骨疏康颗粒含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响.pdf

速生医约2 Q!Q 生监旦蔓一垫盎璺韭搁垦豇i 她J Q 女堕堂遁T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c L n e 曼i D e _ c e m _ _ b e _!蓼丛堕2 1，丛Q：1 2骨疏康颗粒含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响余兴华【摘要1 目的探讨骨疏康颗粒含药血清对体外堵养大鼠成骨细胞增殖及细胞周期分布的影响。方法采用酶消化法进行大鼠成骨细胞培养，制备骨疏康颗粒含药m 清十预成骨细胞，以生理盐水大鼠血清作对照，运用M 7 兀 法、流式细胞术检测成骨细胞增殖情况及细胞周期分布。结果与同浓度生理盐水血清比较骨疏康含药血清能不同程度地促进体外培养成骨细胞增殖其中以2 0 骨疏康含药皿清促增殖作用最显著，与对照组比较。差异右统计学意义(P 0 0 5)，且能明显降低G O G l 期细胞比例(P O 0 5)，提高S 期成骨细胞比例及增殖指数(P 0 0 5)。结论骨疏康含药血清能加速成骨细胞周期，促进成骨细胞增殖。【关键词】成骨细胞；细胞增殖；细胞周期；骨疏康颗粒；含药血清；实验研究冈各种原因破坏了骨形成与骨吸收之间的平衡，使骨形成低于骨吸收，骨量减少，骨结构破坏，骨强度下降即可导致骨质疏松症的发生。因此促进成骨细胞增殖、增加骨形成是治疗骨质疏松症的主要方法之一。本研究拟利用体外成骨细胞培养，观察中药骨疏康含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响。旨在探讨补肾中药治疗骨质疏松症的作用机制。1 材料与方法1 1 动物用于培养成骨细胞的动物为出生2 4h 内的S D大鼠，购自福建医科大学动物房，合格证号：S Y X K(闽)2 0 0 8 0 0 0 1；用于制备药物血清的动物为3 月龄清洁级雄性S D 大鼠4 0 只体重2 4 0 2 8 0g。购于上海两普尔一必凯实验动物中心合格证号：S C X K(沪)2 0 0 3-0 0 0 2。1 2 药品及试刑骨疏康颗粒：由淫羊藿、熟地黄、黄芪、丹参、骨碎补等组成。辽宁康辰药业有限公司，国药准字Z 2 0 0 0 3 2 5 5；低糖D M E M 培养基、胎牛血清、青，链霉素、0 2 5 胰蛋白酶、型胶原酶：新西兰H y c l o n e公司产品：细胞碱性磷酸酶(C A K P)染色试剂盒：南京建成生物工程研究所；噻唑蓝(M 1 T r)：S i g m a 公司；C y c l e T E S T F MP l u sD N AR e a g e n tK i t：美国B e c t o nD i c k i n s o n 公司。作者单位：3 6 1 0 0 4 厦fJ 人学附属中山医院1 3 仪器二氧化碳恒温培养箱：B B l 6，B B 5 0 6 0 型。德国H e r a u s 公司：A I RT E C H 无菌操作台：苏净集团安泰公司；O l y m p u s 倒置相差显微镜：日本T K O 光学仪器株式会社；酶标仪：E L X 8 0 8 U，美国B i o T e k；F A C S C a l i b u r 流式细胞仪：美国B e c t o nD i c k i n s o n 公司。1 4 骨疏康含药血清制备将3 月龄清洁级雄性S D 大鼠随机分为骨疏康组和对照组，每组2 0 只。骨疏康组按2g k g。d。1给药，以生理盐水溶解灌胃。对照组每天灌服生理盐水2m L d 一。2 组均连续灌胃7 天。于最后一次灌胃后lh 腹主动脉无菌取血，常温下静置6 0r a i n，3 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 后取同组血清混合。5 6 灭活补体3 0m i n。过滤除菌，一2 0 保存备用。干预前用无血清D M E M 培养基稀释成相应浓度的含药血清。1 5 新生大鼠成骨细胞的分离培养1 1新生S D 大鼠放入7 5 酒精中浸泡消毒1 5m i n，无菌操作下取出颅盖骨，去除附着的血管及结缔组织，用H a n k s 溶液清洗3 次，将骨组织剪成lm m la m 碎片用含0 0 2 1 1 型胶原酶和0 2 5 胰蛋白酶的混合消化液预消化2 0m i n。弃去消化液。再加入0 0 2 l l 型胶原酶溶液3 7 条件下将骨片消化3 0m i n。期间反复振摇，重复操作5 次。