壳寡糖的酶法制备和分离技术可行性研究报告样本.doc

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新苗人才计划项目

项目名称：壳寡糖酶法制备和分离技术研究

一、 立项背景及意义
壳寡糖(Chitooligosaccharide)，又名甲壳低聚糖，是由氨基葡萄糖经过β-1,4-糖苷键连接而成聚合度约为2-20低聚糖，其分子量低于5000，含有稳定三维结构。壳寡糖可利用壳聚糖经过生物酶技术降解制得。
壳聚糖广泛存在于自然界虾壳、蟹壳和真菌中，即使有特殊生物活性，但因为其分子量大、水溶性差，在人体内不易被吸收而使其应用受到限制。作为一个生物技术产品，壳寡糖几乎包含了全部壳聚糖全部优点，它含有良好生物相容性和生物降解性、亲水性、吸附性、生物学活性等多个理化特征和天然、高效、毒副作用少、抗药性不显著、性能多样等特点。科学研究表明，壳寡糖功效作用和生物活性比起壳聚糖将提升数十倍、应用领域愈加广泛、人体吸收率近100%（壳聚糖吸收率6.48%），而且增加了促进钙吸收新功效作用，含有较高科技含量和附加值，发达国家称其为“软黄金”。
壳寡糖含有三调（免疫调整、调整pH值、调整荷尔蒙）、三降（降血脂、降血糖、降血压）、三排（排胆固醇、排重金属离子、排毒素）、三抑（抑制癌细胞、抑制癌细胞转移、抑制癌毒素）等功效，同时，还含有抗自由基、防辐射、抗炎、止血和促进伤口愈合等功效。壳寡糖及其衍生产品可广泛应用于医药、保健、食品、日化、农业等领域。在医药保健领域含有提升免疫、活化细胞、调整血糖血脂血压胆固醇、预防诊疗癌症、强化肝功、促进钙吸收、增殖肠道有益菌等功效；在食品饮料领域是一个良好健康食品添加剂，可增殖乳酸菌、双歧杆菌等人体有益菌100倍以上；在日化领域含有营养皮肤、抑菌、保湿等功效，性能优于传统透明质酸等产品；在农业领域可激活植物免疫系统和酶系活性，能促进植物生长、提升作物产量和品质、增强抗病力、增殖生物菌肥有益菌群等，含有药肥双效功效，被誉为“不是农药农药，不是化肥化肥”，市场前景极其宽广。
现在壳寡糖产品年需求量在6000吨以上。在精细化工领域，因为壳寡糖绿色天然特征符合世界日化产品发展趋势，含天然活性物质化妆品顺应回归自然、科学美容消费趋势，欧洲现已经有60多个和壳寡糖相关化妆品品牌，年需求壳寡糖1500吨。中国化妆品年销售额从1982年2亿元人民币发展到400亿元，居亚洲第二位。在生物医药领域，从中国产业发展研究中心统计可知， 中国医药生物技术工业总产值将达成400亿-500亿元。在保健食品领域，韩国于1996年即同意壳寡糖为功效性保健食品，中国现在已经有很多保健品及药品等年需求壳寡糖上百吨保健食品生产厂家，中国很多医药保健品企业正在申报壳寡糖保健食品文号，估计年需求量将以高于30%速度递增。在农林畜牧领域，因壳寡糖含有良好抗病虫害功效,且有安全、微量、高效、成本低等优势，可使水果、蔬菜、粮食增产10%-30%，所以能够应用于生物农药产品，部分替换化学农药。现在中国农业病虫害共余种，受灾面积数10亿亩。所以壳寡糖在农林畜牧上应用对中国农业可连续发展含相关键意义，以壳寡糖为基础生物农药将有宽广发展空间。科技部已将“壳寡糖新产品开发应用”列为国家“九五”攻关计划项目和“十五”招投标项目，要求建立数条年产500吨以上壳寡糖生产线，到总产值可达1100亿-1300亿元，从而满足中国市场需求。壳寡糖等级不一样，售价差额较大。农业专用壳寡糖市场价为400元/千克；食品级壳寡糖市场价为600元/千克；而化妆品级壳寡糖市场价为150元/千克。伴随壳寡糖应用范围不停扩大，加之作为一个性能优异基础原料，市场需求量将呈稳步上升趋势。同时，壳寡糖作为一个中间原料，出口市场稳定。
多年来，伴随本省海产品加工业发展，尤其是甲壳素综合利用产业兴起，本省逐步成为东南亚地域海产品加工利用中心和关键甲壳素产业发展基地。。全省甲壳素制品直接经济总产值约10亿元左右（和其相关、间接纺织、食品、医药、化工等行业产值达数百亿元）。在此基础上，本项目从壳聚糖不足出发，着重研究了经过专一性酶法技术降解壳聚糖，制备聚合度均一壳寡糖产品，将使产品附加值得到大幅度地提升。
所以，本项目标实施，对于有效利用甲壳素资源，促进本省甲壳素行业健康发展，意义重大。因为项目原料起源方便、价格低廉，将大大降低了加工企业生产成本，满足了市场紧缺，且安全无公害，推广应用前景宽广，对全国水产加工业发展含相关键影响。

