自发性癫痫大鼠脑内海马Ⅲ型电压门控性钠通道N亚型表达上调.pdf

第1卷 第4期 2006 年 11 月 291中国科技论文在线 SCIENCEPAPER ONLINE 自发性癫痫大鼠脑内海马 型电压门控性钠通道 N 亚型表达上调 于 娜，郭 凤，杜 娃，姚维凡，蔡际群（中国医科大学，药学院药物毒理学教研室，沈阳 110001）摘 要：目的目的 对照研究自发性癫痫大鼠（SER）和正常Wistar大鼠（WTC）脑内、型钠通道亚基mRNAs与蛋白表达情况。方法方法 提取枕叶皮质、齿状回及海马CA1 和CA3 区组织总RNA，应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及建立限制性内切酶图谱检测、A、N、A 和N 的表达，应用免疫荧光定位与表达3亚基N蛋白。结果结果 SER枕叶皮质、齿状回及海马CA1 和CA3 区总钠通道的表达略高于WTC，但均无显著差异（P0.05），SER型钠通道在海马的表达高于WTC（P0.01），酶切图谱显示N 型钠通道表达水平有明显上调。结论结论 SER脑内海马型电压门控性钠通道N亚型表达上调。关键词：钠通道；mRNA；RT-PCR；限制性内切图谱检测；自发性癫痫大鼠 中图分类号：R96 文献标识码：A 文章编号：16737180(2006)0402915 自发性癫痫大鼠（spontaneously epileptic rat，SER）为双基因突变大鼠，由tremor（tm）1大鼠杂合子（tm/+）和zitter（zi）2大鼠纯合子（zi/zi）交配得到3。生后 8 周，SER出现自发性的癫痫大发作和小发作，其对于抗癫痫药物的反应同癫痫患者类似4，是研究遗传性癫痫的理想动物模型。大鼠脑内存在着几种不同的钠通道亚基cDNAs，由至少 5 种不同的基因编码：NaCh、NaCh、NaCh、NaCh-G和NaCh 65,6。其中NaCh、NaCh基因还存在 2 种亚型，称为A（成熟型）和N（新生儿型）7。由于神经元兴奋性形成过程中电压依赖性钠通道起着重要作用，而且是一些抗癫痫药物作用的主要位点，因此我们采用RT-PCR及建立限制性内切酶图谱方法和免疫荧光技术研究SER和WTC脑内皮质、齿状回及海马CA1 和CA3 区、和型钠通道及其亚型mRNA和蛋白的表达情况，为寻找与钠通道有关的癫痫相关基因及癫痫的基因治疗提供理论依据。1 材料和方法 1.1 实验动物 SER 和 WTC 各 5 只，体重 150 克左右，雌雄不限，均由中国医科大学实验动物部提供。1.2 标本及总 RNA 制备 大鼠在麻醉状态下断头，迅速取脑，液氮速冻，用冰冻切片机切成厚度达 400m 的冠状切片。在双目显微镜下从脑切片的四个不同部位进行针孔取样（直径为 1.4mm）：大脑枕部皮质、齿状回及海马CA1 和 CA3 椎体细胞层。将标本置于-80备用。用 TRIzol（GIBCO BRL）提取总 RNA（按厂家说明操作），电泳检测完整性，测定浓度后-70保存。1.3 逆转录 第一链cDNA按RT-PCR试剂盒（大连宝生物）说明书，用Oligo(dT)15-18引物合成。反应条件：42 30min、99 5min，逆转录产物 4保存。除RNA样本外加所有试剂的反应管作为空白对照，以等量的DEPC水代替RNA样本。1.4 聚合酶链反应（PCR）PCR 1，以-actin（上游 5-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3，下游 5-CAT CTC TTG GTC GAA GTC CA-3）为内参照(308bp)，靠近大鼠脑钠通道序列的 5端 626 个碱基的片段用一组引物进行扩增，该组引物对大鼠 5 个序列（、A和 N、A和 N）均完全符合。引物序列为：引物 1 5-CAT TCC TCC AGA GAT GGT GTC-3，引物 2 5-TAT TCC TCA GGT TGC CCA TGA A-3。为了提高退火的特异性，退火温度采取渐降方式（touch-down 第1卷 第4期 2006 年 11 月 292自发性癫痫大鼠脑内海马型电压门控性钠通道 N 亚型表达上调 PCR），在 16 个循环过程中从 6860每个循环降低0.5，最后 14 个循环退火温度维持在 60。PCR 2，除不加入-actin 引物外，其余条件与PCR 1 相同。PCR3，以GAPDH（上游 5-AAT GCA TCC TGC ACC ACC AA-3，下游 5-GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA-3）为内参照（515bp），另设计一组引物专门分析型钠通道mRNA的表达，分别为：引物 3 5-AAG TCG GAA TCG GAA GAC AGT GT-3，引物4 5-AGG ATA CTG GCT ATG CTC ATG GATC-3（415bp）。