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吲哚喹啉生物碱衍生物与DNA作用研究
卢宇靖 古练权*基金项目 中山大学化学与化工学院第三届创新化学实验基金项目（批准号：02016）资助
第一作者 卢宇靖（1980年出生），男，中山大学化学与化工学院应用化学专业99级
指导教师 古练权 Email：cesglq@

中山大学化学与化工学院，广州 510275
摘要 通过紫外可见光谱研究了一系列新型的吲哚喹啉生物碱衍生物与DNA的作用方式，表明了该化合物与DNA具有良好的嵌入作用，为该类化合物具有良好的抗肿瘤效果提供了可能的作用机理。
关键词 吲哚喹啉生物碱衍生物 DNA 作用机制 嵌入作用 抗癌药
吲哚喹啉生物碱是自然界比较稀少的生物碱，而quindoline和Cryptolepine (图1) 是这一家族的最好代表，这两个化合物分别在1977年和1929年从西非的植物Cryptolepis sanguinolenta中分离出来[1]。吲哚喹啉生物碱具有广泛的生理特性，包括hypotensive、antipyretic、antimuscarinic、antibacterial、antiviral、antihyperglycemic等等[2]。研究表明Cryptolepine是一种有效的DNA拓扑异构酶II抑制剂，能够抑制B16黑素瘤的DNA合成[3]。

图1
2002年John N. lisgarten 应用单精衍射法研究了Cryptolepine与DNA片断d(CCTAGG)2的作用，发现Cryptolepine以π-π堆积方式嵌入到片断的嘧啶碱基之间，这是第一个小分子与DNA嘧啶-嘧啶不变序列嵌入作用的单晶结构[3]。
临床使用的许多抗癌药物如阿霉素都是与DNA有较强的嵌入作用 [4]。这类DNA嵌入剂抗癌药物能够牢固地，又可逆地嵌入DNA双螺旋，但它们对结构有特定的要求，具有一些共同的结构特征。首先，它们都具有一组或多组非簇状线性稠和芳环（不少于3）。小分子的发色团就有足够的面积进行嵌插结合，而且要求稠环呈平面，易于插入DNA碱基对。但这不能产生充分有效的抗癌活性，即使它具有嵌入作用的能力。如果想有良好的抗癌活性，在小分子发色团的适当位置连上一条（或几条）侧链是很必要的，而且侧链上能够形成正电荷中心；而对正电荷中心的距离、位置和pKa值也有严格的要求[5]。因为带正电荷的侧链从DNA的沟槽接近DNA，刚好能与呈电负性的DNA磷酸骨架通过静电作用。对于中性发色团的小分子，一般有一条（或几条）带正电荷的侧链 [6]；如果发色团本身带正电荷，一般带一条（或几条）位阻较大的侧链（EB，amsacrine）。可以推测，这些侧链对DNA和药物的复合物有额外的稳定作用，同时影响药物与DNA结合的动力学过程[7]。
我们根据上面的理论，以吲哚喹啉生物碱为母体合成了一系列的吲哚喹啉生物碱衍生物，并系统研究了化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ与DNA的相互作用（图2）。

图2
1 实验部分
1.1试剂与仪器
吲哚喹啉生物碱衍生物化合物是根据本实验室的合成方法合成的，均通过NMR、IR、FAB质谱表征，合成的化合物都是色谱纯的。小牛胸腺DNA是Sigma化学公司的产品，其它试剂均为分析纯，是广州试剂一厂的产品。
紫外可见吸收光谱是在UV-2501PC 型紫外光谱仪上测定的；溶液pH值由Orion Model 720A pH计所确定，所用的溶液为双蒸水。
1.2. 实验方法
1.2.1 溶液的配置
（1） 0.1 M pH 7.4 Tris-HCl缓冲溶液配置：向500 mL 0.1 M 三-羟甲基-胺基甲烷水溶液中缓慢滴加0.1 M HCl水溶液，混匀，用pH计调节溶液pH值至7.4。
（2）DNA溶液的配置：称取适量的小牛胸腺DNA溶于缓冲溶液中，抽滤，滤液按需要稀释到一定浓度，测量260nm和280nm处吸收值，经UV谱检验A260/A280＝1.8~1.9，表明基本上不含蛋白质，纯度符合要求。DNA浓度以碱基对摩尔浓度计，测量DNA在260nm处的吸收光度，然后根据260 nm的吸光系数6600M-1 cm-1来确定DNA浓度为1.102×10-3mol/L
（3）样品溶液：称取一定量各种待分析样品成盐后用缓冲溶液定容。
1.2.2吸收光谱滴定
在紫外可见光谱仪中，向参比池中加入缓冲溶液，在样品池中加入同样体积的5×10-5mol L-1的样品溶液。用微量进样器每次往参比池和样品池加入相同体积的DNA溶液，使DNA与样品浓度比值不断增加，直至饱和，样品的吸收峰不再减色。
2 结果与讨论
2.1化合物溶液性质
2.1.1 化合物不同浓度时的存在形式
化合物具有一组或多组稠和芳环，它们在一定浓度时可能通过π－π堆积而形成二聚或多聚，所以我们应用吸收光谱滴定进行观察。在紫外光谱仪中，向参比池中加入一定的缓冲溶液，在样品池中加入一定体积的样品溶液，不断增加样品的浓度，直到饱和，样品的吸收峰不色。
数据处理可知化合物在c≥4.64×10-5 mol L-1 时以双分子形式存在，在c<4.64×10-5 mol L-1 时以单分子形式存在，可以保证在测试条件下，浓度2×10-5 mol L-1 ，该化合物以单分子存在，使得测试条件下真实反映了该化合物与DNA的作用。如果小分子以双分子形式存在，DNA要先拆分小分子，能量耗损，放应出的吸收光谱就有变化。