取最后3 次消化液将收集的消化液以1 0 0 0r m i n 离心5r a i n 所得白色沉淀物即为制得的成骨细胞团，用含1 0 胎牛血清(F B S)的D M E M 培养液亘悬细胞万方数据9 5 4 I t 裒中医药2 0 1 9 年1 2 旦笙2 璺鲞筮1 2 塑旦笪g!u m a lo f T r a d j t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e,D e c e m b e r,2 0 1 0 V 0 1 2 9,N o 1 2至2 x 1 0 s m L 一的细胞悬液，吹打均匀后，移进培养瓶中，在3 7、5 C O：、饱和湿度下培养，次日换液，弃去悬浮细胞以后每隔2 天换液1 次，直至细胞长成融合状态进行细胞传代。1 6 成骨细胞的鉴定方法取第3 代细胞进行实验，检测前进行成骨细胞鉴定。采用倒置相差显微镜每日观察细胞的生长情况及形态特征，重氮盐法(改良K a p l o w 氏法)碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞。1 7 成骨细胞增殖率测定取第3 代细胞用含1 0 F B S 的D M E M 培养液制成2 l0 5 m L 一细胞悬液，以1 0 0 斗L 孑L 接种于9 6孑L 培养板中2 4h 后大部分细胞贴壁。换用无血清D M E M 培养。使细胞同步化。2 4h 后吸弁无血清D M E M 培养液分别加入含不同浓度的骨疏康含药血清和生理盐水血清的培养液1 0 0“U 孔，每一浓度设8 个复孑L 继续培养4 8h。吸弃培养基，每孔加入9 0 肛LP B S 溶液和】0 肛L 0 5 M r r r 溶液，3 7 温育4h。弃除M，r I ，加入1 0 0I L LD M S O，充分振荡1 0m i n。用酶标仪5 7 0n m 检测每孔光吸收值(O D值)，记录结果，比较不同浓度含药血清和乍理盐水血清对细胞增殖的影响。1 8 流式细胞术检测成骨细胞周期分布取第3 代成骨细胞以2 x l 胪m L 一传代接种于培养皿，分为骨疏康组和对照组，分别加入含骨疏康含药血清和生理盐水血清的D M E M 培养基。培养4 8h 后收集细胞检测。按试剂说明书中的实验步骤进行上机前处理。J：流式细胞仪检测，M o d F i t 软件分析D N A 数据读取G 0 G 1 期、S 期、G 2 M 期细胞数，计算细胞增殖指数(P m l i f e r a t i o nI n d e x，P I)。1 9 统计学方法实验数据运用S P S S l 4 O 软件包处理分析，参数值用均值标准差(露蛐)表示，组间数据比较采用O N E W A YA N O V A 单因素方差分析。2 结果2 1 成骨细胞形态学观察倒置相差显微镜卜观察，培养2 4h 大部分细胞贴壁、伸展。细胞形态多样化，多呈多边形、纺锤形、梭形：培养3 天后细胞增殖迅速，细胞胞体膨大，具有数量不等的细长突起，核大，多为圆形或椭圆形，居中或偏于细胞r 一侧；随着培养时间延长，细胞融合成片分界较为模糊。2 2 成骨细胞鉴定体外培养的成骨细胞具有合成碱性磷酸酶(C A K P)的活性改良K a p l o w 氏法碱性磷酸酶染色显示。胞浆内含紫蓝色颗粒。在显微镜F 任选l O 个视野每个视野计数1 0 0 个细胞成骨细胞纯度为9 0 6 4 3 6。2 3 骨疏康含药血清对成骨细胞增殖的影响(见表1)2 4 骨疏康含药血清对成骨细胞周期的影响(见表2)表2 骨疏康含药血清干预4 8 h 对成骨细胞周期的影响(，艇5)组别nG 0 G I 期S 期G 2，M 期增殪指数(P I)对照组2 09 4 1 2 0 4 64 0 8：t-O 3 3I 1 8 0 0 2 65 8 8 0 4 6骨疏康组2 08 8 1 4 0 9 2“6 5 l 0 5 2 5 3 5 0 8 4。I1 8 6 o 9 2”与对照组比较+P 0 0 5，+P 0 0 13 讨论根据骨质疏松症病冈病机与临床症状可以认为其与中医学“骨痿”“虚劳”“骨痹”颇为相似，定性、定位较准确的是骨痿1 2 I。中医学认为肾精充足则骨髓化生有源。骨得到髓的充分滋养而峰同有力；若骨髓化源不足则不能养骨。日久发生骨痿。因此，骨痿者当以补肾治之【3 1。骨疏康以淫羊藿、熟地黄、黄苠、丹参、骨碎补等补肾活血中药组方，其功能补肾益气，活血壮骨，临床和实验研究已证实其能有效防治骨质疏松症M。本实验发现与对照组相比，不同浓度的骨疏康含药裹l 不同浓度骨疏康含药血清干预4 8h 对成骨细胞增殖的影响(i 拯)与对照组比较尸 o O i万方数据些塞巾医煎2 幽Q 堡1 2 旦箜2 曼鲞箍蝗塑鞋i 幽gj 螋啦世垡T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e，D e c e m b e r 2 0 1 0 V 0 1 2 9,N 9 且9 5 5 血清均能明显促进成骨细胞增殖在含药血清浓度达到2 0 时，增殖速度最快，提示目疏康颗粒能通过促进成骨细胞的增殖使成骨细胞数量增加。