木尔坦棉花曲叶病毒V2蛋白N端保守脯氨酸对病毒致病性的影响.pdf

木尔坦棉花曲叶病毒()是棉花曲叶病的主要病原之一其 蛋白在病毒致病过程中起重要作用 本研究对 蛋白 端第 位脯氨酸在病毒致病过程中的作用进行了分析 通过构建马铃薯 病毒()异源表达载体(、)利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现 能够增强 异源病毒的致病性致使 在植物体内复制量增加而 对 异源病毒致病性的影响相对较小 通过构建 基因突变体(、)侵染性克隆利用农杆菌介导的方法接种于本氏烟发现、侵染性克隆引起的症状较野生型更弱 结果表明 开放科学(资源服务)标识码()蛋白 端第 位脯氨酸在病毒侵染过程中起重要作用关键词:木尔坦棉花曲叶病毒 蛋白 致病性 载体 侵染性克隆中图分类号:.文献标识码:文章编号:():./.(.).(./.):().().().().:木尔坦棉花曲叶病毒()属于菜豆金色花叶病毒属()具有单组分单链环状 基因组是棉花曲叶病的主要病原物之一 该病毒在自然条件下主要由烟粉虱()传播还可以通过嫁接、扦插等农事传播危害多种农作物和园艺植物给多国的农福建农林大学学报(自然科学版)第 卷 第 期 ()年 月业生产造成严重的经济损失 年我国首次在广东朱瑾()上检测到 随后福建、海南、广西、江苏等地也发现该病毒其危害棉花(.)、黄秋葵()、红麻()、垂花悬铃花()等植物 是双生病毒中分布最广、种类最多、危害程度最大的属具有孪生颗粒状病毒粒子形态基因组为 该属中部分成员是双组分基因组结构包括 和 多数是单组分基因组结构只有一条 组分大小为.包含 个开放阅读框()和 蛋白由病毒链编码、和 蛋白由互补链编码 卫星分子的 大小约.只编码 蛋白 蛋白是 单组分病毒编码的一个保守蛋白在病毒侵染寄主和致病过程中起着重要作用 在本氏烟()中过表达非洲木薯花叶病毒()或番茄黄曲叶病毒()编码的 蛋白会引起寄主叶脉黄化、植株矮缩、叶片卷曲的症状 基因的突变可以使寄主症状减轻、病毒 积累量骤减甚至阻断病毒在寄主体内的侵染过程但在侵染本氏烟原生质体时 基因的突变不影响病毒的 复制 多种病毒的 蛋白被鉴定为转录后基因沉默()抑制子和/或转录水平基因沉默()抑制子 研究发现 蛋白通过与基因沉默抑制子()或核酸内切酶()互作抑制基因沉默 另外 蛋白可诱导寄主产生过敏性坏死反应且参与病毒的运动 研究还发现 蛋白可能通过与木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶 互作参与寄主的过敏性坏死反应本课题组前期研究发现 蛋白 端可影响病毒的致病性而具体哪个氨基酸起作用尚不清晰 本研究对该病毒 蛋白 端第 位保守脯氨酸对病毒致病性的影响进行研究以期为进一步理解 蛋白的功能提供依据 材料与方法.材料 侵染的朱槿样品总、侵染性克隆(序列登录号为 序列登录号为)、马铃薯 病毒()载体、农杆菌()感受态、大肠杆菌()感受态、蛋白多克隆抗体、本氏烟种子均由本实验室保存同源重组酶试剂盒()和高保真酶试剂盒()购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司 试剂盒()和蛋白酶抑制剂片剂购自 公司 植物总 提取试剂盒()购自天根生化科技(北京)有限公司反转录试剂盒()购自 公司荧光定量()快速反应体系()购自北京康润诚业生物科技有限公司.异源表达载体构建以 侵染的朱槿样品总 为模板设计特异性引物/和/(表)分别扩增野生型和第 位脯氨酸突变型(脯氨酸 突变为丙氨酸)目的基因片段 反应体系:总 引物()引物()聚合酶 缓冲液 混合物 总体积 反应程序:个循环后 终止反应 将由 线性化的 载体和 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳及回收纯化后按照同源重组酶试剂盒说明书进行同源重组重组产物转化至大肠杆菌使用/引物(表)进行阳性克隆筛选获得重组质粒 和 第 期尚鹏祥等:木尔坦棉花曲叶病毒 蛋白 端保守脯氨酸对病毒致病性的影响表 本研究所用引物)引物名称引物序列()引物序列中小写字母代表重组位点下划线处代表突变位点.