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单纯运动或感觉神经损伤在骨骼肌萎缩中的致凋亡作用赵磊,姜东林,吕广明,严志强,赵朋,孙钧铭,李成万摘要?目的?探讨单纯运动神经或感觉神经损伤在骨骼肌萎缩中的致凋亡作用。方法?健康成年 SD 大鼠 30 只,随机分为前根切断组(切断左侧 L4-L6脊神经前根)、后根切断组(切断左侧 L4-L6脊神经后根)和坐骨神经切断组(切断左侧坐骨神经),每组10 只。10 周后取左右两侧腓肠肌,应用荧光标记、电镜技术以及免疫组化方法观察单纯运动或感觉神经损伤后骨骼肌细胞的凋亡表现及 Fas/FasL 的表达变化。结果?失神经支配 10 周后,骨骼肌细胞出现各种凋亡变化,细胞核凋亡形态明显,其中后根切断组、前根切断组和坐骨神经切断组的细胞核排列密集程度依次增加,Fas/FasL 表达依次增强。电镜观察可见失神经支配的骨骼肌细胞未见典型的凋亡小体,但出现凋亡前期的形态改变。结论?运动神经损伤对骨骼肌萎缩的影响大于感觉神经损伤,临床治疗失神经支配的骨骼肌萎缩应优先考虑重建运动神经。?关键词?神经损伤;肌萎缩;细胞凋亡?中图分类号?R651?22?文献标志码?A?文章编号?0577?7402(2011)09?0923?03Apoptosis?inducing effect of selective sensoryor motor nerve injury on skeletal muscle atrophyZHAO Lei,JIANG Dong?lin*,LV Guang?ming,YAN Zhi?qiang,ZHAO Peng,SUN Jun?ming,LI Cheng?wan?Department of Orthopaedics,Third Affiliated Hospital of Nantong University,Wuxi,Jiangsu 214041,China*Corresponding author,E?mail:jdlstar126?comAbstract?Objective?To explore the apoptosis?inducing effect of selective sensory or motor nerve injury on skeletalmuscle atrophy.Methods?Thirty healthy adult SD rats were randomly divided into three groups,namely,ventral root transection group(VRT group,received left L4-L6ventral rhizotomy),dorsal root transection group(DRT group,received left L4-L6dorsal rhizotomy),and sciaticnerve transection group(SNT group,received left sciatic nerve transection).Each group comprised 10 SD rats.The bilateralgastrocnemiuswas harvested 10weeks after operation to observe the apoptosis and Fas/FasL expression of the skeletalmuscle cells throughfluorescent labeling,transmission electron microscopy,and immunohistochemistry.Result?Ten weeks after the denervation,apoptosis?related changes,especially obvious changes of the nuclear apoptotic morphology,were observed in the skeletal muscle cells.Theaggregation degree of the nucleus and the expression of Fas/FasL increased in the following order:DRT group,VRT group,and SNTgroup.No apoptotic body,but early apoptotic morphology,was found in the denervated gastrocnemius through transmission