水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析_张宇.pdf

3期815水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析张宇1，2，王金开2，陈小林1*，李其利1，唐利华1，黄穂萍1，郭堂勋1，玉延华2*（1广西农业科学院植物保护研究所/农业农村部华南果蔬绿色防控重点实验室/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西南宁530007；2广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004）摘要：【目的】分析白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryae，Xoo）侵染不同时间点的水稻转录组数据，了解其响应侵染过程中抗病相关基因的表达情况，为明确水稻对白叶枯病菌感病机制以及培育新的抗白叶枯病水稻品种提供理论参考。【方法】以含有广谱抗性基因Xa23的水稻品系CBB23为试验材料，对其叶片接种高致病性的野生型Xoo菌株N3-1，将接种0、48和72 h水稻样品总RNA进行转录组测序（RNA-Seq）。以|log2Fold Change|1，且错误发现率（False discovery rate，FDR）0.01为标准筛选差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs），并进行GO功能注释和KEGG通路富集分析；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证RNA-Seq结果的可靠性。【结果】RNA-Seq转录组测序结果共获得约54.63 Gb Clean data，样品平均数据量约为6.07 Gb，Q30碱基准确率在94.34%及以上。与对照组0 h相比，水稻CBB23在接种48和72 h两个时间点分别鉴定出2361和2117个DEGs，其中48 h上调基因1650个、下调基因711个，72 h上调基因1440个、下调基因677个。GO富集结果表明，水稻的DEGs显著富集于芳香族氨基酸的代谢及二萜类的生物合成。KEGG通路富集结果表明，DEGs富集于苯丙氨酸和苯丙素类的生物合成。DEGs的分析结果表明，SWEET基因家族中的OsSWEET14基因在接种后表达明显升高，而白叶枯病抗性基因Xa23在接种后几乎没有表达。对转录因子中的WRKY家族进行分析，发现与Xoo抗病相关的WRKY转录因子表达明显下降。钙依赖蛋白激酶（CDPK）表达明显升高，丝裂原活化激酶（MAPK）表达不变。qRT-PCR的基因表达检测结果与RNA-Seq结果趋势基本一致。【结论】水稻CBB23在抵御白叶枯病菌菌株N3-1侵染过程中的氨基酸代谢及次级代谢过程明显增强；感病基因OsSWEET14在侵染过程中被诱导表达，可能是水稻中被调控的关键感病基因之一。与抗病相关的转录因子表达既有上调也有下调。表明水稻在响应病原菌侵染过程中会发生复杂的转录调控网络变化，通过信号通路之间的信号传递，进而调控整个抗（感）病过程。关键词：水稻；转录组；差异表达基因（DEGs）；白叶枯病中图分类号：S435.111文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）03-0815-14收稿日期：2022-11-09基金项目：国家自然科学基金项目（32160039，31960528）；广西自然科学基金项目（2018GXNSFAA294110）；广西农业科学院科技发展基金项目（桂农科2022ZX06）通讯作者：陈小林（1982-），https:/orcid.org/0000-0003-2611-4180，博士，副研究员，主要从事植物细菌病害及其防治研究工作，E-mail：；玉延华（1980-），https:/orcid.org/0000-0003-0796-5481，博士，副教授，主要从事植物细菌性病害致病、寄主抗病机理研究工作，E-mail：第一作者：张宇（1994-），https:/orcid.org/0000-0003-3657-9088，研究方向为微生物学，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（3）：815-828ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.03.017Transcriptome analysis of rice in response to the infection byXanthomonas oryzae pv.oryzaeZHANG Yu1，2，WANG Jin-kai2，CHEN Xiao-lin1*，LI Qi-li1，TANG Li-hua1，HUANG Sui-ping1，GUO Tang-xun1，YU Yan-hua2*（1Institute of Plant Protection，GuangxiAcademy ofAgricultural Sciences/Key