第七节 分解纤维素的微生物的分离.doc

微生物的培养与应用
课题3　分解纤维素的微生物的分离

主讲：黄冈中学优秀生物教师　王小敏
一、基础知识
（一）纤维素与纤维素酶
1、纤维素
　　纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。
　　植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。其中棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。
2、纤维素酶
　　纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即CX酶、 C1酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

（二）纤维素分解细菌的筛选
分解纤维素的微生物，有各种细菌、真菌和少数放线菌。
1、筛选方法：刚果红染色法。
2、筛选方法的原理：
　　刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
二、实验设计与操作

（一）土壤取样
1、取样环境：选择纤维素丰富的环境。
2、理由：
　　由于生物适应一定的环境，环境对生物有选择作用，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
3、实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。
4、讨论：如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？
　　答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。
（二）选择培养
1、目的：
　　增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物。
2、制备选择培养基：
纤维素粉
5g
NaNO3
1g
Na2HPO4·7H2O
1.2g
KH2PO4
0.9g
MgSO4·7H2O
0.5g
KCl
0.5g
酵母膏
0.5g
水解酵素
0.5g
溶解后，蒸馏水定容至1000mL
　　a．该培养基是液体培养基还是固体培养基？为什么？
　　答：是液体培养基，原因是配方中无凝固剂。
　　b．这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？
　　答：有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。
　　c．你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用。
　　答：用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照。
3、操作方法：
　　称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。
　　思考：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
　　答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
（三）梯度稀释
　　按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106。
（四）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
1、制备鉴别培养基：参照旁栏中的比例
2、涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养
（五）挑选产生透明圈的菌落
　　参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。将挑选的菌种接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30℃－37℃培养，可获得纯培养。
　　两种刚果红染色法的比较：

方法一：
先培养微生物，
再加入刚果红进行颜色反应
方法二：
在倒平板时就加入刚果红
优点
显示出的颜色基本上是纤维素分解菌的作用
操作简便，不存在菌落的混杂问题
缺点
操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂
①由于产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，所以可能产生假阳性反应。
②有些微生物具有降解色素的能力，他们在培养过程中也会形成明显的透明圈，与纤维素的分解菌不易区分。

　　思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
　　答：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题先通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。
四、结果分析与评价
（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落
　　设置对照，若对照的培养基在培养过程中无菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
（二）分离的结果是否一
　　如果不同，分析产生不同结果的原因。
　　由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。
五、课题延伸
　　本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
课堂总结：

典型例题
例1、下列关于纤维素酶的说法，错误的（　）
A．纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种
B．纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖
C．纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁
D．葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖
答案：D
例2、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是（　）
A．刚果红能与纤维素形成红色复合物
B．刚果红能与纤维二糖形成红色复合物
C．刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物
D．若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌
答案：B
例3、有关选择培养正确的叙述是（　）
A．可以增加纤维素分解菌的浓度
B．可以减少纤维素分解菌的浓度
C．所用培养基是固体培养基
D．所用培养基是平板培养基
答案：A
例4、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（　）
①土壤取样　　　　　②梯度稀释　　　　　③选择培养
④菌悬液涂布平板　　⑤挑选出单个菌落
A．①②③④⑤　　　　　　　　　B．①③②④⑤
C．①②④③⑤　　　　　　　　　D．①④②③⑤
答案：B
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同步测试

一、选择题
1、下列材料中纤维素含量最高的是（　）
A．杨树　　　　　　　　　　　　　B．小麦
C．玉米　　　　　　　　　　　　　D．棉花
2、纤维素酶能够分解（　）
A．纤维素的微生物　　　　　　　　B．淀粉的微生物
C．纤维素　　　　　　　　　　　　D．淀粉
3、刚果红能与哪项物质形成红色复合物（　）
A．纤维二糖　　　　　　　　　　　B．纤维素
C．葡萄糖　　　　　　　　　　　　D．麦芽糖
4、寻找纤维素分解菌应到（　）
A．湿润的环境中　　　　　　　　　B．富含纤维素的环境中
C．富含无机盐的环境中　　　　　　D．池塘中
5、纤维素分解菌的选择培养基有选择作用，原因在于其含有（　）
A．NaNO3　　　　　　　　　　　　　　 B．KCl
C．酵母膏　　　　　　　　　　　　D．纤维素粉
6、下列哪种生物能产生纤维素酶（　）
A．纤维素分解菌　　　　　　　　　B．牛
C．羊　　　　　　　　　　　　　　D．兔
7、选择培养时应将锥形瓶固定在（　）
A．桌子上　　　　　　　　　　　　B．温箱里
C．窗台上　　　　　　　　　　　　D．摇床上
8、选择培养的结果：培养液变（　）
A．清澈　　　　　　　　　　　　　B．浑浊
C．红色　　　　　　　　　　　　　D．产生透明圈
9、刚果红染色时，加入刚果红可在（　）
①制备培养基时　　　②梯度稀释时　　　③倒平板时　　　④涂布时　　　⑤培养基上长出菌落时
A．①③　　　　　　　　　　　　　B．②⑤
C．③⑤　　　　　　　　　　　　　D．④⑤
10、两种刚果红染色法的结果是（　）
A．均会出现透明圈
B．均不会出现透明圈
C．方法一出现，方法二不出现
D．方法一不出现，方法二出现
11、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪一生物学观点？（　）
A．生物结构与功能相适应的观点
B．生物结构与功能整体性观点
C．生物与环境相适应的观点
D．生物发展进化的观点

