生长板损伤后骨桥形成分子机制的研究进展.pdf

综述生长板损伤后骨桥形成分子机制的研究进展 任廷果1,2,彭国璇3,孙 红3,林廉洋4,彭洪成1,黄明智3,姜 华5,邓 进1,2,31.贵州医科大学临床医学院,贵阳 550025;2.贵州医科大学附属医院急诊医学科,贵阳 550004;3.贵州医科大学附属医院骨科,贵阳 550004;4.贵州省骨科医院小儿骨科,贵阳 550007;5.贵州医科大学附属医院小儿外科,贵阳 550004【基金项目】国家自然科学基金(81660317);贵州省科技计划(黔科合 SY 字20153014)【通信作者】邓进,E-mail:gydengjin 【摘要】生长板损伤或骨骺损伤是由创伤、感染等因素导致的长骨生长板软骨损伤。生长板损伤后会引起骨骺与干骺端之间形成骨桥,由此导致的肢体短缩与成角畸形一直是小儿矫形外科医师面临的重大挑战。软骨内成骨参与了生长板损伤后骨桥的形成,许多细胞因子及转录因子通过控制软骨内成骨程序在骨桥形成中扮演重要角色,如血管内皮生长因子、印度刺猬因子、成纤维细胞生长因子受体 3、炎症相关因子以及缝隙引导配体 3 等细胞因子的分泌异常会导致生长板损伤后软骨细胞的增殖与分化功能受损,进而影响软骨内成骨活动。因此,本文综述生长板损伤后骨桥形成的相关分子调控机制,旨在为生长板损伤治疗提供新思路。【关键词】生长板损伤;骨桥形成;分子机制【中图分类号】R 683 【文献标识码】A 【DOI】10.3969/j.issn.1009-4237.2023.06.013Research progress on the molecular mechanism of bone bridge formation after growth plate injuryRen Tingguo1,2,Peng Guoxuan3,Sun Hong3,Lin Lianyang4,Peng Hongcheng1,Huang Mingzhi3,Jiang Hua5,Deng Jin1,2,31.School of Clinical Medicine,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China;2.Department of Emergency Medicine,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China;3.Department of Orthopedics,Affiliated Hospital of Guizhou Medi-cal University,Guiyang 550004,China;4.Department of Pediatric Orthopedics,Guizhou Provincial Orthopaedic Hospital,Guiyang550007,China;5.Pediatric Surgery,Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China【Abstract】Growth plate injury,or called epiphyseal injury,is the cartilage damage of the growth plate of long bones caused by trauma,infection,etc.The shortening and angulation of limbs resulting from the formation of bone bridges between the epiphysis and the metaphysis after growth plate injuries has been a major challenge for pe-diatric orthopaedic surgeons.Endochondral ossification is involved in the formation of bone bridges after growth plate injuries.Many cytokines and transcription factors play important roles in the formation of bone bridges by controlling the endochondral ossification program.For example,abnormal secretion of cytokines such as vascular endothelial growth factor,Indian hedgehog factor,fibroblast growth factor receptor 3,inflammation-related factors,and Slit guid-ance ligand 3 leads to impaired proliferation and differentiation of chondrocytes after growth plate injuries,which in turn affects the osteogenic activity within cartilage.Therefore,this paper intends to review the molecular regulatory mechanisms related to bone bridge formation after growth plate injuries,aiming to provide new ideas for the treatment of such injuries.【Key words】Growth plate injuries;Bone bridge formation;Molecular mechanism 生长板,也称骺板,是位于骨骺和骨干之间的薄层波浪样软骨,组成生长板的软骨细胞持续动态发育维持机体骨骼纵向生长1。软骨内成骨(endo-chondral ossification,EO),又称“软骨内化骨”或“软骨内骨化”,是脊椎动物骨骼正常发育及修复过程中最基本、最重要的方式,控制着软骨细胞增殖、分化、凋亡以及最终矿化的生命历程2。软骨细胞经过增殖、肥大和凋亡构建软骨细胞外基质(extracel-lular matrix,ECM),ECM 被血管、破骨细胞、骨髓细胞和成骨细胞侵入进而沉积、矿化发育成骨。