二、 中国外研究现实状况和发展趋势
开发应用壳寡糖是甲壳质行业制高点，也是当今生物制药技术一个亮点。现在，其科研开发关键集中在日本、韩国等国家。
壳寡糖关键制备方法有化学法、物理法和生物法。化学法关键包含酸水解法、氧化法、超临界流体法、配位降解法等。现在，中国对H2O2氧化降解法研究较多，可在降解过程中伴随副反应还需要探索出有效遏止方法，另外必需注意氧化降解对产品活性影响和存在残留H2O2对食品安全性是否产生隐患也是值得考虑。物理法包含微波法、超声波法、光降解法、γ射线法等。生物法关键有酶法降解、反应器和酶降解、糖基转移法等。其中已用于工业化生产有酸水解法、氧化降解法, 不过存在产品相对分子质量分布较宽, 均一性差，分离纯化难度高和污染严重等问题；物理方法也有一定缺点, 不能作为主体方法用于壳寡糖制备；酶降解法条件温和, 产物不用脱盐，工艺易于控制, 易于得到所需聚合度壳寡糖, 而且对环境不产生污染，是较理想制备方法，尤其是酶降解和反应器联合方法, 已经在产业化道路上迈出第一步，但在制备工艺上还有很多有待改善提升产量地方。
20世纪90年代末，酶法生产壳寡糖在日本、韩国实现了产业化。中国对该产品研究虽起步较晚，但多年来做了大量工作，并趋于活跃。8月，山力、济南海得贝企业利用复合酶法制备壳寡糖生产线正式投产，壳寡糖在中国第一次实现了产业化生产。复合酶比起专一性酶制备壳寡糖，所得降解产物相对分子量分布不轻易控制，聚合度不够均一。但因为现在市场上专一性酶价格昂贵，怎样寻求到降解效果好、成本又不高专一性酶，是一个急需处理技术难题。而这一技术难题处理无疑将为中国整个甲壳素行业发展提供帮助。

三、项目关键研究开发内容、技术关键和科研创新关键方法
（一）关键研究内容：
1、专一性酶菌种筛选。
经过制作以壳聚糖为唯一碳源平板筛选分离培养基进行筛选。 采取平板划线分离法接种，放入30℃培养箱培养3-4天。以后，观察培养基，取有透明圈平板，挑选菌种，深入进行发酵培养，测定酶活。
2、产酶菌种发酵培养。
依据已优化发酵培养条件进行发酵培养，对发酵上清液中粗酶，采取75%饱和度乙醇沉淀，取得粗酶粉，测定酶活力，低温保留。
3、壳寡糖酶法制备和性质研究
经过还原端基、酶解产物聚合度、水解液调碱性后透光率改变测定和酶解产物TLC、 HPLC分析，研究壳聚糖酶降解壳聚糖过程中壳聚糖脱乙酰化度、壳聚糖浓度、酶用量、反应时间和pH值对酶促反应速率和产物聚合度影响。
4、研究壳寡糖分离技术、纯化工艺；
超滤/离子交换树脂
5、壳寡糖含量检测方法研究；
采取高效液相色谱法(HPLC)、测定低聚糖类含量。
6、壳寡糖产品质量标准制订。
（二）关键技术：
1、高活力壳聚糖酶制剂制备和壳聚糖酶酶活测定；
2、壳寡糖酶法制备技术；
3、壳寡糖分离技术；
4、壳寡糖制品分析检验技术，包含还原端基、酶解产物聚合度、水解液调碱性后透光率改变测定；壳寡糖含量和纯度、相对分子质量、杂质含量测定；壳寡糖水溶性、水分测定和酶解产物TLC 、HPLC分析。
（三）创新关键方法：
1、壳寡糖产品加工采取酶法工艺，克服了传统化学法分子量分布范围宽、易变色缺点，且不会带来环境污染问题
2、为壳聚糖高值化利用提供了新路径。