Laboratory of Green Prevention and Con-trol on Fruits and Vegetables in South China，Ministry ofAgriculture and RuralAffairs/Guangxi Key Laboratory of Biolo-gy for Crop Diseases and Insect Pests，Nanning，Guangxi 530007，China；2College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530004，China）Abstract：【Objective】To provide theoretical basis for studying the molecular mechanism of the rice to defenseagainst Xanthomonas oryzae pv.oryae（Xoo）and breeding rice varieties resistant toXoo，the transcriptome of rice infectedby Xoo at different time points and the expression of genes related to the infection process were analyzed.【Method】54卷南 方 农 业 学 报 8160引言【研究意义】水稻是全世界约1/2人口的主粮作物，我国约有2/3的人口以稻米为主食。由黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryae，Xoo）引起的水稻白叶枯病是水稻上的重要病害之一，在亚洲、北美和非洲地区均有发生。该病害在我国区域性或间歇性暴发，近年呈逐年加重趋势，仅2017年发生面积就超过66.67万公顷次（陈功友等，2019）。水稻白叶枯病菌通过水孔或伤口侵入，在水稻维管束中吸收营养、扩散增殖并产生大量胞外多糖而使维管束堵塞，导致叶片产生黄褐色或灰白色病斑，严重影响水稻产量（陈贤等，2022；徐如梦等，2022）。因此，研究水稻抵御白叶枯病菌侵染的分子机制，对水稻抗病相关基因的挖掘利用、防治水稻白叶枯病及提高水稻产量均具有重要意义。【前人研究进展】植物采用广谱性免疫和特异性免疫2种免疫机制抵御病原菌的入侵。病原菌均具有保守的分子特征，这些保守的分子特征被称为病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。在病原菌与植物的互作过程中，植物通过其细胞表面的模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）来感知病原菌的PAMPs，启动的广谱性免疫反应被称为PTI（PAMP-triggered immunity）。PTI可激活一系列的抗病反应，包括胼胝质沉积、激酶活化、PR-蛋白表达以及小RNA合成等。但病原菌也可向寄主注入毒性效应子来抑制植物的PTI抗性。如，在黄单胞杆菌属病原菌侵染水稻时，通过利用型分泌系统将型效应子（T3Es）注入宿主细胞内，并模拟真核转录因子操纵寄主细胞的基因表达，从而克服PTI免疫反应，促进细菌的生长（赵开军等，2011）。基于病原菌的效应子，植物又进化出R-基因的第二道防线：通过新的分子受体如R基因编码的NBS-LRR蛋白质来识别特异性效应子。这种通过R-蛋白识别病原菌效应子并启动特异性的免疫反应被称为效应子激发的免疫（Effector triggered immunity，ETI）。源自我国普通野生稻的白叶枯抗病基因Xa23对国内外几乎所有白叶枯病鉴别菌系均表现出完全显性和全生育期高抗，在水稻抗病育种中具有重要的应用价值（Wang et al.，2020）。Xa23是一个带有启动子陷阱的执行基因，能直接捕获病原菌效应子AvrXa23从而激活自身表达毒蛋白XA23，引发水稻强烈的抗病反应。而Wang等（2019）利用Tn5转座诱变技术破坏野生型Xoo菌株PXO99A的avrXa23基因，产生的突变体P99M2克服了Xa23抗性基因，并通过转录组测序CBB23，a resistant rice line carrying Xa23 gene，was inoculated with a highly pathogenic wild-type strain Xoo N3-1 byinfiltration using sterile needleless syringes.Total RNA of the samples at 0，48 and 72 h post-inoculation was extractedfor transcriptome sequencing（RNA-Seq），respectively.Differentially expressed genes（DEGs）were identified，taking|log2Fold Change|1 and false discovery rate（FDR）2 nmol/L）。