systems Company 美国）；病理切片机（leica 德国）。
1.1.2 实验动物
4月龄健康新西兰大白兔（体重2.0－2.5kg，雌雄不拘，泰山医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:SCXK(鲁)2005一0005)
4月龄健康新西兰大白兔，体重2.0－2.5kg，雌雄不限。
1.2 方法
1.2.1 ADSCs的分离、培养及传代
4月龄健康新西兰大白兔，经耳缘静脉注射空气栓塞致死，取兔双侧腹股沟脂肪， PBS液冲洗剪碎，用I型胶原酶法进行消化，加入高糖DMEM培养液重悬浮，放入恒温CO2培养箱内培养，隔日换液，融合达90一95%后，倾倒原培养液，用PBS液轻缓漂洗贴壁细胞2次，尽量洗去残余血清，弃PBS液。在培养瓶中加入适量消化液(0.20%胰蛋白酶+0.02%EDTA)进行消化，吸管吸取培养液，反复轻柔吹打培养瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶壁，吹打液1200 r/min离心10 min，弃上清。用培养液将沉积的细胞重新悬浮，接种于25cm2培养瓶中，传代比例为1：2，倒置相差显微镜下观察细胞形态特征及传代情况。
1.2.2 脂肪干细胞的成骨诱导培养
成骨诱导培养液的配制：DMEM培养液+ 10%胎牛血清+0.lumo1/L地塞米松+50mg/L维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+1%双抗 PH7.2－7.4，参照Zuk〔2〕等文献所述方法。
普通培养液：高糖DMEM培养液+10%胎牛血清+1%双抗（青霉素、链霉素）
取第3代ADSCs，以lx105/cm密度接种于24块盖玻片，置于37℃、体积分数为5 %的CO2饱和湿度培养箱内培养。待细胞长满后，其中12片作为成骨诱导组，加入成骨诱导液复合培养，行成骨诱导分化。12块作为对照组，加入普通培养液培养，共4周，每72 h换液1次。
待细胞长满后，其中12片作为成骨诱导组，改用成骨诱导培养基诱导分化，12块作为对照组，使用普通培养基培养，共4周，每72 h换液1次。
1.2.2.1碱性磷酸酶（ALP）染色
在培养皿底部预置盖玻片，接种第三代细胞，以成骨诱导液培养，于37℃ 、5%ＣＯ2饱和湿度细胞培养箱内培养。1周后取出盖玻片，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤3次，滴加碱性磷酸酶染色液，蒸馏水反复冲洗3遍，晾干后，甘油明胶封片，镜检。
1.2.2.2 茜素红染色
在培养皿底部预置盖玻片，接种第三代细胞，以成骨诱导液培养，于37℃ 、5%ＣＯ2饱和湿度细胞培养箱内培养。4周后取出盖玻片，洗涤3次，4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤3次，加入1%茜素红溶液(PH值为8.3，Tris一Hcl配制)，37℃染色30分钟，蒸馏水反复冲洗3遍，晾干后，甘油明胶封片，镜检
1.2.2.3 Von Kossa（钙结节）染色
在培养皿底部预置盖玻片，接种第三代细胞，以成骨诱导液培养，于37℃ 、5%ＣＯ2饱和湿度细胞培养箱内培养。4周后取出盖玻片，洗涤3次，4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤3次，加入5%硝酸银溶液，避光孵育30分钟，紫外灯下染色1小时，蒸馏水冲洗3遍，加入5%硫代硫酸钠作用5分钟，蒸馏水冲洗3遍，1%中性红复染5分钟，蒸馏水反复冲洗3遍，晾干后，甘油明胶封片，镜检。
2．结果
2.1 ADSCs体外培养的生物学特性
原代脂肪干细胞8小时开始贴壁，24小时完成贴壁，接种后可见部分悬浮呈圆形的血细胞混杂其中，轮廓清晰，细胞呈短梭形和多角形(图l)，5一7天融合达90-95%，约两周内可传代到第三代，细胞数量可扩增200-300倍，绝大多数细胞呈扁平的长梭形，局部排列有一定方向性，呈鱼群状（图2)。
2.2 ADSCs体外成骨诱导及鉴定
2.2.1 碱性磷酸酶（ALP）染色：培养第3代的ADSCs细胞，成骨诱导1 周后，行ALP染色,ALP检测胞浆内可见蓝色颗粒（图3），而对照组无明显ALP表达（图4）。
2.2.2 茜素红染色: 培养第3代的ADSCs细胞，成骨诱导4周后，行茜素红染色。细胞结节中央染色为红色团块，细胞结构为紫红色（图5)，对照仅见紫色细胞结构，结节中央未见红色团块染色(图6);
2.2.3 Von Kossa（钙结节）染色：培养第3代的ADSCs细胞，成骨诱导4 周后，进行Von Kossa染色。细胞集落中央区形成明显的钙化结节，细胞结节中央为黑色团块（图7），对照组无黑色团块（图8）。
3.讨论
当前研究的骨组织工程种子细胞主要有以下几个来源:骨膜成骨细胞、骨髓间充质干细胞和骨外组织如成纤维细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞。干细胞是结构和功能未特化的原始细胞，它的自我更新与分化能力强，已经成为构建组织工程骨重要的种子细胞来源，日益成为组织工程首选的种子细胞。干细胞根据来源不同，可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和成体干细胞（adult stem cell，ASC）。成体干细胞存在于人体各种组织中，具有自我更新和分化成多种组织的能力，如向骨、软骨、脂肪、神经组织的分化，正常生理情况下干细胞多处于G0期或缓慢向G1期转化〔3〕。在研究领域，人和动物的许多不同部位来源的成体干细胞已经得到分离和鉴定〔4-6〕。其中骨髓间充质干细胞(BMSCs)是近年来主要的研究对象，但人体骨髓总量有限，BMSCs所占比例低，并且随着年龄增长，BMSC所占的比例逐渐下降，故获取的干细胞数量少,因而限制了BMSCs的广泛应用。脂肪干细胞（ADSCs）是近年来发现的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞类似，可以在体外稳定增殖、具有多向分化潜能〕，因其具有安全性高 〔7〕 、获得率高等优点,迅速成为目前组织工程学的研究热点。
国内外相关报道指出，脂肪干细胞的体外分离及培养所应用的消化酶、消化方法并不完全相同，由于成熟脂肪基质中含有大量I型胶原，目前分离本实验分离ADSCs一般采用I型胶原酶消化法，用培养基重悬细胞后，接种到培养瓶中，通过细胞贴壁而得到ADSCs。文献指出，ADSCs接种12~24h后细胞可达到完全贴壁，细胞形态为圆形、短梭形和多角形，经传代培养后，增殖迅速，平均倍增时间为60小时，衰老缓慢，能稳定传代10代左右，说明脂肪干细胞的生物学特征稳定，可为组织修复提供充足的种子细胞〔8〕。有研究推测，脂肪组织中含有成骨分化潜能细胞〔9〕，ADSCs成骨培养后，细胞外基质中出现成骨基因表达产物，如Ⅰ型胶原蛋白、BMP-2、 BMP受体等〔10〕，具有成骨细胞分化潜能。
关于脂肪干细胞的鉴定，目前还没有发现ADSCs特异性表面分子标志物。本实验通过观察细胞的形态、绘制生长曲线，得到此细胞具有稳定、迅速的增殖能力，符合干细胞的特点。而且在脂肪干细胞分离、纯化过程中，一些混杂细胞，如红细胞、内皮细胞、成纤维细胞等，很难一次彻底清除，但其所含数量很少，约占细胞群的5%～20%，这些细胞大部分不能贴壁生长，其增殖能力有限，随传代培养，其数量逐渐减少。在传代培养过程中，用消化液消化原代脂肪干细胞，关于消化程度，本实验选择在倒置相差显微镜下观察判断：一般以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为度。这时应立即吸出消化液，加入含有血清的培养液，终止消化，以保证消化的纯度。
本实验本研究通过反复3次试验证实，在成骨诱导培养下,1周时通过ALP检测胞浆内可见蓝色颗粒；4周时检测茜素红染色，细胞结节中央染色为红色团块，细胞结构为紫红色；4周时钙结节染色，细胞集落中央区形成明显的钙化结节，检测到大量钙盐沉积。钙结节染色原理是将矿化基质中硫酸钙、碳酸钙转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银，染色阳性表明细胞已进入基质矿化期，而对照组培养的细胞无钙化结节形成。本实验成功分离培养及传代脂肪干细胞，经成骨诱导可向成骨细胞转化，为脂肪干细胞作为骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据，为将其应用于组织工程，实现多种组织损伤的修复提供了理论依据。
附图：