图3 (a) 化合物I自身随浓度增加的吸收光谱（ pH为7.4）;
(b) 化合物I 摩尔消光系数与浓度对数图
2.1.2化合物不同pH值的存在形式
化合物不同pH值的可见光谱可以从图4数据处理可知，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的pKa值分别为8.3、8.1、8.2、8.3，说明化合物在生理pH即测定条件下,以盐的形式存在。

图4 (a) (b) (c) (d) 化合物I、II、III、IV在不同pH下的吸收光谱图 (e) 化合物IV 吸光度对pH图

2.2几种化合物与DNA分子相互作用
由于紫外-可见吸收光谱法是研究小分子与DNA相互作用机理的最常用、方便的方法之一。通常，吲哚喹啉生物碱衍生物小分子在紫外区有一定的电子吸收。当小分子与DNA结合后，其电子结构会受到DNA的扰动，导致小分子所处的环境发生变化，小分子与DNA的结合强弱可通过光谱变化的幅度反映出来。一般来说，当小分子以嵌入模式与DNA作用时，其吸收光谱会出现一定的减色效应和峰位红移现象。这是因为插入的的小分子与DNA的碱基对发生π电子堆积后，使其π*空轨道与碱基的π电子轨道发生偶合，能级下降，从而导致π→π*跃迁能减少，产生红移现象。同时，偶合后的π轨道因部分填充电子，使跃迁几率减少，产生减色效应。减色效应与小分子插入程度有关，减色效应越明显，吸收峰红移越大，表明插入程度越大。

图5 化合物Ⅰ(a)、Ⅱ(b)、Ⅲ(c)、Ⅳ(d) 与小牛胸腺DNA 相互作用的吸收光谱图

化合物与DNA作用的吸收光谱如图5所示。作用后的相关数据见表1。从图中可见，化合物溶液中加入DNA后都出现不同程度的扰动，化合物的吸收光谱都出现了减色效应，较强的红移现象。这些光谱变化特征表明化合物是以嵌入模式与DNA作用的。
为了定量的比较化合物与DNA结合的强弱，我们通过化合物光谱滴定实验，以最大波长峰吸光度的变化，按照下列方程式计算了化合物与DNA的结合常数Kb[8]。
[DNA]/(εa-εf)=[DNA]/( εb-εf)+1/Kb(εb-εf)
式中[DNA]表示DNA浓度，εa，εf和εb分别表示Aobsd/[化合物]，自由化合物的摩尔吸光系数和完全结合后的化合物的摩尔吸光系数。以[DNA]/(εa-εf)对[DNA]作图，斜率与截距的比值为结合常数Kb，如表1所示。与文献比较，化合物与DNA的结合力较强[9.10]。

表1 化合物与小牛胸腺DNA相互作用的吸收光谱变化

化合物
λmax/nm
红移
Δλ/nm
减色率
%
结合常数
Kb/M-1
自由
结合
303

338
398
414
345
406
425
7
8
11
24.8
38.0
35.7

19.5×104
304

327
355
372
332
364
382
5
9
10
16.1
34.8
33.0

8.4×104
317

336
398
413
338
400
414
2
2
1
14.8
17.6
14.8

17.6×104
318

326
358
377
329
366
384
3
8
7
14.4
32.4
27.0

12.8×104
2.3吲哚喹啉类化合物的抗癌活性测定及研究前景
应用噻唑蓝（MTT）法测定了这4个吲哚喹啉类化合物对体外培养的人鼻咽癌CNE2细胞、人肝癌Bel-7402细胞和人肺腺癌GLC-82细胞的生长抑制率（IR%）。

