胃粘膜表面局部投予乙酸制备大鼠胃溃疡模型的方法.pdf

解剖科学进展Progress of Anatomical Sciences2011 Jan,17(1):811,15胃粘膜表面局部投予乙酸制备大鼠胃溃疡模型的方法*才丽平，蒋宁，曲怡，林庶茹，韩荣春，王浩，郑洪新（辽宁中医药大学 基础医学院中医分子生物学实验室，辽宁 沈阳 110032）胃溃疡是一种临床上常见的急、慢性消化系统潜在抗溃疡化合物的标准模型。Susumu Okabe先后1疾病，常反复发作，给患者的身心健康带来极大的建立了几种乙酸致胃溃疡模型的方法，上世纪60危害。胃溃疡疾病发病机制及治疗方法的研究均离初，Susumu Okabe创立了粘膜下层注射乙酸致胃溃不开动物疾病模型的建立，而胃溃疡疾病模型有着疡模型方法，即将乙醚麻醉的大鼠经由上腹部正中不同的造模方法。目前常用的模型是乙酸致胃溃疡线剖开。暴露胃部后，使用0.05 ml的微量调节注射模型，乙酸致胃溃疡模型成模于1969年，此后，因器将0.02 ml的20%乙酸溶液注射到前面胃壁腺体部其在病理特征和愈合机理方面与人类溃疡高度相似的粘膜下层。酸注射5天后，圆形/椭圆形、深度溃2而被广泛应用，迄今为止，此种模型业已成为监测疡（约5060mm）在胃窦部或胃窦与胃体结合处可见（具体与注射部位相应）。但使用这种方法，溃疡部位的外表面紧紧粘附于肝上，粘连非常严重，2而人的胃溃疡很少粘连到周围器官上。1969年又建【收稿日期】【基金项目】国家科技部973计划项目（No.2006CB504809）*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）2010-05-18【摘要】目的对大鼠胃溃疡模型制备方法进行改进。方法 胃粘膜表面局部投予乙酸制备大鼠胃溃疡模型。10%水合氯醛（3.5ml/kg体重）肌肉注射麻醉，用0.5碘伏消毒大鼠腹部皮肤，沿左肋下缘开腹，将胃轻轻拉出。用带有圆环的胃溃疡制备镊子夹住距幽门部3mm胃体部区域。在夹闭区的胃腔内注入0.18ml矿物油和0.02ml 60%乙酸，45sec后从胃部吸出乙酸，再向胃腔内注入2ml生理盐水，1min后吸出。将胃复位，逐层关腹。结果 该方法可在大鼠胃部造成单个、圆形、大小、深度一致的溃疡灶，并且解决了手术引起粘连的问题。结论 本文提供一种改进的胃粘膜表面局部投与乙酸制备大鼠胃溃疡模型的方法，该模型可用于考察消化性溃疡的愈合过程、抗溃疡药物疗效评价、药物对胃粘膜所产生的副作用监测等。【关键词】大鼠；胃溃疡；模型+【中图分类号】R656.6 2 【文献标识码】A 【文章编号】1006-2947（2011）01-0008-04Establishment of rat gastric ulcer model by applying acetic acid to specified area in rats gastric mucosa*CAI Li-ping,JIANG Ning,QU Yi,LIN Shu-ru,HAN Rong-chun,WANG Hao,ZHENG Hong-xin（Molecular Biology Lab,School of Preclinical Medicine of Liaoning University of TCM,Shenyang 110032 China）【Abstract】ObjectiveTo improve the established method of acetic acid-induced rat gastric ulcer model.Methods The rat gastric ulcer model by applying acetic acid to specified area in rats gastric mucosa.After 10%chloral hydrate intramuscular anesthesia(3.5ml/kg),the rats skin of abdomen was sterilized by 0.5 iodophors.The rats abdomen was opened along left subcostal margin and the stomach was gently pulled out.The body of stomach approximately 3 mm proximal to the pylorus was clamped by round forceps.Then a mixture of mineral oil(0.18 