土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法.docx

土壤酶活性及微生物测定
土壤酶活性测定
取样工具及取样方法
在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。
所需试剂：
酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、

配置方法：
铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中
酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。

测定方法
磷酸酶活性测定
一、 试验原理
土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。
二、 实验仪器
恒温箱、分光光度计、
三、 实验药品
甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、

四、 实验步骤
取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液）。仔细混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤，用5毫升水代替基质以设置对照。为了测定反应混合物中的酚量，取1毫升滤液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸缓冲液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，摇动，溶液呈粉红色，然后再加水定容，待颜色褪到稳定时（约需20~30分钟），在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度，根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示。

脲酶活性测定
一、 试验原理
土壤的脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。根基土壤可测得最大的脲酶活性，人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。
二、 实验仪器
锥形瓶、定性滤纸、震荡器、分光光度计、1mm筛、

三、 实验药品
酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、铵态氮标准溶液、双蒸水

四、 实验步骤
1、 准确称取10.00g过1mm筛的风干土样，置于150mL锥形瓶中，注入50mL20%的NaCl溶液，将瓶塞紧，在振荡30min(120r/min)后，用定性滤纸过滤。
2、 取20mL滤液于50mL容量瓶中，加双蒸水稀释至40mL左右，加2mL25%酒石酸钠，充分摇动静置5min，使其与Cd，Mg离子络合；
3、 再加入10滴1%阿拉伯胶，摇动后加2mL纳氏试剂，边加边摇，定容至刻度，5min后用490nm比色，配制铵态氮标准溶液，绘制标准曲线，比色后求算土壤脲酶活性。
4、 结果分析

滴定法测定过氧化氢酶活性
一、 试验原理
土壤的过氧化物酶活性，与土壤的呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映土壤微生物过程的强度。根际土壤的过氧化物酶活性，远较根际外土壤为高。有机质含量高的土壤，过氧化氢酶活性较强。因此，土壤过氧化物酶的活性可以表征土壤总的生物学活性和肥力状况。
本试验采用滴定法测定过氧化氢酶活性，即通过定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量。
二、 实验仪器
致密滤纸、酸式滴定管、1mm筛
三、 实验药品
双蒸馏水、H2SO4、过氧化氢、KMnO4、

四、 实验步骤
准确称取5.00g过1mm筛的风干土样，置于150mL锥形瓶中，注入40mL双蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢，另设对照，塞紧瓶盖，振荡30min(120r/min)后，注入5mL1.5mol/LH2SO4终止反应，用致密滤纸过滤，取滤液25mL，用0.1mol/LKMnO4滴定至微红色。土壤的过氧化氢酶活性，用100g土重的0.1mol/LKMnO4毫升数表示。

土壤微生物检测
一、取样工具
无菌刮铲、土样采集器、镊子、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。

二、采土方式：
在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品立即进行处理或放在4℃冰箱中暂存。
三、所需培养基及配置方法
1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）
    牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。
2、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用）
    可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 .7H2O 0.5g，FeSO4  0.01g，琼脂20g，水 1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。121℃灭菌20min。
3、无氮培养基（自身固氮菌、钾细菌）
  甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 0.2g，CaCO3 5g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，113℃灭菌30min。
4、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）
    葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，1/3000孟加拉红（rosebengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂15～20g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30µg。
5、 蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl 0.25g，琼脂18克，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01克，水1000毫升，pH7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。
四、所需药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4 、  甘露醇（或葡萄糖）、CaSO4·2H2O、CaCO3、孟加拉红、链霉素
五、检测方法
土壤中放线菌的检测
一、 试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测放线菌
二、 实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶
高氏一号培养基
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4  0.01g，琼脂20g，水 1000ml，pH7.2～7.4。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。121℃灭菌20min。
三、 实验步骤
1、 在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
2、 倒人45℃恒温水浴的灭菌高氏l号培养基，水平放置，凝固待用；分别无菌吸取各样品10-4、10-5、10-6、10-7稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，用玻璃涂布棒涂抹均匀，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多
3、 培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

土壤中细菌的检测
一、 试验原理
应用稀释平板法从土壤中分离细菌
二、 实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶
牛肉膏蛋白胨培养基
    牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl   5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。
三、 实验步骤
1、 在超净工作台中，无菌称取所取土样10 g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45℃恒温水浴的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定）
3、待培养基凝固后，将平皿倒置于37℃恒温培养箱中培养。
4、培养24h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

土壤中真菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测真菌
二、实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）
    葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，1/3000孟加拉红（rose bengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂15～20g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30µg。（链霉素在培养基融化并冷却至50摄氏度时加入，用剩的链霉素在冰箱可保存4个月，但每过一月，在1升培养基中需多加0.1ml）。
三、实验步骤
1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-2、10-3、10-4、10-5稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45℃恒温水浴的灭菌马丁氏（Martin）琼脂培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定）
3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

土壤中自身固氮菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。
二、实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
无氮培养基
  甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4·2H2O 5g，CaCO3 1000ml，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，113℃灭菌30min。
三、实验步骤
1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10 g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45℃恒温水浴的灭菌无氮培养基，混匀。（稀释倍数视情况而定）
3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

土壤中氨化细菌的检测
一、试验原理
应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。
二、实验仪器及试剂
7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水
蛋白胨琼脂培养基
蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl 0.25g，琼脂18克，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01克，水1000毫升，pH7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。
三、实验步骤
1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)
2、分别无菌吸取各样品10-6、10-7、10-8、10-9稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45℃恒温水浴的灭菌蛋白胨琼脂培养基，混匀。（稀释倍数视情况而定）
3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。
4、培养48h-72h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。
每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。
试剂购买
序号
试剂名称
规格
需要数量（单位：瓶）
实验室现有药品
备注
1
牛肉膏
500g/瓶
1瓶
有

未特别注明，所用化学试剂均为分析纯
2
蛋白胨
500g/瓶
2瓶

3
琼脂
500g/瓶
4

4
可溶性淀粉
500g/瓶
2

5
葡萄糖
500g/瓶
3

6
氯化钠
500g/瓶
1
有
7
硝酸钾
100g
1
有
8
磷酸氢二钾
500g
1
有
9
7水硫酸镁
500g/瓶
1
有
10
硫酸亚铁
500g/瓶
1
有
11
2水硫酸钙
500g/瓶
1
有
12
碳酸钙
250g/瓶
1
有
13

14
孟加拉红

最小包装

15
链霉素
25g/瓶
1

16
酒石酸钠
100g/瓶
1

17
阿拉伯胶
100g/瓶
1

18
碘化钾
50g/瓶
1
有
19
氯化汞
50g/瓶
1

20
氢氧化钾
500g/瓶
1

21
硫酸铵
500g/瓶
1

22
甲苯

200ml左右

23
苯磷酸二钠

10g左右

24
NaAc.3H2O
500g/瓶
1

25
乙酸
500ml/瓶
1
有
26
酚
100g/瓶
1
有
27
铁氰化钾
100g/瓶
1

28
4-氨基安替吡啉
25g/瓶
1

29
硼酸
500ml/瓶
1
有
30
硼砂
500g/瓶
1

31
三氯乙酸
500g/瓶
1

32
硫代巴比妥酸（TBA）

最小包装

33
丙酮
500ml/瓶
1
有
34
氮蓝四唑
100mg/瓶
1

35

36