表2吲哚喹啉化合物对人癌细胞的平均生长抑制率（IR%）
Compound
CNE2
Bel-7402
结果表明4种化合物1.56~6.25mg/ml浓度下对上述3种人癌细胞均有不同程度的抗癌活性，对人癌细胞的均有强的生长抑制作用，生长抑制率均80% ~ 99%范围。3种人癌中，对肺腺癌的作用要比对鼻咽癌和肝癌的作用要强，因其用量较少。
GLC-82

(6.25mg/ml)
(6.25mg/ml)
(1.5625mg/ml)
Compound-1
99.0
96.2
94.8
Compound -2
97.8
95.7
77.1
Compound -3
96.7
93.0
77.8
Compound -4
98.4
96.8
66.6
本实验表明，吲哚喹啉类化合物对体外培养的3种人癌细胞有明显的抗癌活性。我们可以将它作为具有多种功能的抗癌药物来开发。

致谢 本研究是在古练权教授，周金林和郭新东两位博士以及鲍雅丹同学的悉心指导和帮助下完成的，他们对科学严谨的态度和孜孜不倦的精神使我受益菲浅，在此对他们表示衷心的感谢；还要感谢中山大学肿瘤研究所符博士帮忙测试化合物的抗肿瘤活性，以及化工学院创新基金对本实验提供的资助。
参 考 文 献
1 Erwan Arzel, Patrick Rocca, Philippe Grellier, et al. New Synthesis of Benzo-δ-carbolines, Cryptolepines, and Their Salts: In Vitro Cytotoxic, Antiplasmodial, and Antitrypanosomal Activities ofδ-carbolines, Benzo-δ-carbolines, Cryptolepines, and Cryptolepines. J. Med. Chem. 2001,44,949-960
2 Rauwald, H. W., Kober, M.; Mutscher, E, et al. Cryptolepis sanguinolenta: Antimuscarinic Properties of Cryptolepine. Planta Med. 1992, 58, 486-488.
3 John N. Lisgarten, Miquel Coll, Jose Portugal, et al. The antimalarial and cytotoxic drug cryptolepine intercalates into DNA at cytosine-cytosine sites. Nature structural biology, 2002, 9:57~60
4 Frederick C.A., Williams L. D., Ughetto G. et al. Structure comparison of anticancer drug-DNA complexes: adriamycin and daunomycin. Biochemistry, 1990, 29: 2538-2549
5 Graham J. Atwell, Bruce F. Gain, Bruce C. Baguley. et al. Potential Antitumor Agents. 43. Synthesis and Biological Activity of Dibasic 9-Aminoacridine-4-carboxamides, a new Class of Antitumor Agent. J. Med. Chem. 1984,27,1481-1485
6 Zee-Cheng,r.K-Y., Podrebarac, et al. J. Med. Chem. 1979,22,501
7 Feigon,J., Denny, W. A. leupin,W., Kearns, D. R. J. Med. Chem. 1984,27,450
8 James M. Crenshaw, David E. Graves, William A. Denny. Interaction of Acridine Antitumor Agents with DNA: Binding Energies and Groove Preferences, Biochemistry, 1995,34,13682-13687
9 M.S. Ibrahim, Voltammetric studies of the interaction of nogalamycin antitumor drug with DNA. Analytica Chimica Acta. 2001,443,63-72
10 Yuji Mikata, Mika Yokoyama, Shun-ichiro Ogura, et al. Effect of side chain location in (2-aminoethyl)-aminomethyl-2-phenylquinilines as antitumor agents. Bioorganic & Medicinal Chemidtry Letters. 1998, 8, 1243-1248

附：论文中所完成的新化合物涉及本实验室的研究工作以及知识产权，新化合物的知识产权属本实验室所有，特此声明。

Study the Indoloquinoline Alkaloids Interact with DNA by Spectroscopic Methods
Lu Yujing Gu Lianquan*
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Zhongshan University, Guangzhou 510275)
Abstract Absorbance spectroscopy is use to study the interaction of a series of novel indoloquinoline alkaloids derivatives with DNA. The studies show that indoloquinoline alkaloids are good intercalator with DNA, provides a conceivable mechanism for the good anticancer effect of this species of derivatives.
Keywords Indoloquinoline Alkaloids DNA intercalation anticancer agent