突变型侵染性克隆载体构建用限制性内切酶 和 将 侵染性克隆载体中 基因组切除保留部分缺失基因组 和载体部分片段 设计引物/、/(表)扩增 基因突变(缺失突变和 第 位脯氨酸 突变为丙氨酸)的 基因组片段延伸时间改为 扩增得到的条带大小均为 将 扩增产物和酶切产物经琼脂糖凝胶电泳及回收纯化后分别进行同源重组重组产物转化至大肠杆菌后利用引物/(表)进行阳性克隆的筛选获得的重组质粒 和 即为 缺失突变体和 突变体侵染性克隆.重组质粒转化和接种将重组质粒、空载体、分别利用液氮冻融法转入农杆菌 感受态细胞 吸取 阳性菌液加入 含有 和 抗生素的液体 中、摇床培养至 .离心 弃上清加入 接种缓冲液 吗啉乙磺酸(.)乙酰丁香酮 重悬后 离心 弃上清重复两次加入接种缓冲液悬浮至 为.室温静置 选择生长至 片叶的本氏烟使用去除针头的医用接种器通过浸润法接种适量菌液至叶片背部(侵染性克隆接种时、需要分别与 等比例混匀)接种后的本氏烟置于 光照培养箱培养定期观察植株症状使用单反相机(尼康)拍照.植物总 的提取和 检测采用改良 法提取植物总 参考 试剂盒说明书进行 检测 以引物/(表)扩增的 部分片段()作为探针以引物/(表)扩增的 部分片段()用于 检测.植物总蛋白的提取和 检测取.新叶组织置于 离心管中加 颗灭菌钢珠液氮冷却后振成粉末取出钢珠加入 蛋白抽提液 (.).(体积分数)吐温(体积分数)巯基乙醇每 加蛋白酶抑制剂 片充分研磨后转移至 离心管中、离心 转移上清液至新的 离心管中 离心 吸取上清液至新的 离心管中置于 冰箱中保存备用福建农林大学学报(自然科学版)第 卷 检测步骤参考文献以 蛋白多克隆抗体为一抗辣根过氧化物酶标记羊抗兔为二抗.二氨基联苯胺()染色将叶片置于含 工作液(.固体、无菌水.)的培养皿中振荡过夜将 工作液倒掉无水乙醇脱色 左右 观察叶片表现使用单反相机(尼康)拍照.植物总 的提取和 检测参考 植物总 提取试剂盒和反转录试剂盒说明书提取植物总 并进行反转录得到本氏烟 保存备用 设计引物/(表)扩增 基因部分片段 扩增体系:模板 ()()不含 酶的 总体积 扩增程序:个循环 结果与分析.基因及其突变体对 异源病毒致病性的影响利用农杆菌介导的接种法将构建的重组质粒 和 接种于本氏烟以健康本氏烟()和接种 空载体的本氏烟为阴性对照 接种第 天接种、和 空载体的植株均表现叶片轻微卷曲第 天接种 的植株矮小新叶有萎蔫和坏死症状接种 和 空载体的植株仅表现新叶轻微卷曲和矮小症状(图)检测结果发现接种 的植株中 蛋白大量表达接种 的植株中 蛋白少量表达健康本氏烟和接种 空载体的植株中未见 蛋白的表达(图)检测结果发现接种 的植株中 基因的表达量是接种 植株的 倍以上接种 空载体的植株仅有少量 基因表达(图)结果说明 的 基因能够增强 异源病毒的致病性致使 在植物体内的复制量增加而 对 异源病毒致病性的影响相对较小.本氏烟接种重组质粒后的症状.接种 后 检测 蛋白表达量.接种 后 检测 基因相对表达量 为健康本氏烟植株 为接种 空载体的植株 为接种连接 的 载体的植株为接种连接 第 位脯氨酸突变为丙氨酸的 载体的植株 为 蛋白多克隆抗体 为蛋白上样量图 基因及其突变体对 异源病毒致病性的影响.