库检合格后，不同文库按照目标下机数据量进行混合，用Illumina平台进行PE150双端测序。建库和测序均由北京百迈客生物科技有限公司完成。1.2.3DEGs表达分析测序原始数据序列经质量分析、去除低质量序列和接头后，用HTSAT2将序列比对到日本晴参考基因组上（Oryza_sativa/IRG-SP_1.0_release_62），比对分析完成后利用String Tie将比对上的Reads进行组装和定量。将比对到每个基因上的Read count值作为基因原始表达量，然后采用FPKM对表达量进行标准化。采用DESeq2进行样品组间差异表达分析，将|log2Fold Change|1，且错误发现率（False discovery rate，FDR）0.01作为筛选标准。FDR通过对差异显著性P值进行校正获得。1.2.4转录组数据可视化分析使用百迈客云平台对DEGs进行基因本体（Gene ontology，GO）功能注释和KEGG信号通路富集分析；DEGs数量可视化采用火山图和韦恩图云工具完成（https:/ II QRT SuperMix for qPCR（Vazyme-R223-01）进行基因组 DNA 去 除 和 RNA 反 转 录，ChamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix（Vazyme-Q711-02）进行qRT-PCR检测（qTOWERE2，德国耶拿分析仪器股份公司）。总反应体系20.0 L：2Universal SYBRqPCR Master Mix 10.0 L，上、下游引物各0.4 L，cDNA模板1.0 L，ddH2O 8.2 L。每个样品进行3次张宇等：水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析54卷南 方 农 业 学 报 818重复。qRT-PCR反应程序：95 预变性3 min；95 15 s，5759 15 s，72 20 s，进行40个循环。基因相对表达量采用2-Ct法计算（Livak and Schmitt-gen，2001）。2结果与分析2.1菌株N3-1胁迫下的水稻感病性观察及测序样品的接种取样结果用剪叶法分别在水稻CBB23上接种菌株N3-1和PXO99A，并对其病斑进行观察。由图1-A可知，菌株PXO99A在水稻CBB23叶片上的病斑长度只有约2 cm，菌株N3-1在水稻CBB23叶片上的病斑长度为17 cm，菌株N3-1相比PXO99A具有更强的致病性。2.2水稻转录组的数据统计及质量评估RNA-Seq分析样品共9个，包括接种白叶枯病菌0 h的对照组，接48和72 h的试验组（图1-B），每组3个生物学重复。9个样品通过RNA-Seq测序分析，共获得54.63 Gb Clean data。样品平均数据量约为6.07 Gb，测序数据的碱基准确率Q30在94.34%及以上，各样品的Clean reads与参考基因组的比对效率（Mapped reads/Clean read）为92.76%93.32%（表1）。以上结果表明测序的质量和数据量合格，可进行下一步的生物信息学分析。2.3DEGs分析结果菌株N3-1接种48 h与接种0 h相比，水稻的DEGs共2361个，其中上调基因1650个，下调基因711个。接种72 h与接种0 h相比，DEGs共2117个，其中上调基因1440个，下调基因677个。从2个不同时间点与对照组DEGs的火山图可查看基因在2个（组）样品中表达水平的差异，以及差异在统计学上的显著性（图2）。将每组DEGs按要求绘制韦恩图（图3），可获得各比较组间DEGs的数目，以及各比较组间共有的基因数目。与对照组（0 h）相比，接种48 h与72 h共有的DEGs 964个，特有的DEGs分别为1397和1153个，随着时间的变化DEGs会有所不同。2.4DEGs的GO功能注释结果GO功能注释包括3个主要分支，分别是分子功能、生物过程和细胞成分。通过对接种48和72 h两个时间点的GO注释进行分析，发现水稻CBB23在响应白叶枯病菌菌株N3-1侵染过程中DEGs显著富集于芳香族氨基酸的生物合成（GO：0009073），其中DEGs在接种48和72 h均有20个；二萜植物抗毒素前体的合成（GO：0051504），其中DEGs在接种48和72 h均有4个；类黄酮的生物合成（GO：0009813），其中DEGs在接种48 h有23个，在72 h有26个；蛋白磷酸化过程（GO：0006468），其中DEGs在接种48 h有188个，在72 h有198个；谷胱甘肽代谢过程（GO：0006749），其中DEGs在接种48 h有19个，在72 h有13个；在分子样本SampleL01L02L03L04L05L06L07L08L09过滤后的碱基总数Base sum after filter636696746263820775606378938602607228359264715994286402687724627576237661987974746395182632Clean reads总数Total Clean reads425503804270365442685310406069504326870242811996419648184146637242758422比对到参考基因组上的ReadsMapped