electronmicroscopy.Conclusions?The effect of motor nerve injury on skeletal muscle atrophy is more serious than that of sensory nerve injury.The rebuilding of motor nerves should be preferentially considered in the clinical treatment of muscle atrophy induced by denervation.?Keywords?nerve injuries;muscle atrophy;apoptosis?神经损伤以后,其效应器官(骨骼肌)将发生不同程度萎缩,导致功能减弱或丧失1?2。细胞凋亡在骨骼肌萎缩和退化中具有重要作用,而减少或延缓细胞凋亡可为骨骼肌萎缩和退化的治疗提供基础。本实验通过切断大鼠脊神经根,建立大鼠运动神经或(和)感觉神经损伤动物模型,探讨运动神经或感觉神经损伤对骨骼肌营养作用的差异及对骨骼肌细胞凋亡的影响。1?材料与方法1?1?实验动物分组?健康成年 SD大鼠 30只,购自南通大学实验动物中心,雌雄不拘,随机分成 3 组,每组10 只。?前根切断(ventral root transection,VRT)组:作者简介?赵磊,医学硕士,副主任医师。主要从事神经损伤再生方面的研究 作者单位?214041?江苏无锡?南通大学第三附属医院骨科(赵磊),中心实验室(姜东林、赵朋、孙钧铭、李成万);223001?江苏南通?南通大学江苏省神经再生重点实验室(吕广明);200030?上海?上海交通大学医学院力学生物学与医学工程实验室(严志强)通讯作者?姜东林,E?mail:jdlstar 126?com体重211?11(181 244)g,切断左侧 L4-L6脊神经前根;?后根切断(dorsal root transection,DRT)组,体重214?15(180 251)g,切断左侧L4-L6脊神经后根;?坐骨神经切断(sciatic nerve transection,SNT)组,体重208?9(187 237)g,切断左侧坐骨神经。3 组体重比较无显著性差异。1?2?动物模型构建?SD 大鼠经腹腔注射复合麻醉剂麻醉后,常规备皮、消毒、铺巾。VRT 组及 DRT 组大鼠于背部后正中 L3-S1做纵切口,显露左侧腰椎后结构,咬除关节突及部分椎板,暴露L4-L6神经根,VRT组切除前根 1cm,DRT 组切除后根 1cm。SNT 组大鼠于左侧大腿后外侧做弧形切口,显露坐骨神经干 3,暴露至梨状肌下缘 5mm 处,切除 1cm,两断端各自翻转180?,分别固定于臀肌及股二头肌肌膜,以避免神经间的自然生长。术后各组大鼠分笼饲养,10周后取两侧腓肠肌进行观察,以右侧作为正常对照。1?3?观察指标1?3?1?DAPI 荧光标记?将骨骼肌组织进行冰冻切?923?解放军医学杂志 2011 年 9月 1 日 第 36 卷 第 9 期 Med J Chin PLA,Vol?36,No?9,September 1,2011?片,用 0?01mol/L PBS洗涤 5min?3 次,以1?1000 DA?PI 荧光标记物(美国Sigma 公司)37?避光孵育 30min,再用 0?01mol/L PBS 洗涤 5min?3 次,甘油磷酸缓冲液封膜,荧光倒置显微镜下观察细胞凋亡情况。1?3?2?电镜观察?在显微镜下剔除骨骼肌结缔组织,并将其切成 1mm3的小块,以 4%戊二醛和 1%锇酸先后双重固定,梯度乙醇脱水,环氧树脂 Epon812 包埋,切片后以醋酸铀?枸橼酸铅染色,在 JEOL?100S 型透射电子显微镜下观察细胞超微结构。1?3?3?Fas/FasL 免疫组化染色?将冰冻切片用0?01mol/L PBS 洗涤 5min?3 次,加入1%H2O2封闭30min(25?);用0?01mol/L PBS 洗涤5min?3 次,用抗体稀释液包被 4h;0?01mol/L PBS 洗涤 5min?3次,分别用抗 Fas 多克隆抗体(1?50)、抗FasL 多克隆抗体(1?50)4?过夜孵育;次日用 0?01mol/L PBS 洗涤5min?3次,加入生物素化羊抗兔 IgG(1?200)孵育 4h;0?01mol/L PBS 洗涤5min?3次,加入ABC 液孵育4h;0?01mol/L PBS 洗涤 5min?3次,加入 DAB 显色,用水终止反应,洗涤,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封膜,光镜下观察。2?结?果2?1?DAPI荧光标记观察骨骼肌细胞凋亡?光镜观察发现,失神经支配 10周时腓肠肌细胞凋亡现象明显。