ml)as well as 60%acetic acid(0.02 ml)were injected into the clamped lumen,which was removed after 45 seconeds.After that,normal saline(2ml)was injected into the gastral cavity,which was removed after 1 minute.Finally,the abdomen was closed.Results A clearly defined deep round ulcer was induced,which was free of post-operative adhesion.Conclusion A kind of improved acetic acid-induced rat gastric ulcer model was established.It could be used to assess the healing process of peptic ulcer,therapeutic effect of antiulcer drug and side effect to gastric mucosa which was caused by drugs.【Key words】rat;gastric ulcer;model2011年第17卷第1期9立了浆膜局部应用乙酸致大鼠胃溃疡模型，但粘连术后大鼠禁食12h，自由饮用口服补液盐。更加严重，粘连问题要求必须研究可替代的造模方12h后正常进食水，饮用水为纯水，每日投放的鼠粮法。为了解决粘连的问题，建立了胃腔内应用乙酸要定量管理。奥美拉唑（阿斯利康）按人剂量的制备胃溃疡模的方法，即采用圆形的钳子（内径6.25倍计算大鼠有效剂量，即1.04mg/kg体重灌胃，9mm）夹住底部区域，穿透远侧的胃窦后将乙酸溶每日一次，共11次。液注入夹住的部位，结果在胃的前壁和后壁造成两1.3 标本采集和处理3正常组5只、假手术组5只、模型组和治疗组各个深度的、圆形溃疡，被称为“吻型溃疡”。其25只大鼠，术后第1天取材正常组、假手术组、模型后为了制备单个溃疡，用上个实验所使用的钳子夹组和治疗组各5只，术后第4天、8天、12天、18天取住胃体前壁和后壁，穿透远侧的胃窦后将0.1 ml 60%模型组和治疗组各5只大鼠。大鼠禁食12h、自由饮的乙酸溶液和0.2 ml空气注入大约在临近幽门部水，10%水合氯醛麻醉，开腹。取出胃，将胃沿胃3mm的夹住的内腔，乙酸溶液只接触到位置低的一大弯剪开，以生理盐水将胃粘膜冲洗干净，观察胃面，所以将得到单个的溃疡。45s后，乙酸和空气的溃疡状态，数码相机照相，以备用图像分析系统测混合溶液从胃部被吸走，然后进行腹部缝合。3天量溃疡面积。然后取出胃部溃疡处，生理盐水冲洗后，一个清晰的深度圆形溃疡在胃后壁出现，胃的4干净后，4%多聚甲醛中固定，以备制成切片，苏木前壁黏膜仍保持完整。我们在开展抗胃溃疡药物疗精-伊红染色，镜下观察。效观察的实验中，尝试了各种胃溃疡造模方法，认1.4 观察胃粘膜改变为在胃腔内投与乙酸制备单个的方法稳定可行，但术后大鼠以4ml/kg体重10%水合氯醛腹腔注射麻实验中发现诸多细节上的问题亟待解决，故对此方醉，开腹取出胃，以生理盐水将胃粘膜冲洗干净，法进行改进。观察胃溃疡状态，用数码相机拍照，并用图像分析系统测量溃疡面积。1材料与方法1.5 组织病理学在观察胃部损伤后，立即将标本固定在4%多聚1.1 试剂，实验动物甲醛中，24小时后梯度脱水、石蜡包埋。制成5 m 实验用乙酸、水合氯醛由国药集团化学试剂有厚的切片。常规脱蜡脱水后，苏木精-伊红染色，光限公司提供，矿物油购自美国sigma公司。雄性学显微镜下观察。SPF级SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重（21010）g。正常组5只、假手术组2结果 5只、模型组和治疗组各大鼠25只。1.2 造模方法2.1动物一般状态，胃溃疡局部情况大 鼠 术 前 禁 食 12h，自 由 饮 用 口 服 补 液 盐使用该方法造模，大鼠一般状态良好，进食水（Oregon Revised Statutes，ORS），ORS配方是氯化正常，体重无明显改变，无腹胀，刀口愈合良好，钠3.5克、碳酸氢钠2.5克、氯化钾1.5克、葡萄糖粉存活率为100%。20克加纯水至1000ml。造模后不同时间取材，打开腹壁，拉出胃，可10%水合氯醛（3.5ml/kg体重）肌肉注射麻醉。见全部实验动物胃与周围组织均无粘连。