Reads to reference genome396953623972914339662399377880754033524139836523391428953846568939904194GC含量（%）GC content53.8654.2354.3253.8653.9854.0654.3053.8954.37Q30占比（%）Q30 proportion95.0894.6594.3494.6495.1294.9095.0795.2095.29图 1白叶枯病菌致病性比较与转录组测序不同时间点的水稻叶片Fig.1Comparison of X.oryzae pathogenicity and leaf samplessequenced by fraanscnplome at different time pointsA：野生型菌株N3-1与模式菌株PXO99A侵染水稻CBB23致病力比较；B：不同时间点转录组测序的采样叶片A：Comparison of virulence between wild type strain N3-1 and typestrain PXO99Ain infecting rice CBB23；B：Sampling leaves of tran-scriptome sequencing at different time points表 1测序数据统计Table 1Sequencing data statisticsPXO99AN3-10 h48 h72 hAB3期819功能中DEGs显著富集于蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（GO：0004674），其中DEGs在接种48 h有164个，在72 h有178个；谷胱甘肽转移酶活性（GO：0004364），其中DEGs在接种48 h有20个，在72 h有13个。2.5DEGs的KEGG信号通路KEGG所有通路共注释到4961个基因，其中DEGs数目在48 h有354个，72 h有332个。这些基因共注释到103条通路，2个时间点获得的显著性富集通路共8条。分别是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（ko00400）；氨基酸的生物合成（ko01230）；苯丙素类的生物合成（ko00940）；类黄酮的生物合成（ko00941）；二苯乙烯类、二芳基庚烷和姜酚的生物合成（ko00945）；苯丙氨酸的代谢过程（ko00360）；植物与病原体的相互作用（ko04626）；二萜类的生物合成（ko00904）。图4为DEGs的KEGG通路富集散点图，图中每1个圆表示1个KEGG通路，纵坐标表示通路名称，横坐标为富集因子（Enrichment factor），表示DEGs中注释到某通路的基因比例与所有基因中注释到该通路的基因数与所有基因的比值。富集因子越大，表示DEGs在该通路中的富集水平越显著。圆圈的颜色代表Q值，Q值为多重假设检验校正之后的P值，Q值越小，表示DEGs在该通路中的富集显著性越可靠。圆圈的大小表示通路中富集的基因数目，圆圈越大表示基因数目越多。2.6芳香族氨基酸的生物合成及其次生代谢的KEGG信号通路对芳香族氨基酸的生物合成及其次生代谢的KEGG信号通路进行分析，在KEGG通路图5中可知，由莽草酸途径到分支酸合成各个芳香族氨基酸过程中大部分酶基因的表达均为上调，其中2.7.1.71富集到3个上调基因，分别是Os02g0749300、Os04g0640600和Os06g0225800，均作为莽草酸激酶发挥作用；此外，2.5.1.19富集到1个上调基因Os06g0133900，4.2.3.5富集到1个上调基因Os03g0254800，4.1.3.27富集到1个上调基因Os03g0718000，5.4.99.5富集到2个上调基因Os01g0764400和Os08g0441600。图6为苯丙素类合成的信号通路，其中4.3.1.24富集到5个上调基因，分别是Os02g0626400、Os02g0626532、Os02g0626600、Os02g0627100 和 Os05g0427400，4.3.1.25富集到1个上调基因Os02g0626100，它们作为苯丙氨酸脱氢酶开始芳香族氨基酸的代谢，且检测到其表达显著上调。2.7水稻感病基因和抗病基因分析本研究对水稻CBB23的SWEET家族基因表达图 2水稻CBB23接种白叶枯病菌菌株N3-1的DEGs火山图Fig.2Volcanic map of DEGs of rice CBB23 inoculated with X.oryzae strain N3-1A：接种48 h/0 h DEGs火山图；B：接种72 h/0 h DEGs火山图A：Volcano map of DEGs 48 h/0 h after inoculation；B：Volcano map of DEGs 72 h/0 h after inoculation图 3水稻CBB23接种白叶枯病菌菌株N3-1的DEGs韦恩图Fig.3Venn diagram of DEGs of