四、项目预期目标
（一）关键技术经济指标
1、目标：
（1）以壳聚糖为原料，采取酶法技术有效地制备、分离壳寡糖；
（2）提供完整加工技术研究汇报，包含提取工艺、分离技术、产品质量研究、操作技术步骤等。
2、壳寡糖产品技术指标
（1）水分含量 <7% （105℃）；
（2）分子量为500-5000Da （Waters 600E检测）；
（3）不溶物≤1.0％；
（4）粘度（5％）≤10 mPaS；
（5）pH 4-6 ；
（6）脱乙酰度≥70％；
（7）六、七、八糖含量达成50%以上；
（8）分散度小于1.5；
3、经济指标
（1）发表相关学术论文1篇；
（2）提供符合质量标准样品。
（二）应用或产业化前景
壳寡糖在食品加工中可用壳寡糖做填充剂、增色剂、脱色剂、稳定剂和保鲜包状膜。
壳寡糖应用范围在不停扩大，受到了国家高度重视。现在市场上壳寡糖价格比较高，一直处于求大于供现象。怎样有效地处理这一问题，就需要研究和探索可行方法来制备壳寡糖。酶法生产壳寡糖项目，将有利促进了中国壳寡糖行业发展。和其它降解法相比，酶降解法含有反应条件温和，降解过程及降解产物相对分子量分布轻易控制，制备低聚糖生物活性高，产物不用除盐。过程轻易控制，且不对环境造成污染等优势，是理想壳寡糖生产方法。
本项目标制备方法处理了产品安全性问题，降低资源浪费，满足市场要求，应用前景宽广。但低聚壳聚糖制备，尤其是聚合度6-8壳寡糖制备大全部处于试验室研究阶段。所以，本项目拟在试验室研究基础上，经过专一性酶法制备壳寡糖，深入发展成产业化，以满足中国外对壳寡糖需求。

五、项目实施方案
（一）技术路线
1、采取专一性酶解法进行制备壳寡糖；
2、壳寡糖分离，纯化精制技术研究
采取水解产物薄层层析(TLC)分析、水解产物(HPLC)分析。
3、提取率及品质分析
采取数理统计方法来分析提取率高低，另外，采取对应方法进行质量、水溶性、水分检测。
4、技术步骤

筛选菌种，菌种扩大培养。

碳源、氮源、pH
温度、培养时间

高活力壳聚糖酶制剂制备

壳聚糖脱乙酰度
壳聚糖分子量
壳寡糖酶解

壳寡糖分离

壳寡糖样品分析和检验

（二）组织方法
以组员分工合作形式来负责完成此项课题
（三）课题分解
（1）菌种筛选；
（2）产酶菌种发酵培养；
（3）壳寡糖酶法制备和性质研究；

六、计划进度安排
日期
工作进度
7月至1月
筛选产专一性壳寡糖酶菌种并对菌种进行扩大培养技术。壳寡糖酶法制备，和壳寡糖分离、纯化技术。
2月至3月
壳寡糖产品分析和检验。
4月至6月
深入完善并优化生产技术，完成项目总结，准备项目判定。

七、现有工作基础和条件
试验室含有试验所需设备：
TGL-16C台式离心机 上海安亭科学仪器厂
电热恒温水浴锅 江苏金坛县国华仪器厂
XW-80A漩涡混合器 上海医科大学仪器厂
隔水式电热恒温培养箱 上海市跃进医疗器械仪器一厂
HYG-A型回转恒温调速摇瓶柜 江苏太仓市试验设备厂
手提式灭菌锅 无锡市第二医疗器械厂
超净台 苏州净化设备厂
磁力搅拌器 江苏江阴科研器械厂
WFZ-W2100紫外/可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器
W1100紫外分光光度计 北京瑞利分析仪器企业
Mettler Toledo 320-5 pH计 上海梅特勒
乌氏粘度计

八、经费预算
省级科技计划项目经费预算表
项目名称： 金额单位： 万元
序号
预算科目名称
累计
省财政拨款经费
地方部门配套经费
自筹经费
1
1、设备费

2
（1）购置设备费

3
（2）试制设备费

4
（3）设备租赁费

5
2、材料费
0.3

6
3、测试化验加工费
0.15

7
4、燃料动力费

8
5、差旅费
0.1

9
6、会议费
0.05

10
7、合作、协作研究和交流费

11
8、出版/文件/信息传输/知识产权事务费
0.15

12
9、人员劳务费
0.05

13
10、教授咨询费

14
11、管理费

15
12、其它开支

16
经费总计
0.8