打开胃，用0.5碘伏消毒大鼠腹部皮肤，沿左肋下缘开腹，观察胃溃疡情况：正常组和假手术组胃粘膜正常，将胃轻轻拉出。用本课题组自行设计的胃溃疡制备未见溃疡。模型组术后1天，一个清晰的圆形溃疡在镊子（专利号：ZL2009200151947）夹住距幽门部胃后壁出现，溃疡面红肿，常有血色苔状物覆盖在3mm胃体部区域。将事先吸好0.18ml矿物油和0.02ml 2溃疡面上；溃疡平均面积为（48.439.94）mm。术60%乙酸的注射器的针头插入挟闭区的胃腔内，在后4天，溃疡表面有白色苔状物覆盖，周边隆起，形挟闭区的胃腔内注入0.18ml矿物油和0.02ml 60%乙成溃疡喷口，溃疡面红肿，有白色苔状物覆盖在溃酸，45sec后从胃部吸出乙酸，再向胃腔内注入22ml生理盐水，1min后吸出，以终止反应。将胃复疡面上。溃疡平均面积为（36.518.34）mm。术后位，向切口内滴入青霉素钠注射液0.1ml（以4ml生理8-12天溃疡局部红肿，溃疡面积逐渐减小，术后第2盐水加入80万单位青霉素钠，混匀），逐层关腹。8天溃疡平均面积为（23.967.77）mm；术后第假手术对照组以灭菌纯水代替乙酸。术中操作轻柔12天底部不光滑，溃疡周边隆起，溃疡平均面积为2并注意无菌操作，以减少粘连。（14.385.94）mm。术后18天溃疡局部红肿明显减才丽平等 胃粘膜表面局部投予乙酸制备大鼠胃溃疡模型的方法10解 剖 科 学 进 展2011年第17卷第1期Fig 1.The gastric ulcer state of ratsA:normal group;b:sham group;c:ulcer model group on the 1st day;d:Omeprazole group on the 1st day;e:ulcer model group on the 4th day;f:Omeprazole group on the 4th day;g:ulcer model group on the 12th day;h:Omeprazole group on the 12th dayFig 3.The HE stain of the gastric mucosa(200)a:normal group;b:sham group;c:ulcer model group on the 1st day;d:Omeprazole group on the 1st day;e:ulcer model group on the 12th day;f:Omeprazole group on the 12th day2型组（0.05）。第18天，奥美拉唑治疗组在胃体或轻，溃疡面积明显减小（4.881.74mm。胃窦部未见明显的溃疡灶。治疗组术后24h后开始经口投予奥美拉唑，给药2.3 胃溃疡局部病理组织学观察后不同时间取材，观察胃溃疡愈合情况：术后1天，取溃疡局部组织，石蜡切片，HE染色，光学显一个清晰的圆形溃疡在胃后壁出现，溃疡面红肿，微镜观察，正常组和假手术组胃粘膜上皮完整，上常有血色苔状物覆盖在溃疡面上；溃疡平均面积为2皮细胞排列整齐，粘膜下层炎症细胞少见。模型组（51.726.45）mm，与模型组溃疡大小相似。术后术后第一天，病理切片上溃疡部位粘膜上皮缺失，4天，溃疡表面有白色苔状物覆盖，周边隆起，溃疡2溃疡表面或粘膜下层常见到出血，粘膜下层可见大平均面积为（27.035.32）mm,与模型组相比，溃量炎症细胞浸润。术后第4天，溃疡部位粘膜上皮缺疡面积明显较小（0.05）。术后8天溃疡平均面积2失，溃疡表面或粘膜下层出血吸收，粘膜下层仍可为（6.233.12）mm，与模型组相比，溃疡面积明见大量炎症细胞浸润。术后8-12天，炎症细胞数有显较小（0.05）。胃溃疡手术造模后第12天取所减少。溃得康治疗组与模型组相比，第1天、第材，奥美拉唑治疗组在胃体或胃窦部可见较小的圆4天炎症程度无明显差别，第8天和第12天，溃疡部形或近似圆形的溃疡，底部较光滑，溃疡周边略隆2位上皮修复，炎症细胞浸润明显减少。起，溃疡面积为（6.002.39）mm，明显小于模）2Table 1.The dynamic state of the gastric ulcer area(mm,n=5)groupulcer modelOmeprazolestthe 1 day48.439.9451.726.45ththe 4 day36.518.3427.035.32ththe 8 day23.967.776.233.12ththe 12 day14.385.946.002.39或浆膜下投与乙酸均会引起严重的粘连。