rice CBB23 inoculated withX.oryzaestrain N3-1S1S2：48 h/0 h的DEGs；S2S3：72 h/48 h的DEGs；S1S3：72 h/0 h的DEGsS1S2：DEGsat 48 h/0 h；S2S3：DEGsat 72 h/48 h；S1S3：DEGsat72 h/0 hABVolcano plot-lgFDR6040200log2Fold Change-505log2Fold Change-50510-lgFDR100500Volcano plotSignificantUpDownNormalSignificantUpDownNormalS1S3S2S3S1S2S1S3S2S3S1S2张宇等：水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析54卷南 方 农 业 学 报 820图 4接种48 h/0 h和72 h/0 h DEGs的KEGG通路富集散点图Fig.4KEGG pathway enrichment bubble diagram of DEGs at 48 h/0 h and 72 h/0 h图 5DEGs参与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成Fig.5DEGs involved in the biosynthesis of phenylalanine，tyrosine and tryptophan图中展示了与DEGs相关的KEGG通路、非完整的KEGG途径。红色文本框代表上调基因The figure showed the KEGG pathway associated with DEGs，the incomplete KEGG pathway.The red text box represented the up-regulated geneAB富集因子 Rich factor富集因子 Rich factorQ valueQ value234523453期821进行分析，发现与对照组（接种0 h）相比，OsSWEET14表达水平显著升高（图7），48 h与72 h分别上调4.37和5.45倍。而与OsSWEET14基因同源的OsSWEET11并没有被诱导表达，其他的感病基因如OsSWEET12、OsSWEET13和OsSWEET15也未检测到明显的差异表达。此外，聚类热图发现OsSWEET16和OsSWEET2a基因的表达趋势与OsSWEET14基因基本一致，这些基因的具体功能还需进一步研究。从广西普通野生稻（Oryza rufipogon）中发现的抗谱广、全生育期抗病、完全显性的Xa23基因，定位图 6DEGs参与苯丙素类的生物合成Fig.6DEGs participated in the biosynthesis of phenylpropanes图中展示了与DEGs相关的KEGG通路、非完整的KEGG途径。红色文本框代表上调基因；蓝色文本框表示既有上调基因又有下调基因The figure showed the KEGG pathway associated with DEGs and the incomplete KEGG pathway.The red text box represented the upregulated gene；blue text boxes indicated both up-regulated and down-regulated genes张宇等：水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析54卷南 方 农 业 学 报 822在水稻11号染色体的长臂上，该基因对有效控制白叶枯病具有重要作用（秦钢等，2008）。本研究结果表明，无论是在48 h还是72 h，水稻CBB23中几乎未检测到Xa23基因的表达。2.8水稻转录因子的表达分析对水稻转录因子的表达进行分析，发现MYB类、bZIP类、WRKY类、AP2/ERF类和NAC类转录因子均有不同程度的表达，且识别到的AP2/ERF类转录因子基因数量最多（图8）。AP2/ERF类转录因子是一个庞大的基因家族，主要参与胁迫信号的交叉途径，是逆境信号交叉途径中的连接因子（Bodduet al.，2006）。其中OsWRKY03与OsWRKY71转录因子基因随着时间的延长而表达持续下调，且OsWRKY03下调水平显著，OsWRKY13的表达并未发生明显变化。在WRKY基因家族中某些基因的表达也会对植物的抗病性起负调控作用。如WRKY72可与茉莉酸（Jasmonic acid，JA）生物合成酶AOS1基因的启动子结合，通过对其甲基化抑制AOS1基因的转录；SAPK10可通过对WRKY72上第129位苏氨酸的磷酸化减弱其与AOS1基因的结合，促进JA的表达，从而增强水稻对Xoo的抗性（Hou et al.，2019）。在本研究中，OsWRKY72基因持续上调表达而SAPK10基因并无差异表达。OsWRKY72的大量表达很可能会加剧水稻对白叶枯病菌菌株N3-1的易感性。