微生物实验教案.docx

微 生 物 实 验 教 案
第一部分 基础性实验
实验一 显微镜油镜的使用和细菌形态的观察

一、实验目的
以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、显微镜油镜使用的原理
1普通光学显微镜的基本构造
（1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大, 造成物象。
（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。
2显微镜的放大倍数和分辨率
（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数
（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ：可见光的波长（平均0.55μm）
n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a：镜口角（即入射角）。
3油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料
1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。
2细菌三种形态的玻片染色标本。
3培养12-18h的枯草芽孢杆菌。
四、实验方法与步骤
1染色细菌玻片的油镜观查
（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
（3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。
（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
（6）绘出所观察到的细菌形态图像。
（7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
（8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。
2、活菌制片观察
取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。
五、实验报告
油镜使用的原理
六、思考题
1油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？
2使用油镜时，为什么必须用镜头油？
3镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？
七、实验注意事项
1不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。
3观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。
4观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。
5拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
6显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。

实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色

一、实验目的
1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。
2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理
1 简单染色的原理
大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。
2 革兰氏染色的原理
革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
三、实验材料
1大肠杆菌24h的斜面培养物。
2葡萄球菌24h的斜面培养物。
3简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）
4革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）
5载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
6显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
四、实验方法和步骤
附表1细菌染色法分类

附表2 微生物染色常用染料
A酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。
B碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。
C中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。
D单纯染色：这类染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料
1、简单染色
(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。
(3) 固定:于火焰上通过2—3次。
(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。
（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。
（6）干燥：空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热。
（7）镜检：在油镜下观察细菌形态。
2革兰氏染色
（1）涂片。
（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
（3）媒染：先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。
（5）复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。
（6）镜检：观察染色结果。
五、实验报告
1 革兰氏染色的基本原理和意义
2 革兰氏染色成败的关键
六、思考题
1根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？
2制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
3做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
4当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠?

实验三 细菌的鞭毛染色及其运动观察

一、实验目的
1学习并掌握细菌鞭毛染色的基本方法及观察细菌鞭毛的着生情况。
2用压滴法观察细菌的运动
3用悬滴法观察细菌的运动
二、实验原理
鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0.01-0.02μm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。
三、实验材料
1 菌种：普通变形杆菌斜面菌种
2 鞭毛染色液：A液，B液。
3 0.01％的美蓝水溶液、无菌水，凹玻片、载玻片，盖玻片、香柏油、镊子、酒精灯、擦镜纸、二甲苯、吸水纸等。
四、实验方法
(一) 细菌鞭毛染色
1制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少许备用的菌苔，最好从菌落的边缘取菌苔，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥。
2染色：涂片干燥后滴加A液染3-5分钟，用蒸馏水冲洗，或将残水沥干或用B液冲去残水（注意：一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景很脏）。洗净A液滴加B液后，将玻片在酒精灯上稍加热，使其微冒蒸汽且不干，一般染30-60秒钟。然后用蒸馏水冲洗，自然干燥。
3镜检：镜检时，如未见鞭毛，应在整个涂片上多找几个视野，有时只在部分涂片上染出鞭毛。菌体为深褐色，鞭毛为褐色。
注意点：染色成功的关键主要决定于：(a)菌种活化的情况，即要连续移种几次；(b)菌龄要合适，一般在幼龄时鞭毛情况最好，易于染色；(c) 新鲜的染色液。（d）制片时不能加热固定
（二）细菌运动的观察
1 压滴法
(1) 制备菌液：从幼龄普通变形菌斜面上，挑数环菌放入装有1-2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液。
(2) 取2-3环稀释菌液于洁净载玻片个央，再加入一环0.01％的美蓝水溶液，混匀。
(3) 用镊子夹一洁净的盖玻片，先使其一边接触菌液，然后慢慢地放下盖玻片，这样可防止产生气泡。
(4) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到观察部位，再用高倍镜观察。要区分细菌鞭毛运动和布朗运动，后者只是在原处左右摆动，细菌细胞间有明显位移者，才能判定为有运动性。
2 悬滴法
(1) 取洁净盖玻片，在四周涂少许凡士林。
(2) 在盖玻片中央滴一小滴菌液
(3) 将凹玻片的凹窝向下，使凹窝中心对准盖玻片中央的菌液，轻轻地盖在盖玻片上，使凹玻片与盖玻片粘在一起(注意液滴不得与凹玻片接触)。
(4) 小心将玻片翻转过来，使菌液正好悬在窝的中央。再用火柴棒轻压盖玻片四周使封闭，以防菌液干燥。
(5) 镜检：将光线适当调暗，先用低倍镜找到悬滴的边缘后，再将菌液移至视野中央，换用高倍镜观察，注意细菌是如何运动的，它与分子布朗运动的不同。