我们尝试使用Susumu Okabe等创建的胃腔局部应用乙酸的方法，结果发现用钳子夹住胃体前壁和后壁，穿透远侧的胃窦后将0.1 ml 60%的乙酸溶液和0.2 ml空气注入夹住的内腔，有时会造成双面溃疡或溃疡程度不一的溃疡，不能完全满足评价抗溃疡药物的要求，所以我们对其进行改进，使用改良的方法制备的模型为单个、等大、深度一致的溃疡灶病灶，病理学上符合溃疡改变，用该模型评价阳性对照药奥美拉唑，显示出良好的治疗效果。3.1 造模试剂及剂量的改进经过反复实验，结合数学计算，我们认为在挟闭区注射0.1 ml乙酸，量太大，很容易造成双面溃疡，所以将乙酸量减至0.02ml，为了更好地保护胃前壁，我们将0.2 ml空气换成0.18ml矿物油。同时发现3讨论作用45sec将乙酸吸出，有时吸不出液体，致使乙酸建立理想而稳定的动物模型是动物实验研究的作用时间可能不一致，故有的大鼠溃疡过深或穿关键，胃溃疡疾病发病机制及治疗方法的研究均离孔。为了使乙酸作用时间一致，我们在乙酸吸出后不开胃溃疡动物疾病模型，而胃溃疡疾病模型有着立即用2ml生理盐水冲洗，以终止反应。不同的造模方法，目前常用的模型是乙酸致胃溃疡3.2 手术注意事项模型。而在以往报道中在乙酸性大鼠胃溃疡的制作我们发现如果不严格无菌，有的大鼠取材时会方法上常用的有三种方法，一种是在大鼠胃窦前壁有胃浆膜外的小脓肿，影响大鼠的状态、溃疡愈合浆膜面，用直径56 mm 的玻璃管垂直压定后，向和指标评价，故无菌是非常重要的。包括手术中注玻璃管内滴入0.1 ml 的冰乙酸，保留1min后，吸出冰意保持无菌，手术器械严格消毒，手术区域铺无菌乙酸，生理盐水冲洗后缝合。一种是用直径5 mm 的孔巾，手术结束时局部投与抗菌素，以减少感染。滤纸片浸渍冰乙酸贴敷到大鼠胃窦前壁的浆膜面30 术中操作要轻柔快捷，以减少粘连。给药时间严格Sec 2次，生理盐水冲洗后缝合。还有一种就是在大控制，以保持溃疡程度一致。5鼠胃窦部浆膜下近肌层处注射冰乙酸。但浆膜表面PPP2011年第17卷第1期11才丽平等 胃粘膜表面局部投予乙酸制备大鼠胃溃疡模型的方法2The area of gastric ulcer(mm)60.0050.0040.0030.0020.0010.000.00day1 ay4 ay8 ay12dddgroupu1cer mode1Omep razoleFig 2.The comparison of the gastric ulcer area dynamic states（下转第15页）3 Yang S,Cui L.The action of aquaporins in cell elongation，salt 依据stress and photosynthesis J.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2009,研究证实，在自由落体打击颅脑损伤时，AQP4 5(3):321-327.mRNA和蛋白表达均呈一定的时序性表达，说明在整4 才丽平,赵金茹,林庶茹,等.水通道蛋白研究进展J.解剖科学个颅脑损伤的形成过程中，AQP4蛋白增加是AQP4 进展,2003,9(2):167-170.5 Taya K,Marmarou CR,Okuno K,et al.Effect of secondary insults mRNA合成增多所致。研究显示：创伤性脑损伤后脑upon aquaporin-4 water channels following experimental cortical 组织AQP4表达开始上调，S1达到高峰，S2、S1W、contusion in ratsJ.J Neurotrauma,2010,27(1):229-239.S2W仍维持较高水平。AQP4的上调是引起损伤区颅6 尹燕伟,宋建防,周赞宫,等.利多卡因对大鼠脑损伤后脑组织水脑损伤脑水肿的主要途径和原因。研究AQP4的表达通道蛋白4表达的影响J.中国临床康复，2006,10(12):68-70.7 郝利铭,陈爱军,高英,等.Aquaporin在中国人肺鳞癌细胞的表和功能，将为各种脑功能障碍引起的脑水肿提供新达J.解剖科学进展,2008,14(3):287-289.的治疗途径，奠定实验依据。随着分子生物学技术8 彭雪华,孙善全.AQP4研究进展J.解剖科学进展,2001,7(3):的发展，对AQP4的研究将日益深入，它创伤后脑损261-264.伤形成中的作用和机制将会更加明确，这对于临床9 Papadopoulos MC,Verkman AS.Aquaporin-4 and brain edemaJ.Pediatr Nephrol,2007,22(6):778-784.