30 个循环的退火温度恒定于 58。PCR 4，特异性用于区分型钠通道的两种亚型（引物 5 5-TGG AAC TGG CTG GAT TTC AG-3，引物 6 5-GAA GTA GGA AGT AGT GTT GG-3），除不加入 GAPDH 引物外，其余条件与 PCR 3 相同。所有引物均为上海生工生物工程公司合成。1.5 PCR 产物电泳及定量分析 1.5.1 电泳分析 取 PCR 1 和 3 产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析。1.5.2 限制性内切酶分析 由 上 海 生 工 购 得 限 制 性 内 切 酶 Msp、BamH、Dra、Sfu、Nde及 Sst。加限制酶1l 及 2l 相应的 10缓冲液与 57l PCR 2 和 4 产物混合，依说明书于 37温育 1 小时（总体积为10l），进行电泳、紫外分析。PCR 2 后，亚型使用 Msp消化，亚型 A使用 BamH消化，亚型 N 使用 Sfu消化，亚型（A+N）使用 Dra消化。PCR4 后，亚型使用 Dra、A使用 Nde消化，而N 使用 Sst消化。RT-PCR及限制性内切酶酶切电泳结果均经The FluorChemTM Imaging System图像分析仪测定各点累积光密度值（integrated density，ID）。1.6 免疫荧光定位型钠通道 亚基蛋白 SER大鼠癫痫大发作后在麻醉状态下灌流固定大鼠，生理盐水 10 分钟 后 4%多聚甲醛固定 15 分钟。快速取出鼠脑 4%多聚甲醛进行后固定 4 小时，蔗糖梯度过夜。OCT包埋后，用冰冻切片机（CM1800LEICA冰冻切片机，德国）切 8m厚的切片。冷丙酮固定 10 分钟后，PBS漂洗，5 分钟 3 次。用山羊非免疫正常血清封闭非特异性结合位点,37半小时。加入3(N,1:25)兔多克隆抗体（sigma公司）4过夜，PBS洗涤切片 5 分钟 3 次，阴性对照用PBS缓冲液代替一抗。用FITC标记的羊抗兔二抗孵育切片,371 小时，PBS漂洗 5 分钟 3 次后用Hochest32228 做核复染，用PBS漂洗 5 分钟 3 次。甘油-PBS缓冲液封片后荧光显微镜观察。1.7 统计学分析 各组结果以均数标准差（xs）表示，两组间比较用 t 检验，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果 2.1 SER 与 WTC 皮质、齿状回及海马 CA1 和 CA3区总钠通道表达情况 如图 1 所示，经 PCR1 扩增，SER 与 WTC 均有钠通道表达。M：为标记物；1、2、3、4 分别为 SER 的皮质、齿状回及海马 CA1 和 CA3 区；5、6、7、8 分别为 WTC 的皮质、齿状回及海马 CA1 和 CA3 区；626bp 处为钠通道；308bp处为-actin 图 1 RT-PCR 检测钠通道在 SER 与 WTC 脑内皮质、齿状回及海马 CA1 和 CA3 区的表达 由图 2 可以看出，SER 脑内皮质、齿状回及海马 CA1 区和 CA3 区钠通道表达高于 WTC，但是无统计学意义（P 值分别为 0.36，0.24，0.41 和 0.94）。0123456皮质齿状回海马CA1区海马CA3区SERWTC 灰度值比值 注：纵坐标为钠通道与内参-actin 灰度值比值 图 2 SER 与 WTC 皮质、齿状回及海马 CA1 和 CA3 区总钠通道含量比较 2.2 SER 与 WTC 脑内四个区域、A、N和型钠通道表达的相对含量 PCR 2 后用 MSP、BamH、Dra及 Sfu第1卷 第4期 2006 年 11 月 293中国科技论文在线 SCIENCEPAPER ONLINE 对四个区样本扩增产物（626bp）进行酶切分析，酶切产物的预期片段大小（bp）如表 1 所示。图 3 为SER 脑内 PCR 2 产物的酶切图谱。表 1 PCR 2 扩增产物酶切预期片段大小 大鼠脑内 钠通道分型 Msp BamH Dra Sfu 100+526 无 无 无 A 无 361+265 无 无 N 无 无 无 445+181 无 无 498+128无 M：为标记物；1：PCR2 产物经 Msp酶切；2：PCR2产物经 BamH酶切；3：PCR2 产物经 Dra酶切；4：PCR2 产物经 Sfu酶切；5：PCR2 产物未经酶切 图 3 SER 脑内 PCR 2 产物的酶切产物电泳图 表2列出了SER与WTC脑内四个区域、A、N和型钠通道表达的相对含量。表中将每条带中钠通道（+A+N+）的总和设为 100%，其余数据由酶切产物形成的亚型表达量与其相比较得到。