五、实验结果和报告
1绘出你所观察到的细菌的形态及鞭毛着生情况。
2试描述你所观察的细菌有无运动性，是如何运动的？
六、思考题
1制片时为什么不能加热固定？
2没有鞭毛的活细菌在光学显微镜下完全不动吗？真实地记录你观察到的现象，并进行解释。

3鞭毛染色的菌种为什么要先连续传几代，并且要采用幼龄菌种?
4根据你的实验体会，哪些因素影响鞭毛染色的效果?如何控制?
5试设计—实验，如何鉴别某种细菌是否能运功，是否有鞭毛，其鞭毛的着生位置。

实验四 细菌的芽孢、荚膜染色
一、实验目的
1掌握细菌的芽孢染色法。
2掌握细菌的荚膜染色法。
二、实验材料
1 枯草芽抱杆菌、褐球固氮菌的斜面菌种。
2 二甲苯、香柏油、蒸馏水、5％孔雀绿水溶液、0.5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)、绘图墨水(用滤纸过滤后备用)、95％乙醇、石炭酸复红染液。
3显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管(1x6.5cm)、烧杯(300mL)、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸。
三、实验方法和步骤
（一）芽孢染色法
1方法1
(1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。
(2) 于载片上滴入3-5滴5％孔雀绿水溶液。
(3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4-5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。
(4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
(5) 用0．5％沙黄水溶液(或0.05％碱性复红)复染1min，水洗。
(6) 制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。
2 方法2
(1) 加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养18-24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌液。
(2) 加5％孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
(3)将此试管浸于沸水浴(烧杯)中，加热15-20min。
(4)用接种环从试管底部挑数环菌于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，将涂片通过微火3次固定。
(5)水洗，至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
(6)加沙黄水溶液，染2-3min后，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
(7)干燥后用油镜观察。芽孢绿色，菌体红色。
(二)荚膜染色法
1石炭酸复红染色
（1）取培养了72h的褐球固氮菌制成涂片，自然干燥(不可用火焰烘干)。
(2)滴入1-2滴95％乙醇固定(不可加热固定)。
(3)加石炭酸复红染液染色1-2min，水洗，自然干燥。
(4)在载玻片一端加一滴墨汁，另取一张边缘光滑的载玻片与墨汁接触，涂成均匀的薄层，自然干燥。
(5)干燥后用油镜观察。菌体红色，荚膜无色，背景黑色。2背景染色
（1）先加1滴墨水于洁净的玻片上，并挑少量褐球固氮菌与之充分混合均匀。
(2)放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸收多余的菌液。
(3)干燥后用油镜观察。背景黑色，菌体较暗。在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。
四、实验报告
(一)绘图
1枯草芽孢杆菌的芽孢形态，芽孢的着生位置。
2褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。
(二)试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜?
五、问题和思考
1为什么芽孢染色要加热？为什么芽孢及营养体能染成不同的颜色?
2组成荚膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，为什么?
3试设汁实验如何鉴定果一产芽孢菌株的芽孢形态、着生位置及所属分类地位。

