牦牛源产气荚膜梭菌β2基因的原核表达及生物信息学分析.pdf

为了原核表达一株牦牛源产气荚膜梭菌 Qinghai-1 的 2 基因及了解其编码蛋白的生物信息。首先利用 PCR 扩增技术、基因克隆技术构建原核表达质粒并通过高通量测序、双酶切技术、SDS-PAGE 检测和Western blotting 方法对表达情况进行鉴定，其次利用生物信息学分析的方法对 2 毒素蛋白的一级结构、二级结构、蛋白特殊区域、三级结构及 B 细胞线性抗原表位等多方面进行预测分析。原核表达结果显示：牦牛源产气荚膜梭菌 2 基因在温度为 37，IPTG 浓度为 1.5 mmoL/L，培养时间为 8 h10 h 的条件下可得到大小约为 28KD 的可溶于细胞质的不含信号肽的目的蛋白。生物信息学分析结果显示：牦牛源产气荚膜梭菌 2 基因大小为 798 bp，共编码 265 个氨基酸，与印度的产气荚膜梭（FR687302.1）的 2 毒素基因相似性最高；其分子式为 C1392H2136N356O418S11，分子量为 30.9 ku，pI=6.04，负电荷（Asp+Glu）残基总数 36 个，正电荷（Arg+Lys）残基总数 35 个，脂肪指数：74.64，不稳定指数：28.52，亲水性总平均值(GRAVY)：-0.478；拥有 1 个跨膜螺旋和 35 个潜在磷酸化位点；为含跨膜结构的、含信号肽的、含磷酸化位点的、含多个 B 细胞线性抗原表位的、稳定的亲水性蛋白。研究结果旨在准确预测牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素抗原表位，为进一步研究牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素致病机理提供重要理论依据。关键词 牦牛；产气荚膜梭菌；2 基因；原核表达；生物信息学分析 中图分类号：S852.61+6.3 文献标志码：A 文章编号：2096-4781（2023）04-0359-13 DOI:10.19707/ki.jpa.2023.04.002 Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of 2 Gene of Clostridium perfringens from Yaks Suolang sizhu,HUANG Jiaqi,LUO Runbo,WU Dan,CAI Zhongzhen,LI Yupeng,YE Lijun(Animal Science College,Tibet Agriculture&Animal Husbandry University,Nyingchi Tibet,860000,China)Abstract:In order to express the 2 gene of Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain,derived from yaks,in a prokaryotic system and understand the biological information of its encoded protein,PCR amplification technology and gene cloning technology were firstly used to construct a prokaryotic expression plasmid,and the expression was identified by high-throughput sequencing,double restriction enzyme digestion,SDS-PAGE detection and western blotting methods.Furthermore,bioinformatics analysis was employed to predict and analyze various aspects of the 2 toxin protein,including primary and secondary structures,protein domains,tertiary structure,and B-cell linear antigenic epitopes.The prokaryotic expression results showed that the 2 gene of Clostridium perfringens from yaks could obtain a cytoplasmic target protein without signal peptide of approximately 28 KD in size,soluble in the cytoplasm and devoid of 360 高原农业 2023 年第 4 期 signal peptides,under conditions of 37C temperature,1.5 mmol/L IPTG concentration,and 8 to 10 hours of cultivation.The bioinformatics