SER 与 WTC 相比、A、N及型钠通道表达情况相似（P0.05）。表 2 SER 与 WTC 脑内四个区域、A、N和型钠通道表达的相对含量(xs)皮质 齿状回 海马 CA1 海马 CA3WTC 100%100%100%100%40.03.1 22.92.821.01.6 21.43.0 A 49.20.8 61.33.356.27.1 57.11.8 N 4.84.4 2.30.7 4.20.1 4.40.9 5.72.4 13.56.418.65.8 17.15.1 SER 100%100%100%100%39.07.0 21.21.922.14.4 19.34.8 A 50.25.3 60.80.351.41.3 58.46.9 N 4.00.5 1.27.2 3.95.1 3.50.8 6.83.1 16.87.722.64.8 18.83.4 2.3 SER 与 WTC 海马型钠通道的表达情况 虽然 SER 与 WTC、A、N和型钠通道表达的相对含量并无差别，但是表 2 中 SER型钠通道的相对含量普遍高于 WTC，并不能排除此型钠通道在两鼠间的表达存在差异，PCR3 用型钠通道特异性引物进一步检测其在 SER 和 WTC 海马中的表达（图 4），结果显示 SER 脑内海马型钠通道的表达高于 WTC（P0.01）。00.20.40.60.811.21.41.6海马SERWTC 灰度值比值 A B A 中：M 为标记物；1、2 为 SER；3、4 为 WTC；415bp处为型钠通道；515bp 处为 GAPDH B中：纵坐标为型钠通道与内参GAPDH灰度值比值；P0.01 图 4 RT-PCR 检测型钠通道在 SER 与 WTC 脑内 海马的表达 2.4 SER 与 WTC 海马型钠通道A和N的表达情况 型钠通道还包括两种亚型（A和N），为了了解 SER型钠通道表达增高与哪种亚型有关，我们利用引物 5 和 6 进行 PCR 4 方案，该序列的 3端对应型钠通道基因序列，PCR4 产物的预期片段大小为 317bp，用 Dra消化后出现一个近乎完全的PCR 产物的酶切产物，说明该 PCR 产物的大部分都是由型钠通道构成的，因为在扩增区域内、A和N的 cDNAs 都不含有 Dra的切割位点。PCR4扩增的特异性使我们能够利用限制性内切酶 Sst和 Nde来分辨 PCR 4 产物中N和A的成份（图5）。正常大鼠N型钠通道在出生后几乎不表达，而 SER 脑内N型钠通道 mRNA 却异常高表达（图6）。自发性癫痫大鼠脑内海马型电压门控性钠通 第1卷 第4期 2006 年 11 月 294 图 5 型钠通道特异性扩增产物限制性内切酶 分析模式图 1：PCR4 产物经 Dra酶切；2：PCR4 产物经 Nde酶切；3：PCR4 产物经 Sst酶切；4：PCR4 产物经 Nde 和S st酶切；5：PCR4 产物未经酶切 图 6 SER 大鼠脑内海马 PCR 4 产物酶切产物电泳图 2.5 免疫荧光定位型与型钠通道 亚基蛋白 免疫荧光定位N 型钠通道 亚基蛋白（图 7）,可见N 型在 WTC 胚胎鼠表达较多，成熟的 SER有极少量细胞表达，而成熟的 WTC 无表达。A：WTC 胚胎鼠400；B：成熟的 SER400；C：成熟的WTC400 图 7 免疫荧光定位N 型钠通道 亚基蛋白 3 讨论 选择性剪切体是包括离子通道在内的多种蛋白产生结构和功能多样性的关键机制8。大鼠脑内型钠通道亚基外显子基因通过特有的RNA选择性剪切产生编码在新生儿脑内占主体的N亚型基因和在成熟大鼠脑内占主体的A亚型基因9,10。N 和A 外显子间有 21 个核苷酸不同，这些不同的核苷酸中只有一个是有保守性的，导致N与A亚型之间209 号单个氨基酸被取代。N 型钠通道基因中为丝氨酸，是中性氨基酸，而A 亚型中 209 号氨基酸为带负电的天冬氨酸。209 号氨基酸位于第一同源结构域的细胞外环中，恰好在S4 跨膜片段的前方，S4 跨膜片段是电压感受器的一部分。这种电荷差异可能通过两种差异影响钠通道的功能。第一，细胞外表面负电的差异可能影响有具有通透性的阳离子（如Na+）和没有通透性的阳离子阻断剂（如Ca2+）的进入11。第二，临近电压感受器外表面一个固定的负电荷的加入或缺失可能会影响电压依赖性的门控12,13,14。Alud等人曾研究过A型钠通道中用天冬酰胺取代 209 号天冬氨酸后的影响，他们观察到在通道激活过程中有极小的超极化改变15。正常大鼠N 型钠通道在胚胎期高表达，出生后 10 天便消失，取而代之的是A。而本次实验却发现成熟 SER N 型在脑内有较高的表达，说明其在 mRNA 剪切水平发生了改变，证明这两种外显子的 mRNA 选择性剪切在脑发育过程中没有正确调节。这种异常调节机制可能是由于癫痫发作导致剪切水平发生改变引起的，也可能是由于钠通道本身基因发生改变引起的。