愈后有一定的参考意义。10 Hoge CW,Wilk JE,Herrell R.Methodological issues in mild traumatic brain injury researchJ.Arch Phys Med Rehabil,2010,【参考文献】91(6):963.11 Yamada K.Brain edema and aquaporinJ.Nihon Shinkei Seishin 1 Cernak I,Noble-Haeusslein LJ.Traumatic brain injury:an overview Yakurigaku Zasshi,2005,25(5):235-238.of pathobiology with emphasis on military populations J.J Cereb 12 Manley GT，Binder DK，Papadopoulos Mc，et al.New insights Blood Flow Metab,2010,30(6):1262.into water transport and edema in the central nervous system from 2 Ciechanowicz A,Krzysztatowska M,Bicjczak-Kuleta A.Aquaporins-a phenotype analysis of aquaporin-4 null miceJ.Neurosci,2004,new element in the regulation of body water homeostasis J.Pol 129(4):983-991.Merkur Lekarski,2009,27(158):144-147.3.3 术前术后护理【参考文献】如果术前禁食24小时，术中麻醉，术后禁食1 Okabe S,Amagase K.An overview of acetic acid ulcer models-the 24小时的话，大鼠术后体重明显减轻，状态不佳，history and state of the art of peptic ulcer researchJ.Biol Pharm 所以我们采取术前禁食12小时、术后禁食12小时，Bull,2005,28(8):1321-1341.同时饮糖盐水，保持血糖和离子处于正常水平。术2 Takagi K,Okabe S,Saziki R.A new method for the production of 后12小时后，适当控制食量，是因为我们发现术后chronic gastric ulcer in rats and the effect of several drugs on its healingJ.Jpn J Pharmacol,1969,19(3):418-426.大鼠由于饥饿或疼痛，会大量进食，进食过量会引3 Tsukimi Y,Nozue C,Okabe S.Effects of leminoprazole,omeprazole 起胃过度扩张，大量食物蓄积胃内，引起腹胀。通and sucralfate on indomethacin-induced delayed healing of kissing 过控制食量，很好解决术后腹胀的问题。gastric ulcers in ratsJ.J Gastroenterol Hepatol,1996,11(4):335-本课题组采用胃粘膜局部注射乙酸方法制备胃340.4 Amagase K,Susumu Okabe S.Acetic acid ulcers:a new method for 溃疡模型，此方法操作简单，可造成单个的圆形溃producing solitary chronic ulcers in rat stomachs by intraluminal 2疡，溃疡面积（50mm 左右）和深度稳定可控。损伤application of acetic acid solutionJ.Inflammopharmacology,2002,局部出现明显的溃疡，且大小深度基本一致，组织10(4-6),385-389.5 王英.冰乙酸性大鼠胃溃疡模型制作方法比较J.实用诊断与治病理改变符合人类溃疡改变，是评价研究胃溃疡发疗杂志,2007,21(7):505-506.病机制和评价抗胃溃疡药物疗效的很好的模型。（上接第11页）2011年第17卷第1期15李慢等创伤性脑损伤后大鼠皮质AQP4表达的变化