OsWRKY45-1和OsWR-KY45-2是一对等位基因，OsWRKY45-1负调控而OsWRKY45-2正调控白叶枯病和细菌性条斑病的抗性（Cheng et al.，2015），本研究中只检测到OsWRKY45-1在72 h下调表达。在WRKY a亚家族中，OsWRKY62和OsWRKY76的过量表达对白叶枯病和稻瘟病起负调控作用，也有报道称OsWRKY76可激活抗病基因OsPR10，从而增强水稻对Xoo的抗性（Liu et al.，2016）。本研究中Os-WRKY62持续上调表达，而OsWRKY76在48 h轻微表达上调后又在72 h发生明显下降（表2）。其他差异较显著的转录因子基因，既包括水稻抗病相关的转录因子基因Os02g0654700，也有导致水稻对白叶枯病易感的转录因子基因Os09g0474000，还有其他如分蘖数、干旱胁迫等相关功能的转录因子基因（表3），这些差异表达显著的转录因子基因在抗病中的具体作用还有待进一步研究。2.9植物病原互作途径通过KEGG分析，分别在2个时间点的植物与病原互作途径中注释到33和18个DEGs。其中钙调蛋白（Calmodulin，CaM）与钙依赖蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinase，CDPK）的表达较明显。富集到的CaM基因包括：Os01g0955100、Os03g0331700、Os03g0743500、Os05g0577500、Os11g0105000 和Os01g0949500，这些基因除Os01g0949500下调外，其余全部上调。CDPK基因包括：Os03g0788500、Os05g0585500、Os07g0568600、Os11g0171500、Os-02g0685900、Os01g0622600、Os02g0126400和Os03g-0808600，这些基因的表达全部为上调。此外，在植物图 7SWEET家族基因的表达模式图Fig.7Diagram of SWEET family genes expression pattern图 8各转录因子家族中转录因子基因数量统计Fig.8The number of transcription factor genes in each tran-scription factor family0 h48 h72 h1.00.50-0.5-1.0050100基因数量 Number of geneRLK-Pelle_DLSVbHLHAP2/ERF-ERFC2H2NACRLK-Pelle_WAKWRKYMYBRLK-Pelle_L-LECbZIPRLK-Pelle_SD-2bRLK-Pelle_LRR-XII-1MYB-relatedOthersC3HB3GRASTRAFRLK-Pelle_LRR-XI-1GARP-G2-like转录因子Transcription factor3期823病原互作途径中还富集到2个病程相关蛋白基因的表达，分别是Os01g0382000基因和Os07g0129200基因。2.10水稻防御相关基因的表达分析在本研究中，通过对防御相关基因的表达趋势进行分析以探究水稻CBB23对白叶枯病菌菌株N3-1的应答反应。其中水稻防御相关基因OsPAL1负责编码苯丙氨酸解氨酶，在本研究中表达上调显著，其结果与GO和KEGG富集结果相似（表4）。2.11MAPK信号通路的响应MAPK（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路包括MAPK激酶的激酶（MAP kinase kinase ki-nase，MKKK）、MAPK 激 酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK，3种激酶依次激活，在病菌侵染植物的过程中发挥重要作用。已报道白叶枯病菌在侵染水稻过程中会诱导OsMPK7与OsMKK3基因的表达，OsMKK3可与OsMPK7结合并使OsMPK7磷酸化，它们的表达可抑制由白叶枯病菌引起的感病反应；OsMPK7蛋白的不表达将会导致水稻对白叶枯病的易感性；并且鉴定出OsWRKY30作为OsMPK7的下游靶标，在白叶枯抗病反应过程中起正调控作基因名称GeneOsWRKY03OsWRKY71OsWRKY13OsWRKY72OsWRKY62OsWRKY76OsWRKY45-1基因IDGene IDOs01g0624700Os02g0181300Os01g0750100Os11g0490900Os09g0417800Os09g0417600Os05g0322900抗白叶枯效应Effect against bacterial blight48 h/0 hlog2Fold Change-0.57-0.37-0.512.491.480.720.1072 h/0 hlog2Fold Change-3.14-1.34-0.472.510.91-1.21-1.13基因名称GeneOsDREB1HOsMYB2OsDREB1GOsEATBOsWRKY7MYB TFOsBIERF3Osmyb2AP2 TFOsbZIP73基因IDGene