analysis revealed that the 2 gene of Clostridium perfringens from yaks was 798 bp in size,encoding 265 amino acids,and exhibited the highest similarity to the 2 toxin gene of an Indian Clostridium perfringens strain(FR687302.1).The protein had a molecular formula of C1392H2136N356O418S11,a molecular weight of 30.9 ku,a pI of 6.04,a total of 36 negative charge residues(Asp+Glu),a total of 35 positive charge residues(Arg+Lys),a GRAVY score of-0.478,a instability index of 28.52,and a hydrophilicity index of 74.64.The protein harbored a single transmembrane helix and presented 35 potential phosphorylation sites.Notably,it exhibited structural stability,containing a signal peptide,multiple B-cell linear antigenic epitopes,and transmembrane regions.The study aimed to accurately predict the antigenic epitopes of the 2 toxin of yak-derived Clostridium perfringens and provide an important theoretical basis for further research on the pathogenic mechanism of the 2 toxin in yak-derived Clostridium perfringens.Key words:yak,Clostridium perfringens,2 gene,prokaryotic expression,bioinformatics analysis 产 气 荚 膜 梭 菌（Clostridium perfringens，C.perfringens）旧称魏氏梭菌（Clostridium welchii）是一种可同时感染人和动物的人畜共患性条件致病菌1，广泛存在于泥土、污水、腐殖质、饲草、排泄物等自然环境中以及人畜肠道中2。上世纪九十年代末，Uzal F A 等3在一株 C 型产气荚膜梭菌菌株中发现了 2 毒素，其生物活性与 毒素相似4，但与 毒素并无同源性，由位于质粒上的 2 基因所编码，拥有细胞毒性5。据报道，A 型产气荚膜梭菌引起的仔猪肠炎的严重程度与 2 毒素密切相关，是仔猪肠炎的关键毒力因子，但 2 毒素在其它动物的肠道疾病中的作用尚不明确，其具体致病作用仍不清楚6。关于 2 毒素作用于牛的有关研究报道差异较大，特别是在消化道的致病作用结论不一致7,8。本研究首先利用 PCR 扩增技术、基因克隆技术构建牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素基因原核表达质粒并通过高通量测序、双酶切、SDS-PAGE 检测和 Western blotting 方法对表达情况进行鉴定，其次利用生物信息学分析的方法对 2 毒素蛋白的一级结构、二级结构、蛋白特殊区域、三级结构及 B细胞线性抗原表位等多方面进行预测分析。旨在准确预测牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素抗原表位，为进一步研究牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素致病机理提供重要理论依据。1 材料与方法 1.1 菌株、质粒和载体 牦牛源产气荚膜梭菌 Qinghai-1（登录号：MW980090）由本实验室从青海省玉树地区牦牛腹泻粪样中分离得到。Trans 5 感受态细胞、大肠菌株 BL21（DE3）plus感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；pET-22b（+）载体武汉淼灵生物科技有限公司；pMD18-T 载体购自 TaKaRa 生物技术有限公司。1.2 主要试验试剂、仪器 DNA 聚合酶、细菌 DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生物技术有限公司；内切酶 Nco 和 BamH 购自 TaKaRa 公司；蛋白 maker 购自擎科生物有限公司；蛋白胶试剂盒购自上海雅酶生物科技有限公司；2.5 L 厌氧产气袋购自于日本 Mitsubishi Chemical 公司。