综上，我们通过四轮 RT-PCR 以及建立限制性内切酶图谱和免疫荧光技术，发现 SER 脑内海马型电压门控性钠通道 N 亚型表达上调，认为这种上调极有可能引起异常痫波发放导致癫痫发作，为遗传性自发性癫痫大鼠的发病机理奠定理论基础。参考文献 1 Yamada J,Serikawa T,Ishido J,et al.Rats with congenital tremor and curled whiskers and hair J.Exp Anim,1985,34:183188.2 Rhem S,Mehraein P,Anzil AP,et al.A new rat mutant with defective overhairs and spongy degeneration of the central nervous system:Clinical pathologic studies J.Lab Anim Sci,1982,32:7073.3 Serikawa T and Yamada J.Epileptic seizures in rats homozygous for two mutations,zitter and tremor J.J Hered,1986,77:441444.4 Serikawa T,Kogishi K Yamada J,et al.Long-term effects of continual intake of Phenobarbital on the spontaneously epileptic rat J.Epilepsia,1990,31:914.5 Plummer N W,Meisler M H.Evolution and diversity of the mamma1ian sodium channel genes J.Genomics,1999,57:323331.6 Goldin A L.Evolution of voltage-gated Na+channels J.J Exp Biol,2002,205:575584.7 Gustafson T A,Clevinger E 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transcription,and the expression of type,A,N,and A,N sodium channels is respectively determined after restricted digestion of PCR B,C and D products.Type N sodium channel protein expression is detected by immunofluoresence.Results In spontaneously epileptic rats,all types of sodium channel expresse in a higher level than those of control groups in occipital cortex,dentate gyrus,CA1 and CA3 hippocampus without significant difference(P0.05).Relative proportion of sodium channel,and mRNAs in four adult brain areas from control rats and SER have no significant difference(P0.05).But type sodium channel expresses higher than that in control groups in hippocampus,restriction mapping analysis shows that N increases significantly(P0.01).Conclusion The expression of type sodium channel N is up regulated in hippocampus of spontaneously epileptic rat brain.Key words：sodium channels;RNA,messenger;reverse transcriptase polymerase chain reaction;restriction mapping;spontaneously epileptic rat 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