和 接种于本氏烟第 天取植株的新叶进行 染色 在过氧化氢的存在下会失去电子变成浅棕色不溶物 结果发现接种 的新叶组织大面积变为黑褐色而接种 的新叶组织只积累了微量黑褐色(图)可见 可使植株发生过敏性坏死反应而 基本不发生过敏性坏死反应 第 期尚鹏祥等:木尔坦棉花曲叶病毒 蛋白 端保守脯氨酸对病毒致病性的影响 为健康本氏烟植株 为接种 空载体的植株 为接种连接 的 载体的植株为接种连接 第 位脯氨酸突变为丙氨酸的 载体的植株图 基因及其突变体接种于本氏烟 后的 染色情况.基因及其突变体对 致病性的影响构建 突变体侵染性克隆()和()分别与其 侵染性克隆等比例混合后接种于本氏烟 结果发现:接种 后接种野生型病毒()的植株新叶卷曲明显接种 和 的植株新叶轻微卷曲接种 后接种 的植株叶片表现明显的皱缩并向下卷曲叶柄和茎秆扭曲植株矮化明显接种 和 的植株仅表现叶片轻微卷曲(图)检测结果发现接种 的植株在 后新叶中已积累了病毒 后积累量明显增加而接种 的植株在 后仅积累了少量病毒(图)检测结果发现接种 和 后除健康植株外其余植株都有 的存在(图)检测结果发现接种 和 的植株在 后积累了 蛋白(图)这些结果表明 蛋白是 复制侵染所必需的并且 蛋白 端第 位脯氨酸对蛋白功能影响很大.本氏烟接种侵染性克隆后的症状.检测病毒.检测病毒.检测 蛋白表达量(接种)为健康本氏烟植株 为接种野生型病毒侵染性克隆的植株 为接种 缺失突变侵染性克隆的植株为接种 第 位脯氨酸突变为丙氨酸侵染性克隆的植株 为单链 为 分子质量标准或蛋白分子质量标准 为 上样量 为蛋白上样量图 基因及其突变体对 致病性的影响.福建农林大学学报(自然科学版)第 卷 讨论研究表明与 同源关系较近的 棉花曲叶病毒()蛋白是该病毒重要的致病因子之一具有很强的 抑制子活性能够参与病毒的运动等 蛋白也具有 抑制子功能并通过与本氏烟 互作抑制 指导的 甲基化()介导的 其中第 位赖氨酸起关键作用 双组分印度番茄曲叶病毒()和新竹番茄曲叶病毒()蛋白单氨基酸突变(前者、后者)可减弱病毒症状并降低病毒积累量而单组分烟草曲茎病毒()蛋白 位氨基酸对其沉默抑制子活性具有重要作用 本研究发现 蛋白 端第 位脯氨酸在病毒侵染过程中起重要作用但是否影响 蛋白沉默抑制子活性尚不明确多种双生病毒的 蛋白可诱导寄主产生过敏性坏死反应 本试验利用异源 表达载体研究发现 蛋白可使本氏烟产生坏死现象并通过 染色进行了验证 第 位脯氨酸的突变导致 蛋白丧失了该功能与 突变的结果一致其分子机制有待进一步研究参考文献 .():.(/):.何自福佘小漫汤亚飞.入侵我国的木尔坦棉花曲叶病毒及其为害.生物安全学报():.毛明杰何自福虞皓等.侵染朱槿的木尔坦棉花曲叶病毒及其卫星 全基因组结构特征.病毒学报():.():.董迪朱艳华何自福等.侵染广东黄秋葵的木尔坦棉花曲叶病毒及伴随卫星 的分子特征.华南农业大学学报():.林林蔡健和罗恩波等.南宁市朱槿曲叶病毒病病原分子鉴定和寄主范围研究.植物病理学报():.汤亚飞何自福杜振国等.海南红麻曲叶病的病原检测与鉴定.植物病理学报():.汤亚飞何自福杜振国等.侵染垂花悬铃花的木尔坦棉花曲叶病毒分子特征研究.植物病理学报():.():.张晖季英华吴淑华等.江苏朱槿上分离到的木尔坦棉花曲叶病毒基因组结构特征分析.植物病理学报():.章松柏夏宣喜张洁等.福州市发生由木尔坦棉花曲叶病毒引起的朱槿曲叶病.植物保护():.:.():.():.:./.():.:.():.():.第 期尚鹏祥等:木尔坦棉花曲叶病毒 蛋白 端保守脯氨酸对病毒致病性的影响 .():.():.():.():.():.():.():.():.():.:./.():.:.():.():.:./.():.().():.何玮毅陈晓静申艳红等.番木瓜组培苗叶片基因组 的微量提取.福建农林大学学报(自然科学版)():.庄军.抗菌蛋白与血蓝蛋白抗菌肽的抑菌活性研究.福州:福建农林大学.():./.():.(“”).():.刘顺民.新竹番茄曲叶病毒 功能研究.福州:福建农林大学.():.:./.(责任编辑:杨郁霞)福建农林大学学报(自然科学版)第 卷