Tryptone、Yeast Extract、NaCl、Tween-20、Agar、KCl、Tris、SDS、Glycine、考马斯亮蓝 R250 购自于青岛海博生物技术有限公司。His-tag 小鼠单克隆抗体、辣根第 4 期 索朗斯珠等：“牦牛源产气荚膜梭菌2 基因的原核表达及生物信息学分析”361 过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG、ECL 显色液购自北京博奥龙免疫技术有限公司。PCR 仪（美国 Applied Biosystems 公司）；核酸蛋白检测仪（德国 Eppendorf公司）；蛋白转移电泳槽（上海嘉鹏科技有限公司）；蛋白照胶系统（上海天能科技有限公司）。1.3 引物设计与合成 根据NCBI公布的产气荚膜梭菌（登录号：AJ537530.1）2 基因序列，利用生物学软件Primer Premier 5，设计2 基因全长引物，并在 5末端引入酶切位点Nco（5 CCATGG 3），3末端引入酶切位点BamH（5 GGATCC 3），设计出包含有信号肽的2 基因引物（F1、R1），以及不含信号肽的2 基因引物（F2、R2）。引物由擎科生物技术（成都）股份有限公司合成。表 1 牦牛源产气荚膜梭菌 2 基因扩增引物信息 Tab.1 Primer information for amplification of the 2 gene of Clostridium perfringens of Qinghai-1strain derived from yaks.基因名称 引物名称引物序列（）酶切位点 片段大小/bp2 F1 GCCCATGGCCATGAAAAAAATTATTTCAAAGTT Nco 798 R1 CGCGGATCCACTGCACAATACCCTTCACCAAAT BamH F2 CATCCATGGCCATGAAGGAAATCGACGCTTATAGNco 708 R2 CCGGATCCACTGCACAATACCCTTCACCAAAT BamH 1.4 2 基因 PCR 扩增及克隆 以牦牛源产气荚膜梭菌 Qinghai-1 的细菌 DNA作为模板，通过 PCR 扩增 2 基因。PCR 扩增采用50 L 总体系：2Taq PCR Master Mix 25 L，DNA模板 2 L，上、下游引物 10 mol/L)各 1 L，ddH2O补足至 50 L。PCR 反应条件：95 2 min；95 30 s、56 45 s、72 30 s、30 个循环；72 延伸10 min。PCR 产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定并胶回收。将回收的目的片段克隆至 pMD18-T 载体，并转化至大肠杆菌 DH5 感受态细胞中，经 PCR 鉴定后，将阳性菌命名为 pMD18-T-2-1 和 pMD18-T-2-2 并送至擎科生物技术（成都）股份有限公司测序。1.5 2 基因重组表达载体的构建与鉴定 2 基因克隆后使用 DNA 回收试剂盒进行胶回收并纯化，用 Nco、BamH限制性内切酶对纯化后的目的基因和载体 pET-22b()质粒进行双酶切。随后将酶切产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶鉴定后切胶回收，将得到的目的基因与载体连接，并将连接好的重组质粒转化至 Trans 5 感受态细胞中，涂布于含AMP 的 LB 固体培养基上，37 恒温箱中过夜培养，提取质粒。利用 Nco、BamH进行双酶切鉴定和 PCR 鉴定，将鉴定正确的含信号肽的质粒命名为pET-22b-2-1，将鉴定正确的不含信号肽的质粒命名为 pET-22b-2-2。最后，将经 PCR 和双酶切都鉴定正确的重组质粒送至擎科生物技术（成都）股份有限公司测序。将测序验证基因序列正确的重组表达质粒 pET-22b-2-1 和 pET-22b-2-2 转化至大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞后，随后将其涂布至含 Amp 抗性的 LB 固体平板上，37 过夜培养，挑取阳性单菌落，经菌液 PCR 鉴定，将鉴定正确的重组菌株命名为 pET-22b-2-1-BL21（DE3）和 pET-22b-2-2-BL21（DE3）。1.6 2 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 挑取 pET-22b-2-1-BL21（DE3）、pET-22b-2-2-BL21（DE3）和空载 pET-22b-BL21（DE3）单菌落接种 10 mL 含 Amp 的液体 LB 培养基，37 条件下 180 r/min 振荡培养。当 D600 nm=0.81 时，加362 高原农业 2023 年第 4 期 入 IPTG 进行诱导，对照组样品不加 IPTG，6 h 后以 6 000 r/min 离心 5 min 收集菌体，随后加入 PBS进行超声破碎，并以 12 000 r/min 离心 10min，分别收集上清与沉淀，沉淀加等量 PBS 重悬，分别取上清与沉淀各 80 L，加入 20 L 蛋白上样缓冲液，100 加热 10 min，使用 12.5%SDS-PAGE 进行电泳鉴定。