图1 原代ADSCs呈短梭形 图2 第3代ADSCs呈扁平长梭形，形成鱼群状
原代ADSCs呈短梭形 （×100） （×100） 第3代ADSCs呈扁平长梭形，形成鱼群状

图3 ALP检测胞浆内可见蓝色颗粒 图4 对照组无明显ALP表达
ALP检测胞浆内可见蓝色颗粒 （×200） （×200） 对照组无明显ALP表达

图5 细胞结节中央染色为红色团块 图6 对照组细胞结节中央未见红色团块
（×40） （×40）细胞结节中央染色为红色团块 对照组细胞结节中央未见红色团块

图7 细胞结节中央为黑色团块 图8 对照组细胞结节中央无黑色团块
细胞结节中央为黑色团块（×40） （×40） 对照组细胞结节中央无黑色团块
参考文献
[1]. Zuk PA，ZhuM ，MizunoH, et al.Multilineage cells from hu-man adipose tissue:implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng,2001,7:211-228.
[2] .Zuk PA，ZhuM， Ashjian P， Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]. MolBiolCel，l 2002， 13: 4279~4295
[3] YannakiE.Thepapayannopoulou.Stem cells have an identity crisis. Haema. 2001; 4:158-166.
[4] Morasso MI,Tomic-Canic M.Epidermal stem cells:the cradle ofepidermal determination,differentiation and wound healing.Biol Cell.2005;97:173-183.
[5] Berninger B,Hack MA,Gotz M.Neural stem cells:on where they hide,in which disguise,and how we may lure them out.Handb Exp Pharmacol. 2006;(174):319-60.
[6]Trounson A.A fluid means of stem cell generation.Nat Biotechnol.2007;25(1):62-3.
[7] Housman TS， Lawrence N， Mellen BG，et al.The safety of liposu-tion: results of a national survey[J]. DermatolSurg， 2002， 28: 971~978
[8].张胜利，邓展生，等.大鼠脂肪间充质干细胞的成骨分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(6):1022-1024。
[9].Kaplan FS，Hahn GV，Zasloff MA.Heterotopic ossification:two rare forms and what they can teach us[J].Am Acad Orthop Surg，1994，2:288-296.
[10] Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Sci，1999，284(5411):143-147.