从而促进骨形成这可能是骨疏康有效防治骨质疏松症的机理之一。细胞中D N A 含量与细胞周期密切相关并随着细胞周期不同时期而发生变化。流式细胞术能通过观察某时间段处于不同细胞周期的细胞百分比，本实验以G 2+M+S 期的百分比作为增殖指数。显示细胞的增殖情况和D N A 合成速度。S 期细胞百分比升高表明细胞的D N A 合成增高细胞增殖加速1 8 1。本实验结果显示，骨疏康含药血清组干预后促使更多成骨细胞进入增殖周期由G O G 1 期进入S期和G 2 M 期，G O G 1 期细胞比例明瞳低于对照组，S 期细胞比例及P l 指数明显高于后者。提示骨疏康颗粒含药血清可以促使更多体外培养成骨细胞迅速进入增殖周期，由G 0 G 1 期向S 期、G 2 M 期推进，推动细胞周期的进程，促进成骨细胞增殖。参考文献1 1】任艳玲，郑洪新，杜松补肾健脾药物m 清对体外培养的成骨细胞增殖与分化的影响巾国中医药信息杂志2 0 0 4，l l(9)：7 7 2 7 7 4【2】刘庆思中西医结合诊治骨质疏松症 M I 北京：中国中医药j f 版丰t，2 0 0 l：7 3【3】唐海涛，唐海，罗先正，等骨疏康对成骨细胞刺激作用的研究【J 1 中嗣骨质疏松杂志，2 0 0 0，6(2)：6 0 6 3【4 l李书琴。裴著果刘英敏，等骨疏康冲剂防治原发性骨质疏松症的临床观察【J 1 巾国中西医结合杂志，2 0 0 1，2 1(4)：2 6 5-2 6 8【5 1卢中道。乇义生骨疏康治疗中重度原发性骨质疏松症的疗效观察【J 1 中国临床康复，2 0 0 4 8(1 8)：3 6 5 2 f 6】云彩麟，苏伊新。陈瑞骨疏康对氢化可的松引起的大鼠骨丢失的影响巾围骨肿瘤骨病，2 0 0 4，3(1)：2 l 一2 2【7 l张保亭骨疏康对去卵巢雌鼠骨质疏松症防治作用的研究中国骨肿瘤骨病，2 0 0 2，l(5)：2 8 3 2 8 6【8】吴丹，丁寅王琪流体剪切力对大鼠成骨细胞增殖及细胞周期的影响【J】临床口腔医学杂志，2 0 0 7 2 3(4)：1 9 7 一1 9 9 作者简介：余兴华，男，4 0 岁，大学本科。副主任药师。研究方向：临床中药学。(收稿I 期：2 0 1 0-1 0-2 3)(上接9 3 5 页)且用药相对安全故2 年均居第3 或第4 名。片剂、丸剂、胶囊剂等剂型使用呈下降趋势。这是因为相对于液体制剂。儿童尤其是婴幼儿，服用不便，特别是有些规格单一、不易分剂量品种，临床使用受到限制。3 2 不同药理作用中成药销售额分析2 0 0 8 2 0 0 9 年北京儿童医院临床用于呼吸系统的中成药销售额稳居第l。消化系统用药位居第2。此外神经系统、皮科、外科、五官科和其他类中成药的销售金额也呈上升趋势。提示中成药在治疗儿科疾病的应用范围在不断扩大。调查显示。因患多动症到北京儿童医院神经内科就诊的人次近年持续递增。此类病症治疗周期长，两药治疗毒副作用大故中成药被列为治疗多动症的手段之3 3 不同品种药物销售额分析2 0 0 8-2 0 0 9 年我院中成药年销售额占全年总额的1 6 一1 8。中成药处方量日均约2 2 0 0 张，说明中成药在儿科疾病治疗中占据一席之地。发挥着重要的、不可替代的作用。高科技的发展以及工业化程度的提高加剧了环境的污染，加之人们饮食习惯的改变。儿童疾病谱正向多元化发展。相对于两药而言。中药在儿童疾病的治疗方面具有明显的优势，应用前景广阔，因此进一步开发和推广临床适合于儿童服用的中成药势在必行。作者简介：张伟。女3 5 岁，大学本科。药师。研究方向：中成药的合理应用。(收稿I j 期：2 0 1 0-0 8-1 6)万方数据骨疏康颗粒含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响骨疏康颗粒含药血清对成骨细胞增殖及细胞周期的影响作者：余兴华，Yu Xinghua作者单位：厦门大学附属中山医院,361004刊名：北京中医药英文刊名：BEIJING JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE年，卷(期)：2010,29(12)被引用次数：2次 参考文献(8条)参考文献(8条)1.任艳玲;郑洪新;杜松 补肾健脾药物血清对体外培养的成骨细胞增殖与分化的影响期刊论文-中国中医药信息杂志 2004(09)2.刘庆思 中西医结合诊治骨质疏松症 20013.唐海涛;唐海;罗先正 骨疏康对成骨细胞刺激作用的研究期刊论文-中国骨质疏松杂志 2000(02)4.李书琴;裴著果;刘英敏 骨疏康冲剂防治原发性骨质疏松症的临床观察期刊论文-中国中西医结合杂志2001(04)5.卢中道;王义生 骨疏康治疗中重度原发性骨质疏松症的疗效观察期刊论文-中国临床康复杂志 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