1.7 2 重组蛋白的 Western blotting 鉴定 将 1.6 中纯化得到的样品使用 12.5%SDS-PAGE 进行电泳，浓缩胶电压为 80 V，分离胶电压为 120 V，直到样品到达凝胶底部时结束。并在电压 110V 条件下湿转至 PVDF 膜，随后置于 5%的脱脂牛奶中室温、低速振荡，封闭 4 h。以 His-tag 小鼠单克隆抗体为一抗（1:10 000），室温、低速振荡，孵育 4 h。利用 PBS-T 漂洗 3 次后，以辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG 为二抗（1:5 000），室温、低速振荡，孵育 2 h。最后用 PBS-T 漂洗 3 次后，加入ECL 化学发光剂利用凝胶成像仪进行曝光检测。1.8 生物信息学分析 1.8.1 牦牛源 2 基因系统发育进化树构建 在 NCBI 的 Nucleotide 数据库中比对测得的牦牛源 2 基因序列，并下载相关序列。利用 MEGA 7.0 软件采用邻接法（Neighbor Joining）构建牦牛源产气荚膜梭菌 Qinghai-1（登录号：MW980090）菌株的 2 基因系统发育进化树。1.8.2 2 毒素蛋白理化性质分析 利用ProtParam在线软件对2毒素蛋白的分子式、分子质量、正负电荷、脂肪指数、等电点、稳定性及半衰期进行分析；ProtScale 在线软件对 2毒素基因编码蛋白的亲、疏水性分析。1.8.3 2 毒素蛋白结构分析 NetPhos在线软件对2基因编码蛋白的磷酸化位点分析；SignalP 在线软件对 2 基因编码蛋白的信号肽分析；TMHMM 在线软件对 2 基因编码蛋白的跨膜结构分析；IEDB 和 BCPREDS 在线软件对2基因编码蛋白的抗原表位预测；PSORT WWW Server 在线软件对 2 基因编码蛋白定位分析；SOPMA在线软件对2基因编码蛋白的二级结构分析；AlphaFold 软件对 2 基因编码蛋白的三维空间结构模型建立。2 结果 2.1 2 基因 PCR 扩增与测序 以克隆后筛选的阳性菌株为模板，用合成的 2引物进行 PCR 扩增，经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示（图 1）：pMD18-T-2-1 PCR 产物在约 798 bp 处出现条带，pMD18-T-2-2 PCR 产物在约 708 bp 处出现条带，经鉴定其结果与预期条带大小一致。且经测序比对分析得到：pMD18-T-2-1 和pMD18-T-2-2 两重组质粒与牦牛源产气荚膜梭菌2 碱基序列一致，未出现碱基增添、缺失、替换等碱基错配现象。表明已成功获得 2 基因并插入pMD18-T 克隆载体。注：M：DL2000 DNA Marker；1：pMD18-T-2-1；2：pMD18-T-2-2 图 1 2 基因 PCR 扩增凝胶电泳结果 Fig.1 Gel electrophoresis results of PCR amplification of the 2 toxin gene 第 4 期 索朗斯珠等：“牦牛源产气荚膜梭菌2 基因的原核表达及生物信息学分析”363 2.2 2 重组表达质粒的双酶切鉴定 重组质粒pET-22b-2-1和pET-22b-2-2用Nco、BamH进行双酶切鉴定，结果显示分别在 798 bp 和708 bp 出现条带（图 2），与预期结果相符。且经测序比对，与牦牛源产气荚膜梭菌 2 碱基序列一致，未出现碱基增添、缺失、替换等碱基错配现象。表明 2 重组表达质粒构建成功。注：M：DL2000 DNA Marker；1：pET-22b-2-1；2：pET-22b-2-2 图 2 2 基因重组表达质粒的双酶切鉴定 Fig.2 Double enzyme digestion verification of the recombinant expression plasmid containing the 2 gene 2.3 牦牛源产气荚膜梭菌重组2毒素蛋白表达结果 2.3.1 培养基中目的蛋白检测 注：M：蛋白 Marker；“-”：pET22b 空载细菌培养基上清；1、2：pET-22b-2-A-BL21（DE3）细菌培养基上清；3、4：pET-22b-2-R-BL21（DE3）细菌培养基上清 图 3 培养基中目的蛋白 SDS-PAGE 检测结果 Fig.3 SDS-PAGE analysis of the target protein in the culture medium 将 pET-22b-2-A-BL21（DE3）、pET-22b-2-R-BL21（DE3）和 pET22b 空载细菌挑取单菌落接种至含 AMP 的 LB 培养基中，37 培养 6 h 后经过 1 mM IPTG 诱导表达 4 h 后，并以 6 000 r/min 离心5 min 收集培养基上清液。经 SDS-PAGE 检测，结果显示（图 3）：pET-22b-2-A-BL21（DE3）和 pET-22b-2-R-BL21（DE3）均未在培养基中表达出可溶的目的蛋白。