土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法.docx

土壤酶活性及微生物测定土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。土样在自然条件下烘干装入袋中备用。所需试剂： 酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵(NH4)2SO4、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、配置方法： 铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵(NH4)2SO4溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100g N。往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。 醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。测定方法磷酸酶活性测定一、 试验原理土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。实验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物质的矿化起着主要作用；土壤的磷酸酶活性，在很大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况。二、 实验仪器恒温箱、分光光度计、三、 实验药品甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、四、 实验步骤取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液）。仔细混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤，用5毫升水代替基质以设置对照。为了测定反应混合物中的酚量，取1毫升滤液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸缓冲液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，摇动，溶液呈粉红色，然后再加水定容，待颜色褪到稳定时（约需2030分钟），在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度，根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示。脲酶活性测定一、 试验原理 土壤的脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。根基土壤可测得最大的脲酶活性，人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。二、 实验仪器锥形瓶、定性滤纸、震荡器、分光光度计、1mm筛、三、 实验药品酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、铵态氮标准溶液、双蒸水四、 实验步骤1、 准确称取10.00g过1mm筛的风干土样，置于150mL锥形瓶中，注入50mL20%的NaCl溶液，将瓶塞紧，在振荡30min(120r/min)后，用定性滤纸过滤。2、 取20mL滤液于50mL容量瓶中，加双蒸水稀释至40mL左右，加2mL25%酒石酸钠，充分摇动静置5min，使其与Cd，Mg离子络合；3、 再加入10滴1%阿拉伯胶，摇动后加2mL纳氏试剂，边加边摇，定容至刻度，5min后用490nm比色，配制铵态氮标准溶液，绘制标准曲线，比色后求算土壤脲酶活性。4、 结果分析滴定法测定过氧化氢酶活性一、 试验原理土壤的过氧化物酶活性，与土壤的呼吸强度和土壤微生物活动相关，在一定程度上反映土壤微生物过程的强度。根际土壤的过氧化物酶活性，远较根际外土壤为高。有机质含量高的土壤，过氧化氢酶活性较强。因此，土壤过氧化物酶的活性可以表征土壤总的生物学活性和肥力状况。本试验采用滴定法测定过氧化氢酶活性，即通过定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量。二、 实验仪器致密滤纸、酸式滴定管、1mm筛三、 实验药品双蒸馏水、H2SO4、过氧化氢、KMnO4、四、 实验步骤准确称取5.00g过1mm筛的风干土样，置于150mL锥形瓶中，注入40mL双蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢，另设对照，塞紧瓶盖，振荡30min(120r/min)后，注入5mL1.5mol/LH2SO4终止反应，用致密滤纸过滤，取滤液25mL，用0.1mol/LKMnO4滴定至微红色。土壤的过氧化氢酶活性，用100g土重的0.1mol/LKMnO4毫升数表示。土壤微生物检测一、取样工具无菌刮铲、土样采集器、镊子、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。二、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品立即进行处理或放在4冰箱中暂存。三、所需培养基及配置方法1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用） 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂1520g，水1000ml，pH7.07.2，121灭菌20min。2、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用） 可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.27.4。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。121灭菌20min。3、无氮培养基（自身固氮菌、钾细菌）甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO4 0.2g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO42H2O 0.2g，CaCO3 5g，蒸馏水1000ml，pH7.07.2，113灭菌30min。4、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用） 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1/3000孟加拉红（rosebengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂1520g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30g。5、 蛋白胨琼脂培养基 蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl 0.25g，琼脂18克，MgSO47H2O 0.5g，FeSO4 0.01克，水1000毫升，pH7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。