实验五 放线菌的形态观察
一、实验目的
1辨认放线菌的基本结构：营养菌丝、气生菌丝、孢子丝、孢子的形态；
2用水封片法、玻璃纸法、印片法观察放线菌的形态特征。
二、实验材料
1细黄链霉菌的平皿培养物，棘孢小单孢菌的玻璃纸平皿培养物。
2 0.1％美蓝染色液、石炭酸复红染色液。
3盖玻片、载玻片、镊子、接种环、显微镜、涂布器、玻璃纸、打孔器。
三、实验方法和步骤
(一) 观察自然生长状态的放线菌
用镊子小心取出用插片法培养的细黄链霉菌皿中的一张盖玻片，将其背面附着的菌丝体擦干净，然历将长有菌的一面向上放在洁净的载玻片上，用低倍镜、高倍镜观察。找出3类菌丝及其分生孢子，注意放线菌的基内曲丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。
(二) 水封片观察
取一滴美蓝染色液置于载玻片中央，将用搭片法培养的棘孢小单孢菌培养皿中的盖玻片取出，并将有菌的面朝下，放在载玻片上，浸在染色液中。制成水封片，用高倍镜观察其中个分生孢子及其基内菌丝。
（三） 玻璃纸法的镜检观察
1直接玻璃纸观察 分别用细黄链霉菌和棘孢小单孢菌的玻璃纸制片观察。制片时，于载玻片上放一小滴蒸馏水，将含菌玻璃纸片小心剪下一小块，移至载玻片上，并使有菌面向上。在玻璃纸与载玻片间不能有气泡，以免影响观察。将制片于显微镜下观察，先用低倍镜观察菌的立体生长状况、再用高倍镜仔细观察。注意区分黄链霉菌的基内菌丝、气生菌丝和弯曲状或螺旋状的孢子丝。观察棘孢小单孢菌时注意把视野调暗，其基内菌丝纤细发亮，其单个分生孢子发暗，直接生长在基内菌丝长出的小梗上。
2 印片染色法观察 用镊子取洁净载玻片并微微加热，然后用这微热载玻片盖在长有黄链霉菌或棘孢小单孢菌的平皿并轻轻压一下，注意将载玻片垂直放下和取出，以防载玻片水平移动而破坏放线菌的自然形态，反转有印痕的载玻片微微加热固定，用石炭酸复红染色1min，水洗，晾干。用油镜观察。
四、实验结果和报告
l 绘图 玻璃纸法、水封片法、印片法及自然生长状态下观察的；
2 试比较细黄链霉菌与棘孢小单孢菌特征的异同。
五、问题和思考
l 在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?
2用插片法和搭片法如何制备放线菌标本，其主要优点是什么?
实验六 霉菌的形态观察
一、实验目的
1 掌握微生物载玻片湿室培养方法。
2 曲霉、青霉、根霉、毛霉形态观察。
3 根霉假根的观察。
二、实验材料
1 产黄青霉、黑曲霉、黑根霉、总状毛霉等斜面菌种。
2 半固体PDA培养基、乳酸苯酚固定液、棉蓝染色液、20％甘油。
3 透明胶带、剪刀、培养皿、载玻片、门形玻棒搁架、盖玻片、圆形滤纸片、接种环。
三、实验方法和步骤
(一)霉菌的载玻片湿室培养
1准备湿室：在培养皿底铺一张圆形滤纸片，其上放一“门”形载玻片搁架，在搁架上放一块载玻片和两块盖玻片，盖上皿盖，外用纸包扎。经12l℃湿热灭菌30min后，置60℃烘箱中烘干，备用。
2取菌接种：用接种环挑取少量待观察的霉菌孢子至湿室内的载玻片上，每张载玻片可接同一菌种的孢子两处。接种时只要将带菌的接种环在载玻片上轻轻碰几下即可(务必记住接种的位置)。
3 加培养基 用无菌细口滴管吸取少量融化约60℃的培养基，滴加到载玻片的接种处。培养基应滴得圆而薄，其直径约为0.5cm(滴加量一般以1/2小滴为宜)。
4加盖玻片 在培养基未彻底凝固前，用无菌镊子将皿内盖玻片盖在琼脂块薄层上，用镊子轻压。使盖玻片和载玻片间的距离相当接近，但不能压扁．否则不透气。
5 倒保湿剂 每皿倒人约3mL 20％的无菌甘油，使皿内的滤纸完全润滑，以保持皿内湿度。皿盖上注明菌名、组别和接种日期；此为制成的载玻片湿室，置28℃恒温培养3-5天。
(二)黑根霉假根的培养
将融化的PDA培养基，冷却至50℃倒入无菌平皿，其量约为半皿高度的1/2、冷凝后，用接种环沾取根霉孢子，在平板表面划线接种。然后将平皿倒置，在盖内放一无菌载玻片，于28℃培养2-3天后，可见根霉的气生菌丝倒挂成胡须状，有许多菌丝与载玻片接触，并在载玻片上分化出假根和匍匐菌丝等结构。
(三)镜检观察
1 湿室培养霉菌镜检载玻片 从培养16-20h开始，通过连续观察，可了解孢子的萌发、曲丝体的生长分化和子实体的形成过程。将湿室内的载玻片取出，直接置于低倍镜和高倍镜下观察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形态，重点观察菌丝是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特点，曲霉的足细胞，根霉和毛霉的孢子囊和泡囊孢子。
2 粘片观察 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段透明胶带，打开霉菌平板培养物取菌体，粘面朝下，放在染液上。镜检。
3假根观察 将培养根霉假根的平皿打开，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的一面盖上盖玻片，置显微镜下观察。只要用低倍镜就能观察到假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐菌丝，观察时注意调节焦距以看清各种构造。
4制成永久装片 把观察到霉菌形态较清晰，完整的片子，制成标本作较长期保存。制备方法是，轻轻揭去盖玻片，如果载玻片上有琼脂，仔细挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，盖上清洁盖玻片，在盖玻片四周滴加树胶封固。
四、实验结果和报告
绘制并标注镜几种霉菌镜检形态图
五、问题和思考
1 什么叫载玻片湿室培养，它适用于观察怎样的微生物，有何优点?
2 湿室培养时为何用20％甘油作保湿剂？
3 本实验中观察假根的设计原理是什么？此设计还适合于培养哪类菌？
六、注意事项
载玻片湿室培养时，盖玻片不能紧贴载玻片，要彼此有极小缝隙。结构平行排列，易于观察。