IDOs09g0522100Os03g0315400Os02g0677300Os09g0457900Os05g0537100Os12g0567300Os02g0654700Os12g0175400Os07g0617000Os09g047400048 h/0 hlog2Fold Change-3.10-2.68-1.87-1.422.142.242.373.423.434.6772 h/0 hlog2Fold Change-5.00-1.73-5.12-3.491.231.511.424.363.595.64类型TypeAP2/EREBPMYBAP2/EREBPAP2/ARFWRKYMYBERFMYBAP2bZIP表 2WRKY抗病相关转录因子基因的表达Table 2Expression of WRKY disease resistance related transcription factor genes表 3差异表达显著的转录因子基因Table 3Significantly differentially expressed transcription factor genes表 4免疫相关基因及其对白叶枯病的作用Table 4Immune-associated genes and their effects on bacterial blightDR：防御相关基因；QTL：数量性状位点DR：Defense-related gene；QTL：Quantitative trait loci基因GeneOsSERK2OsWAK25OsRAR1OsPAL1C3H12GH3-2OsGLP2-1OsMPK6OsPAL4OsNH1GH3-8OsPAD4OsBSR1OsLYP6基因IDGene IDOs04g0457800Os03g0225700Os02g0535400Os02g0626100Os01g0917400Os01g0764800Os02g0532500Os10g0533600Os02g0627100Os01g0194300Os07g0592600Os11g0195500Os09g0533600Os06g0208800类型TypeDRDRDRQTLDRQTLQTLQTLQTLDRQTLDRDRDR抗白叶枯效应Effect against bacterial blight48 h/0 hlog2Fold Change1.261.28-0.132.45-0.611.122.280.921.841.371.751.030.510.4472 h/0 hlog2Fold Change0.981.130.223.47-0.770.272.721.222.720.440.840.260.1-0.43张宇等：水稻响应白叶枯病菌侵染的转录组分析54卷南 方 农 业 学 报 824用（Jalmi and Sinha，2016）。除此之外，OsMAP-K17-1（OsBWMK1）与OsMAPK17-2（OsBIMK2）蛋白也被证实在白叶枯抗病反应中发挥重要作用（Chen et al.，2021）。在本研究菌株N3-1的侵染过程中，OsMKK3和OsMPK7基因均未被诱导表达，Os-MAPK17-1基因在菌株N3-1侵染过程中表达下调，而OsMAPK17-2在侵染72 h表达升高。已报道Os-MAPK4蛋白可通过多种途径参与水稻对白叶枯病的反应，OsMAPK4既可通过增加水杨酸（Salicylicacid，SA）和JA的含量以提高水稻对白叶枯病的抗性，也可通过负调控系统获得性免疫（Systemic ac-quired resistance，SAR）使水稻白叶枯病抗性减弱，使得其可在水稻对Xoo的抗性反应中发挥双重作用（Shen et al.，2010）。在本研究中发现，OsMAPK4基因在接种后表达量有明显上升。2.12qRT-PCR验证为验证RNA-Seq结果的可靠性，随机挑选9 个DEGs进行qRT-PCR验证。上调的DEGs选择Os12g0555200、Os07g0175600、Os01g0963000、Os-02g0191300 和 Os12g0555000，下 调 的 DEGs 选 择Os09g0369400、Os04g0585000、Os01g0812200和Os-02g0527300，内参基因选用-actin；qRT-PCR引物序列及退火温度等见表5。使用RNA-Seq和qRT-PCR的结果作图比较基因表达水平（Livak and Schmittgen，2001），结果（图9）表明，qRT-PCR的验证结果与转录组数据中各基因的表达趋势基本一致。3讨论本研究利用从广西水稻病区分离的白叶枯病菌菌株N3-1接种含有Xa23抗性基因的水稻CBB23，从植物GO功能注释、KEGG通路富集、感病基因和转录因子等方面对转录组数据进行挖掘，阐释水稻CBB23对白叶枯病菌菌株N3-1侵染过程的应答反应。在植物病原微生物互作过程中，关键调控蛋白的磷酸化状态影响着免疫信号的激活。病原微生物可通过干扰宿主蛋白的磷酸化状态来攻击免疫系统，以提高其自身的致病性（刘雅琼和侯岁稳，2019）。目前，在植物免疫途径中研究相对较多的主要有4种激酶，即跨膜的受体激酶（Receptor likekinase，RLK）、胞质内受体激酶（Receptor-like cyto-plasmid kinase，RLCK）、MAPK 和 CDPK。其 中