DCBBDA DBCAC
二、非选择题
12、请分析下面的培养基配方，回答下面的问题：
纤维素分解菌的选择培养基
纤维素粉　　　　　　　　5g
NaNO3　　　　　　　　　 1g
Na2HPO4·7H2O　　　　　　1.2g
KH2PO4　　　　　　　　　 0.9g
MgSO4·7H2O　　　　　　　0.5g
KCl　　　　　　　　　　　0.5g
酵母膏　　　 　　　　　　0.5g
水解酪素　　　　　　　　 0.5g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL
（1）上述配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？
（2）这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何选择的？
（3）如果要证明该培养基的选择培养作用可用__________培养基做__________实验。
显示答案

　　12、（1）是液体培养基，原因是配方中无琼脂。
　　（2）有选择作用，本配方中的碳源是纤维素，所以能分解纤维素的细菌可以大量繁殖，不能利用纤维素的微生物则难以生存。
　　（3）牛肉膏蛋白胨　　对照。
13、淀粉酶可以通过微生物发酵生产，为了提高酶的产最，请你设计一个实验，利用诱变育种方法，获得产生淀粉酶较多的菌株。①写出主要实验步骤。②根据诱发突变率低和诱发突变不定向性的特点预期实验结果。
　　提示：生产菌株在含有淀粉的固体培养基上，随其生长可释放淀粉酶分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈。（理科综合能力测试）
显示答案

　　13、①主要实验步骤：
　　第一步：将培养好的生产菌株分两组。一组用一定剂量的诱变剂处理，另一组不处理做对照。
　　第二步：制备含淀粉的固体培养基。
　　第三步：把诱变组的大量菌株接种于多个含淀粉的固体培养基上，同时接种对照组，相同条件下培养。
　　第四步：比较两组菌株菌落周围透明圈的大小，选出透明圈变大的菌株。
　　②预期实验结果：
　　a．由于诱发突变率低，诱变组中绝大多数菌落周围的透明圈大小与对照组相同。
　　b．由于诱发突变不定向性，诱变组中极少数菌落周围的透明圈与对照组相比变大或变小。
　　解析：这是一道以诱变育种、选择培养和鉴别培养等知识为载体的实验设计题，综合性强，难度较大。既要求学生掌握实验原理，也要求学生具备较强的实验设计的能力及对实验结果的预测和分析能力。
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课外拓展

1、纤维素与纤维素酶
　　纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。纤维素是由葡萄糖分子按β-1，4糖苷键连接而成的，淀粉是由葡萄糖分子按α-1，4糖苷键连接而成的。
　　人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。微生物产生的纤维素酶是一种复合酶，包括内切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。内切酶作用于无定型的纤维素区域，使纤维素断裂成片段；外切酶又叫纤维二糖水解酶，它可以作用于纤维素的结晶区或小片段纤维素，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖；葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成葡萄糖。
2、两种刚果红染色法的比较
　　刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

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高考解析

例1、下列关于糖的叙述，正确的是（　）
A．葡萄糖和果糖分子均有还原性
B．葡萄糖和麦芽糖可被水解
C．构成纤维素的单体是葡萄糖和果糖
D．乳糖可以被小肠上皮细胞直接吸收
答案：A
解析：
　　糖类分还原糖和非还原糖，其中还原糖指可被氧化充当还原剂的糖。常见的还原糖有葡萄糖，果糖，五碳糖等，所以A对。葡萄糖属于单糖不可以被水解，B错。纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，其单体是葡萄糖，C错。乳糖的分子结构是由一分子葡萄糖和一分子半乳糖缩合形成，需水解成单糖后被吸收，D错。
例2、分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是（　）
A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．富集培养这一步可省略；但培养纤维素分解菌少
C．经稀释培养后，用刚果红染色
D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上
答案：A
解析：
　　经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色，设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物。
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