实验七 酵母形态观察和大小测定
一、实验目的
1了解自然存在的酵母菌及其形态结构。
2了解酵母菌产生子囊泡子的条件及其形态。
3了解酵母菌死活的判别方法。
4以酵母菌为例，学会测微尺的使用和计算方法及对微生物细胞大小的测定方法。
二、实验材料
1 酿酒酵母、热带假丝酵母斜面菌种。
2 PDA培养基、麦氏培养基（醋酸钠培养基）。
3 0.05%美蓝染色液(以pH6.0的0.02%mol/L磷酸缓冲液配制)、碘液、0.04%中性红染色液、5％孔雀绿、0.5%的沙黄液、95％乙醇。
4 显微镜、载玻片、擦镜纸、孟玻片、接种环、v形玻璃棒、放置一个三角形玻璃棒支架的培养皿。
5 目镜测微尺、镜台测微尺。
三、实验方法与步骤
(一)酵母菌形态观察
1酵母菌的活体染色观察及死亡率的测定
(1)以无菌水洗下PDA斜面培养的酿酒醉母菌苔，制成菌悬液。
(2)取0.05％美蓝染色液1滴，置载玻片中央，并用接种环取酵母菌悬液与染色液混匀，染色3min，加盖玻片，在高倍镜下观察酵母菌个体形态，区分其母细胞与芽体，区分死细胞(蓝色)与活细胞(不着色)。
2酵母菌液泡系的活体观察 于洁净载玻片中央加一滴中性红染色液，取少许上述酵母菌悬液与之混合，染色5min，加盖玻片在胶微镜下观察。细胞无色，液泡呈红色。
3 酵母菌细胞中肝糖粒的观察 将1滴碘液置于载破片中央，接入上述酵母菌悬液，混匀，盖上盖玻片，显微镜观察，细胞内的贮藏物质肝糖颗粒呈深红色。
4 酵母菌子囊孢子的观察
挑取产孢菌苔→涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检→计数。
(1)活化酿酒酵母：将酿酒酵母按种至新鲜的麦芽汁培养基上，置28培养2-3天，然后再移接2-3次。
(2)移接产孢培养基：将活化的酿洒酵母移接至醋酸钠培养基上，置30℃恒温培养14天。
(3)观察：挑取少许产孢菌苔于载玻片的水滴上，经涂片、热固定后，加数滴孔雀绿，1min后水洗，加95％乙醇30s，水洗，最后用0.5％沙黄液复染30s，水洗去染色液，最后用吸水纸吸干。制片干燥后，镜检，子囊孢子呈绿色，子囊为粉红色。注意观察子囊孢子的数目、形状和子囊的形成率。
(4)计算子囊形成的百分率：计数时随机取3个视野，分别计数产子囊孢子的子囊数和不产孢子的细胞，然后按下列公式计算：