3组左侧腓肠肌发生凋亡的细胞数增多,细胞核排列较正常对照紧密,其中以SNT 组最为明显,VRT 组次之,DRT 组最轻(图 1)。凋亡细胞的细胞核具有以下特点:比正常大小变化一倍以上;核周不规则,呈扇贝、波浪或锐角状;细胞核位于肌纤维中央或离开周边的细胞膜。2?2?电镜超微结构观察结果?失神经支配 10周时,骨骼肌细胞未见典型的凋亡小体,但 VRT 组、DRT组、SNT 组骨骼肌细胞均出现染色质聚集,核周池扩大,核缩小,周围皱褶增多等现象(图2)。2?3?Fas/FasL 免疫组化染色结果?失神经支配10 周时,大鼠骨骼肌细胞 Fas/FasL 表达明显增加,而正常对照的骨骼肌鲜见阳性染色细胞。失神经支配骨骼肌细胞Fas/FasL 表达以 SNT 组最为明显,VRT 组次之,DRT 组最轻(图 3)。图1?骨骼肌细胞凋亡情况(DAPI 荧光染色?100)A?正常对照;B?VRT 组;C?DRT 组;D?SNT 组Fig?1?Apoptosis of skeletal muscle cells(DAPI fluorescence labeling?100)图 2?骨骼肌细胞电镜超微结构(醋酸铀?枸橼酸铅染色?8000)A?正常对照骨骼肌;B?失神经支配骨骼肌Fig?2?Ultrastructure of skeletal muscle cells(uranyl acetate?lead citrate staining?8000)3?讨?论细胞凋亡又称细胞程序性死亡,是由基因调控的生理性死亡,与DNA 降解有关。骨骼肌的功能和活力依赖于完整的神经支配,失神经支配后将发生骨骼肌萎缩,在此过程中存在细胞凋亡机制的参与和调控 4?5。有研究发现,切断 SD 大鼠单侧坐骨神经后 15d,跖肌和腓肠肌肌肉湿重显著降低,肌纤维横断面积显著缩小,并出现了明显的细胞凋亡现象 6。这种失神经支配肌肉组织在短期内的改变是可逆的,但延长失神经支配时间后可引起不可逆的深度肌萎缩,细胞凋亡也更加显著,骨骼肌的新陈代谢、蛋白分解和应激反应等均发生明显改变7?9。本研究通过建立单独切断?924?解放军医学杂志 2011 年 9 月 1 日 第 36 卷 第 9期 Med J Chin PLA,Vol?36,No?9,September 1,2011?图 3?骨骼肌细胞 Fas/FasL 表达结果(免疫组织化学染色?200)Fig?3?Fas/FasL expression in skeletal muscle cells(immunohistochemistry?200)L4-L6神经前根、后根或坐骨神经的动物模型,发现失神经支配 10 周时腓肠肌细胞凋亡现象明显,凋亡细胞数增多,细胞核排列较正常对照紧密,同时还发现坐骨神经切断组肌细胞核的凋亡现象最为明显,前根切断组次之,后根切断组最轻,说明神经对所支配骨骼肌的营养作用以运动神经为最强,感觉神经次之。Fas/FasL 作为凋亡诱导家族的重要成员之一,是体内直接启动细胞凋亡的死亡信号传导系统 10。本研究发现,正常骨骼肌细胞中未见 Fas/FasL 表达,而失神经支配的骨骼肌细胞中 Fas/FasL 表达明显上调,说明肌细胞凋亡是失神经骨骼肌发生萎缩的机制之一,提示在神经损伤后骨骼肌细胞凋亡的信号转导中Fas/FasL 途径具有重要作用,且运动神经损伤对 Fas/FasL转导的凋亡信号途径的激活作用远高于感觉神经损伤。综上所述,本研究所建立的神经损伤动物模型可真实模拟单纯运动神经或感觉神经损伤所引起的骨骼肌凋亡改变。失神经后,细胞凋亡导致了骨骼肌萎缩,且运动神经损伤引起的骨骼肌凋亡程度比感觉神经损伤引起的凋亡更为明显。临床上应充分认识运动神经对所支配骨骼肌的营养作用,加强神经损伤后运动神经的优先重建和再生修复研究 11。?参考文献?1陈玉萍,魏东宁?不同年龄组重症肌无力患者的临床特点及疗效分析 J?解放军医学杂志,2010,35(7):867?870?2章翔,费舟,傅洛安,等?脊髓空洞症的诊断与显微手术治疗 J.解放军医学杂志,2002,27(9):815?817?3卢坤刚,韩雪峰,张艳梅,等?坐骨神经选择性损伤应激对大鼠颌下腺中 annexin 5 表达的影响 J?解放军医学杂志,2010,35(5):558?560?4Tang H,Cheung WM,Ip FC,et al?Identification and characteriza?tion of differentially expressed genes in denervated muscle J?MolCell Neurosci,2000,16(2):127?140?5Borisov 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