2.3.2 菌体裂解物中目的蛋白检测 将 pET-22b-2-A-BL21（DE3）、pET-22b-2-R-BL21（DE3）和 pET22b 空载细菌挑取单菌落接种至含 AMP 的 LB 培养基中，37 培养 6 h 后经 1 mM IPTG 诱导表达 4 h 后，收集菌体，随后加入PBS 进行超声破碎，分别收集上清与沉淀进行 SDS-PAGE 检测，结果显示（图 4）。注：M：蛋白 Marker；1：pET22b 空载细菌菌体上清；2：pET-22b-2-A-BL21（DE3）细菌菌体上清 3：pET-22b-2-R-BL21（DE3）细菌菌体上清；4：pET22b 空载细菌菌体沉淀 5：pET-22b-2-A-BL21（DE3）细菌菌体沉淀；6：pET-22b-2-R-BL21（DE3）细菌菌体沉淀 图 4 SDS-PAGE 检测结果 Fig.4 SDS-PAGE analysis results 在 pET22b 空载细菌菌体上清（泳道 1）和沉淀（泳道 4）、在 pET-22b-2-A-BL21（DE3）细菌菌体上清（泳道 2）和沉淀（泳道 5）中均未检测到目的蛋白；在 pET-22b-2-R-BL21（DE3）细菌菌体裂364 高原农业 2023 年第 4 期 解物上清（泳道 3）中观察到少量目的蛋白的，在pET-22b-2-R-BL21（DE3）细菌菌体裂解物沉淀（泳道 6）中观察到大量目的蛋白。故试验表明 pET-22b-2-A-BL21（DE3）可能由于受到信号肽的干扰未能表达出正常的目的蛋白；pET-22b-2-R-BL21（DE3）能够正确表达出目的蛋白，且目的蛋白主要存在与细菌菌体裂解物的沉淀中，少量存在于细菌菌体裂解物的上清中，后期可摸索出最优表达条件使其能在上清中大量表达。2.3.3 最优表达条件及 Western blotting 鉴定 经试验摸索，在 37 培养时，IPTG 浓度为 1.5 mmoL/L，培养时间 4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 的条件下在 pET-22b-2-R-BL21（DE3）细菌菌体裂解液上清均有目的蛋白条带出现（图 5A）。Western blotting 试验在相应条件下也均检测出目的蛋白（图5B），并在 8 h、10 h 时含量最大。故结合两试验结果得出最佳培养条件：培养温度为 37，IPTG 浓度为 1.5 mmoL/L，培养时间为 8 h10 h。在该条件下可得到大量表达的可溶性目的蛋白，可用于扩大培养和纯化以及下一步试验需要。注：“-”：空载体；M：蛋白 Marker；1-5：在 IPTG 浓度为 1.5 mmoL/L 下培养时间 4 h、6 h、8 h、10 h、12 h；A：SDS-PAGE 检测；B：Western blotting 检测 图 5 37 下 pET-22b-2-R-BL21（DE3）细菌菌体裂解液上清中目的蛋白 Fig.5 Target protein in the supernatant of pET-22b-2-R-BL21(DE3)bacterial cell lysate at 37 C 2.4 2 基因生物信息学分析 2.4.1 牦牛源 2 基因系统进化树构建 将测序结果利用seqMan 5.0软件进行拼接处理，得到牦牛源产气荚膜梭菌 Qinghai-1 菌株 2 毒素基因大小为 798 bp，在 BLAST 核酸数据库比对的结果与其他不同地区不同种源的产气荚膜梭菌 2 毒素基因相似率在 90%以上，与印度的产气荚膜梭（FR687302.1）的 2 毒素基因相似性最高，与其他产气荚膜梭菌 2 毒素基因序列存在至少 26 处碱基差异。通过利用 MEGA 7.0 软件构建的系统发育进化树（图 6）显示，与日本粪样（MH900542.1）、韩国仔猪源（KF155292.1）、瑞典家禽源（DQ201544.1）、伊朗羊源（HQ853331.1）、美国牛源（EU260099.1）、韩国猪源（KF914161.1）等的产气荚膜梭菌 2 毒素基因差异性较大位于不同分支，与印度环境样（FR687302.1）产气荚膜梭菌 2 毒素基因差异性较小位于同一支。2.4.2 理化性质及疏水性分析 经过 DNAMAN 软件分析得出：2 基因共编码265 个氨基酸，5端为起始密码子 ATG 编码甲硫氨酸（Met），3端构成个不依赖 因子的转录终止子。氨基酸序列如表 2 所示。第 4 期 索朗斯珠等：“牦牛源产气荚膜梭菌2 基因的原核表达及生物信息学分析”365 图 6 牦牛源产气荚膜梭菌菌株 Qinghai-1 2 毒素基因进化树 Fig.6 Phylogenetic tree of the 2 toxin gene in Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain derived from yaks 表 2 牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素基因氨基酸序列 Tab.2:Amino acid sequence of the 2 toxin gene in Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain derived from yaks 