四、所需药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4、甘露醇（或葡萄糖）、CaSO42H2O、CaCO3、孟加拉红、链霉素五、检测方法土壤中放线菌的检测一、 试验原理应用稀释平板法从土壤中检测放线菌二、 实验仪器及试剂7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶高氏一号培养基可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.27.4。配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。121灭菌20min。三、 实验步骤1、 在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)2、 倒人45恒温水浴的灭菌高氏l号培养基，水平放置，凝固待用；分别无菌吸取各样品10-4、10-5、10-6、10-7稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，用玻璃涂布棒涂抹均匀，将平皿倒置于28恒温培养箱中培养。放线菌的培养时间较长，故制平板的培养基用量可适当增多3、 培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数。土壤中细菌的检测一、 试验原理应用稀释平板法从土壤中分离细菌二、 实验仪器及试剂7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂1520g，水1000ml，pH7.07.2，121灭菌20min。三、 实验步骤1、 在超净工作台中，无菌称取所取土样10 g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45恒温水浴的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定）3、待培养基凝固后，将平皿倒置于37恒温培养箱中培养。4、培养24h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数。土壤中真菌的检测一、试验原理应用稀释平板法从土壤中检测真菌二、实验仪器及试剂7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用） 葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO4 1g，MgSO47H2O 0.5g，1/3000孟加拉红（rose bengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂1520g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30g。（链霉素在培养基融化并冷却至50摄氏度时加入，用剩的链霉素在冰箱可保存4个月，但每过一月，在1升培养基中需多加0.1ml）。三、实验步骤1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)2、分别无菌吸取各样品10-2、10-3、10-4、10-5稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45恒温水浴的灭菌马丁氏（Martin）琼脂培养基，混匀。（稀释倍数是情况而定）3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28恒温培养箱中培养。4、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数。土壤中自身固氮菌的检测一、试验原理应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。二、实验仪器及试剂7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水无氮培养基甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO4 0.2g，MgSO47H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO42H2O 5g，CaCO3 1000ml，蒸馏水1000ml，pH7.07.2，113灭菌30min。三、实验步骤1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10 g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45恒温水浴的灭菌无氮培养基，混匀。（稀释倍数视情况而定）3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28恒温培养箱中培养。4、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数。土壤中氨化细菌的检测一、试验原理应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。二、实验仪器及试剂7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水蛋白胨琼脂培养基 蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl 0.25g，琼脂18克，MgSO47H2O 0.5g，FeSO4 0.01克，水1000毫升，pH7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。三、实验步骤1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。如此操作，一直到10-10。稀释。(另外，要知道所称土样的含水量)2、分别无菌吸取各样品10-6、10-7、10-8、10-9稀释液，加入灭菌平皿中(每稀释度3皿，每皿lml)，倒人45恒温水浴的灭菌蛋白胨琼脂培养基，混匀。（稀释倍数视情况而定）3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28恒温培养箱中培养。4、培养48h-72h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行计算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。 每克土壤中菌落形成单位同一稀释度3次重复的平均菌落数稀释倍数。试剂购买序号试剂名称规格需要数量（单位：瓶）实验室现有药品备注1牛肉膏500g/瓶1瓶有未特别注明，所用化学试剂均为分析纯2蛋白胨500g/瓶2瓶3琼脂500g/瓶44可溶性淀粉500g/瓶25葡萄糖500g/瓶36氯化钠500g/瓶1有7硝酸钾100g1有8磷酸氢二钾500g1有97水硫酸镁500g/瓶1有10硫酸亚铁500g/瓶1有112水硫酸钙500g/瓶1有12碳酸钙250g/瓶1有1314孟加拉红最小包装15链霉素25g/瓶116酒石酸钠100g/瓶117阿拉伯胶100g/瓶118碘化钾50g/瓶1有19氯化汞50g/瓶120氢氧化钾500g/瓶121硫酸铵500g/瓶122甲苯200ml左右23苯磷酸二钠10g左右24NaAc.3H2O500g/瓶125乙酸500ml/瓶1有26酚100g/瓶1有27铁氰化钾100g/瓶1284-氨基安替吡啉25g/瓶129硼酸500ml/瓶1有30硼砂500g/瓶131三氯乙酸500g/瓶132硫代巴比妥酸（TBA）最小包装33丙酮500ml/瓶1有34氮蓝四唑100mg/瓶13536