5 酵母菌假菌丝的观察 取一无菌载玻片浸于溶化的PDA培养基中，取出放在湿室培养的支架上，待培养基凝固后，进行酵母菌划线接种，然后将无菌盖玻片盖在接菌线上，培养2-3天后，取出载玻片，擦去载玻片周围的培养基，在显微镜下直接观察。可见到芽殖酵母形成的藕节状假菌丝，裂殖酵母则形成竹节状假菌丝。
酵母菌假菌丝的观察：取出长有假菌丝的载玻片，擦去载玻片周围的培养基，放在再拨片载玻片上，在显微镜下直接观察。
（二）酵母大小的测定
l 测微尺的构造：显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成，目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm刻尺上分50份。目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。（测微尺的构造）
镜台测微尺为一专用中央有精确等分线的载玻片，一般将长为1mm的直线等分成100个小格，每格长0.01mm，是专用于校正目镜测微尺每格长度的。
2目镜测微尺的标定：把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放入目镜的隔板上，使有刻度的一面朝下。将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有到度的一面朝上。先用低倍镜观察，调焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转功目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺左边的一条线重合，向右寻找另外一条两尺相重合的直线。（目镜测微尺的标定）
3计算方法
菌体的大小=目镜测微尺下菌占的格数×目镜测微尺没格的标定值。
4酵母菌大小的测定 将镜台测微尺取下，换上酿酒酵母菌玻片标本，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺测量菌体的大小。先量出菌体的长和宽占目镜测微尺的格数，再以目镜测微尺每格的长度计算出菌体的长和宽。并详细记录于表中，最后，求出平均值，才能代表该菌的大小。（酵母菌大小的测定）
四、实验结果与报告

五、问题和思考
1 为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时必须重新用镜台测微尺对目镜测微尺进行标定?
2若目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变物镜，那么目镜测微尺每格所测量的镜台上的菌体细胞的实际长度(或宽度)是否相同?为什么?
六、注意事项
1镜台测微尺的玻片很薄，在标定油镜头时，要格外注意，以免压碎镜台测微尺或损坏镜头。
2标定目镜测微尺时要注意淮确对正目镜测微尺与镜台测微尺的重合线。目镜测微尺、镜台测微尺的显微镜下示范。

实验八 细菌的生理生化反应
一、实验目的
1了解细菌鉴定中常用的主要生理生化反应实验法及其原理。
2比较4种菌的V.P反应结果。
3比较4种菌的甲基红反应结果。
4比较4种菌的吲哚反应结果。
5学习使用杜氏小管进行糖发酵试验，并比较3种菌的糖发酵试验结果。
二、实验材料
1大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌的斜面菌种。
2葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基(葡萄糖、乳糖或蔗糖)。
3 40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6％溴甲酚紫指示剂。
4超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。
三、实验方法与步骤
(一) V.P反应
1 试管标记：以5支装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆和空白对照。
2接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照不接菌。置37℃恒温培养箱中，培养24-48h。
3观察记录：取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入3-5mL以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10-20滴，并用牙签挑入约0.5-1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，放在37℃恒温箱中保温15-30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应(用“+”表示)；若不呈红色，则记录为V.P.试验阴性反应(用“-”表示)
注意：原试管中留下的培养液供作甲基红试验用。
(二)甲基红试验(M.R.试验)
于V.P.试验留下的培养液中，各加入2-3滴甲基红试指示剂，注意沿壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，则为阳性反应；若仍成黄色，则为阴性反应。
(三)吲哚试验
1试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
2接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24-48h。
3观察记录：在培养基中加入乙醚1-2ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂(加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)，如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应。否则为阴性反应。阳性用“+”表示，阴性用“-”表示。
(四) 糖发酵试验
原理：可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫指示剂
(即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，6.8以上呈紫色)，经培养后根据指示剂的颜色变化来判断是否产气，可在发酵培养基中放人倒置杜氏小管观察。
1试管标记：取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
2接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中，置37℃恒温箱中分别培养24h、48h和72h观察结果。
3观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原有颜包，其反应结果为阴性，表明该种菌不能利用该种糖，记录用“-”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气．记录用“▲”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“▽”表示。
四、实验结果和报告
1细菌的生理生化反比试验测定结果。
2 在V.P.反应中加入NaOH溶液和肌酸，在吲哚试验中加入乙醚，它们各有什么作用？

五、问题与思考
1以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其原理是什么?
2细菌生理生化反应试验中，为什么要设空白对照?
3现分离到一株肠道细菌，试结合本实验学到的知识设计一个实验方案进行鉴别。
六 演 示
1 杜氏小管倒置装入培养液管中不残留气泡的操作过程。
2 分别显示、甲基红试验、吲哚试验和糖发酵试验培养液阳性反应和阴性反应结果的颜色变化情况。
七、注意事项
1 V.P．反应中加入NaOH溶液和肌酸后要反复振荡试管，使空气中氧溶入培养液中。
2甲基红试验中，不要过多滴加甲基红指示别，以免出现假阳性反应。
3 吲哚试验中宜选用色氨酸含量高的蛋白胨(用胰蛋白酶水解酪素，得到的蛋白胨中色氨酸含量较高)配制蛋白胨水培养基，否则将影响产吲哚的阳性率，在加入吲哚试剂后切勿摇动试管以免破坏乙醚层而影响结果。
4在糖发酵试验的培养管中装入倒置杜氏小管时，注意防止小管内有残留气泡。灭菌时适当延长煮沸时间可除去管内气泡。