起始位号 氨基酸序列 1 M K K I I S K F T V I F M F S Y F L I V 21 G A I S P M K A S A K E I D A Y R K V M 41 E N Y L N A F K N Y D I N T I V N V S E 61 D E R V N S D E K Y K E M L E E F K Y D 81 P N Q Q L K S F E I L N S Q K I D N K E 101 I F N V K T E F M N G A I Y D M K F T V 121 S S K D G E L I V S D M E R T K I G N E 141 G K Y I L T P S F R T Q V C T W D D E L 161 S Q S I G G V D P K T Y S T R F T Y Y A 181 D N I L L N F R Q Y A T S G S R D L K V 201 E Y S V V D H W L W G D D V K A S Q M V 221 Y G Q N P D S A R Q I R L Y I E K G Q S 241 F Y K Y R I R I Q N F T P A S I R V F G 261 E G Y C A *经在线软件 Prot-Param 对 2 基因编码的毒素蛋白分析可知：其分子式为 C1392H2136N356O418S11，分子量为 30.9 ku，pI=6.04，负电荷（Asp+Glu）残基总数 36 个，正电荷（Arg+Lys）残基总数 35 个。该基因编码蛋白含有全部 20 种氨基酸（表 3），其中异亮氨酸（I）和苯丙氨酸（S）含量最高，均占8.3%；组氨酸（H）含量最少，仅 1 个，占 0.4%，在第 207 位。2 毒素蛋白在体外培养的哺乳动物网织红细胞内半衰期 30 h；在酵母体内半衰期20 h，大肠杆菌体内的半衰期10 h。脂肪指数：74.64。不稳定指数为 28.52，属稳定蛋白。2.4.3 亲疏水性分析 366 高原农业 2023 年第 4 期 经在线软件Prot-Scale对2毒素蛋白的亲水性分析（图 7）可知，多肽链 15 号位的丝氨酸（S）评分最高为 2.333，65 号位的天冬酰胺（N）评分最低为-2.500，亲水性总平均值（GRAVY）：-0.478，为亲水性蛋白。其亲水性蛋白分布区域为：2753，57109，118127，132144，148162，165179，185200，208251。表 3 牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素蛋白氨基酸含量 Tab.3 Amino acid composition of the 2 toxin protein in Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain derived from yaks 氨基酸 A（Ala）R（Arg）N（Asn）D（Asp）C（Cys）Q（Gln）E（Glu）G（Gly）H（His）I（Ile）数量/个 12 12 16 18 2 11 18 13 1 22 百分比/%4.5 4.5 6.0 6.8 0.8 4.2 6.8 4.9 0.4 8.3 氨基酸 L（Leu）K（Lys）M（Met）F（Phe）P（Pro）S（Ser）T（Thr）W（Trp）Y（Tyr）V（Val）数量/个 13 23 9 16 6 22 13 3 18 17 百分比/%4.9 8.7 3.4 6.0 2.3 8.3 4.9 1.1 6.8 6.4 图 7 牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素蛋白亲水性分析 Fig.7 Hydrophilicity analysis of the 2 toxin protein in Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain derived from yaks 2.4.4 跨膜区预测 经在线软件 TMHMM Server 对 2 毒素蛋白的跨膜结构域预测分析可知（图 8），2 毒素蛋白拥有1 个跨膜螺旋数，且跨膜螺旋中氨基酸预期数量值大于 18，是跨膜蛋白（或具有信号肽）。2.4.5 信号肽预测 利用在线软件 Signalp 4.0 Server 对 2 毒素蛋白信号肽预测分析显示（图 9），C-score 测量值最高为 0.427 出现在 30 号位，Y-score 测量值最高为0.586 出现在 30 号位，S-score 测量值最高为 0.950 出现在 30 号位，且 C-score、Y-score、S-score 均为YES，说明该蛋白含信号肽。另外，S-mean（1-29）第 4 期 索朗斯珠等：“牦牛源产气荚膜梭菌2 基因的原核表达及生物信息学分析”367 值为 0.821，D（1-29）值为 0.713，也说明在 N 端的跨膜螺旋是一个信号肽。综上分析结果可知：2毒素蛋白前 30 个氨基酸编码的肽链为 2 毒素蛋白信号肽。