实验九 培养基的配制
一、实验目的
1学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤
2学会实验室灭菌锅的使用方法
二、实验材料
1牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1mol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4.·7H2O。
2试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。
3 灭菌锅
三、实验方法
(一)牛肉膏蛋白胨培养基的配制
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：
牛肉膏3g，蛋白胨10g．NaCl5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH7.4-7.6。
1称药品：按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2加热溶解：在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。
3调PH：检测培养基的PH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol/L HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4过滤：液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
5分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免培养基沾在管口或瓶口上面造成污染。
分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/4为宜，灭菌后垂直待凝。
6加棉塞：试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通汽的作用。要使棉塞总长约3／5塞人试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7包扎：加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把试管扎成捆后，再于棉塞外包一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8灭菌：将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放人冰箱内暂存。
9摆斜面：灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，使斜度的长度不超过试管总长度的1/2。
10无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24-48h，无菌生长即可使用。或储存于冰箱清洁的橱内，备用。
(二) 高氏1号培养基的配制
高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：
可溶性淀粉20g，KNO31g、NaCl 0.5g、K2HPO4.3H2O0.5g、MgSO4·7H2O0.5g、FeSO4.7H2O0.01g，琼脂l5-20g，水1000ml，pH 7.4-7.6。
1 称量和溶解：先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2 PH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
(三)马丁氏培养基的配制
马丁氏培养基是用于分离真菌的选择培养基。其配方如下：
K2HPO4.3H2O1g、MgSO4·7H2O0.5g、蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15-20g，水1000ml，自然pH。
1称量和溶解：先计算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需要的水中。待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积。再将孟加拉红配成1％的水溶液，在1000ml培养液中加人以上孟加抗红溶液3.3ml，混匀后，加入琼脂加热融化，方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
2分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋自胨培养基配制。
3链霉素的加入：链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1％的溶液(配好的链霉素溶液保存扩-20℃)，在100mL培养基中加1％链霉素0.3mL，使每毫升培养基中含链霉素30ug。
四、实验结果和报告
记录本实验配制培养第的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。
五、问题和思考
1配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么?
2培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？如何进行无菌检查，
3试设计实验对饮料进行无菌检查。
六、演示
1培养基的分装方法。
2试管斜面的搁置方法
七、注意事项
称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调PH时要小心操作，避免回调。不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

实验十 土壤的稀释、分离、纯化及无菌操作技术
一、实验目的和内容
1学习从上壤中分离微生物的方法，学习无菌操作技术。
2用稀释法分离细菌、放线茵和霉菌。
3用平板划线法分离微生物。
4学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、实验材料
1金黄色葡萄球菌和普通变形菌斜面菌种。
2已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各1瓶。
3无菌培养皿12套、无菌EP管10支、土壤样品、天平、称量纸、药匙、试管架、记号笔、涂布器、1000ul移液器、200ul移液器、20ul移液器、1000ul枪头、200ul枪头、20ul枪头。
4无菌水(49.5mL、带玻璃珠) 1瓶、80％乳酸、10％酚液、95％乙醇。
三、实验方法
(一)土壤稀释分离
1取土壤：取表层以下5-10ml处的土样．放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2制备稀释液
(1)制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒人带玻璃珠的无菌水瓶中，振荡5-10min,使土壤充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
(2)梯度稀释：用移液器吸10-2的土壤悬液100ul，放入装有900ul无菌水的EP管中，上下颠倒数次，即为10-3的稀释液，如此重复，可依次制成10-3-10-8的稀释液。
注意：每一个稀释度换用一支枪头。
3混菌法测定菌落数的方法
(1)细菌：取10-7、10-6两管稀释液各400ul，分别接入相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒人以上培养皿中(装量以铺满皿底的2／3为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿平皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。倒平板时要注意无菌操作。
(2)放线菌：取10-5、10-4两管稀释液，在每管中加入10％酚液50ul，摇匀，静置片到，然后分别从两管中吸出400ul加入相应标号的平皿中，选