图 8 牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素蛋白跨膜结构预测 Fig.8 Transmembrane structure prediction of the 2 toxin protein in Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain derived from yaks 图 9 牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素蛋白信号肽预测 Fig.9 Signal peptide prediction of the 2 toxin protein in Clostridium perfringens of train Qinghai-1 derived from yaks 2.4.6 细胞定位 利用在线软件 PSORT WWW Server 中的PORST Prediction 工具对 2 毒素蛋白进行细胞定位，可知 2 毒素蛋白存在内质网中，拥有能穿过膜结构的功能。2.4.7 糖基化及磷酸化位点分析 利用在线软件 NetPhos 3.1 Server 对 2 毒素基因编码蛋白的激酶磷酸化位点预测结果显示（图10），Ser（S）得分高于 0.5 的个数为 19 个；Thr（T）得分高于 0.5 的个数为 9 个；Tyr（Y）得分高于 0.5的个数为 7 个。表明该蛋白可能存在 35 个潜在磷酸化位点。2.4.8 抗原表位预测 通过在线软件 IEDB 对 2 毒素蛋白 B 细胞线368 高原农业 2023 年第 4 期 性抗原表位预测（图 11A），最低分 0.196，最高分0.625，平均分0.491，共预测到12个线性抗原表位，主要分布区域为：2639，58110，130152，156175，189197，211217，219228，236242。利用在线软件 BCPREDS，采用预测长度为 20 个氨基酸，特异性 75%以上，并通过重叠过滤的方法对 2 毒素蛋白 B 细胞线性抗原表位进行预测（图 11B），共得到 6 个符合条件的线性抗原表位，分别起始于 51号位、210 号位、189 号位、152 号位、241 号位和129 号位。两种方法预测结果虽有不同但均表明 2毒素蛋白存在线性抗原表位，且综合两种预测方法2 毒素蛋白 B 细胞线性抗原表位可能存在的区域有：5870，130171，189197，211228。图 10 牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素蛋白激酶磷酸化位点预测 Fig.10 Prediction of kinase phosphorylation sites in the 2 toxin protein of Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain derived from yaks 注：A：在线软件 IEDB 分析结果，B：在线软件 BCPREDS 分析结果。图 11 牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素蛋白 B 细胞线性抗原表位预测 Fig.11 Prediction of B-cell linear antigenic epitopes in the 2 toxin protein of Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain derived from yaks 第 4 期 索朗斯珠等：“牦牛源产气荚膜梭菌2 基因的原核表达及生物信息学分析”369 2.4.9 2 毒素蛋白二级结构预测 利用在线软件 SOPMA 对 2 毒素蛋白的二级结构预测情况（图 12）分析可知，2 毒素蛋白有四种二级结构存在（表 4），其中无规则卷曲结构（占40.75%）最多，-转角（7.17%）最少。-螺旋主要分布区域为：122，2548，6778，152162；-转角主要分布区域为：4950，8182，110111，123124，140141，165166，193194，237238，261262；-折叠主要分布区域为：5458，8889，101108，114120，127130，135138，183187，199204，241247，256260；无规则卷曲结构主要分布区域为：5966，7985，92100，146151，188198，211232，248255。表 4 牦牛源产气荚膜梭菌 2 毒素蛋白二级结构组成 Table 4:Secondary structure composition of the 2 toxin protein in Clostridium perfringens of Qinghai-1 strain derived from yaks 二级结构组成氨基酸个数所占百分比/%-螺旋 76 28.68-转角 19 7.17-折叠 64 24.15 无规则卷曲 106 40.00 注：1：氨基酸位置；2、4、6、8：氨基酸肽链；3、5、7、9：二级结构；h：-螺旋；e：-折叠；t：-转角；c：