ECM在软骨发育和 EO 过程中的骨骼框架的建立中起重要作用,也为细胞-基质相互作用提供空间背景,特464创伤外科杂志 2023 年第 25 卷第 6 期 J Trauma Surg,2023,Vol.25,No.6定的化学和机械信号在 ECM 内传递,影响细胞基质合成、迁移、增殖、存活和分化,从而对软骨内成骨产生影响3。软骨细胞的增殖、分化、成熟、矿化也受到多种因子的调控,如转化因子 (transforming growth factor-beta,TGF-)、甲状旁腺激素相关蛋白(parathyroid hormone related protein,PTHrP)、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维生长因子及其受体(fibroblast growth factor/FGF receptor,FGF/FG-FR)、印度刺猬因子(Indian hedgehog,Ihh)等4。生长板损伤是涉及骨骼纵向生长机制损伤的总称,包括生长板、Ranvier 区与干骺端损伤5。生长板位于骨骺与干骺端之间,分为静止区、增殖区、肥大区和钙化区,各区域软骨细胞形态功能不一。随着生长板软骨细胞分裂与增殖,骨骺侧向着骨干侧不断进行程序化软骨内成骨,间质钙化以及软骨细胞的坏死、分解后最终钙化成骨。Ranvier 区是存在于骨骺板周围的一个环形软骨膜骨化沟,在临床上,累及 Ranvier 区的损伤常可导致骺板的发育紊乱,也可导致外骨桥的形成以及骨肿瘤的发生6。软骨细胞损伤后会释放一些与成骨相关的细胞因子导致损伤区域软骨细胞矿化,还可以破坏生长板生长区软骨或血供导致生长板失去正常生理功能提前闭合,致使局部软骨矿化形成骨桥7。因此,明确生长板损伤后生长板软骨细胞矿化的具体调控机制,将有助于寻找抑制生长板损伤后骨桥形成的新思路,进而有效控制或延缓生长板损伤骨桥形成或骨骼畸形的发生和发展。1血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)VEGF 是由 VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E 和胎盘生长因子 6 个家族成员组成的同源二聚体蛋白8。在骨骺生长板中,VEGF 主要表达于肥大层软骨细胞,较少表达于静息或增殖层软骨细胞9。研究表明,大生长板软骨细胞分泌VEGF 招募单个内皮细胞和促进现有血管生成,而生长板周围区域未分化的多能祖细胞在 VEGF 刺激下促进血管系统侵入,从而启动二级骨化中心形成,是骨 骼 生 理 性 血 管 生 成 的 关 键 调 控 因 子10。Gerber 等9研究发现 VEGF 通过介导毛细血管侵袭进而调节生长板形态发生和触发软骨重塑,而抑制VEGF 会阻碍毛细血管生成,导致骨小梁形成受损、肥大软骨区扩张和生长板结构紊乱。Ma 等11也证实了敲除昼夜节律核心基因 Bmal1 骨细胞中 VEGF和低氧诱导因子 1 亚单位(hypoxia inducible factor 1alpha,HIF1)表达下降,生长板软骨细胞中 VEGF和 HIF1 表达下调,会提高基质蛋白酶 13(matrix metalloproteinases13,MMP13)和 Runt 相关的转录因子 2(runt-related transcription factor 2,Runx2)的水平,促进生长板软骨细胞矿化。此外,Gruber 等12通过骨骺钻孔损伤动物模型证实,随着骨桥形成越多,生长板静止区和增殖区血管床 VEGF 表达越多,推测 VEGF 可能对于骨骺骨折后骺板阻滞的预防和治疗有指导意义。Erickson 等13也发现抗 VEGF 抗体可以抑制生长板损伤骨桥形成且不影响骨骼正常生长,VEGF 和 FGF 家族激酶受体非靶向抗血管抑制剂酪氨酸激酶抑制剂也能有效缓解骨骺生长板发育不良,初步说明抑制 VEGF 可能成为生长板相关疾病的治疗靶点,对生长板损伤的治疗也不例外。随着对 VEGF 在生长板软骨下成骨过程生理机制的不断深入,越来越多围绕 VEGF 开发的药物逐渐应用,这可能为生长板损伤骨桥形成的治疗提供新方式。2 Ihh20 世纪 80 年代初,德国女遗传学家 C.Nus-slein-Volhard 和美国遗传学家 E.Wieschaus 使用果蝇饱和突变的方法发现刺猬基因突变使得果蝇幼虫身体无毛部分变成有毛,故命名为“刺猬”基因14。此后,科学家们还发现与 Hh 基因同源、功能各不相同的音速刺猬因子、沙漠刺猬因子和 Ihh。Ihh 是一种由胚胎发育期间的扁平状肥大前软骨细胞所表达的大分泌型蛋白,通过作用于 12 次跨膜蛋白受体Patched(Ptch1 和 Ptch2)和 7 次跨膜 G 蛋白偶联受体 Smoothened(Smo),进而释放 Smo 蛋白靶向下游转录因子 Gli 蛋白发挥生物学效应15。研究发现,间充质细胞特异性 Ihh 缺失小鼠胚胎期生长板软骨支架骨化明显,导致生长板和指骨关节的发育障碍,出生后立即出现短肢和侏儒表型16。而遗传学研究也表明,Ihh 介导的 Hh 信号的激活通过调节软骨细胞分化、增殖以及成骨细胞形成 3 个方面控制EO 过程17。而 Ihh 基因中 p.E95K、p.D100E 以及p.E131K 发生点突变通过损害受体 Ptch1 和 Gli1 靶点活性,进而抑制软骨下成骨,导致小鼠远端足趾形成障碍18。有研究证实,Hh 信号通过其氨基末端结构域(Hh-N)介导,Hh-N 作为多价脂蛋白颗粒被双重脂化和分泌,Hh-N 信号接收是由应答细胞上Patched、Smo、Ihog 和脊椎动物特异性蛋白 Hip、Gas1的几种细胞表面蛋白共同调节19。有研究证实碱性螺旋-环-螺旋转录因子 Hand1 通过抑制 Ihh 近端564创伤外科杂志 2023 年第 25 卷第 6 期 J Trauma Surg,2023,Vol.25,No.6启动子 Runx2 的反式激活,下调 Ihh 基因的表达控制 EO 过程,且 Hand1 和 Hand2 基因的过度表达导致了骨干的产前发育不良或再生骨化20。以上说明 Ihh 的正常表达对于维持生长板、关节软骨以及初级松质骨的发育均不可或缺。此外,Vasques等21发现使用重组生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)有效治疗 Ihh 突变引起的短肢畸形。Yoshida 等22提出 Ihh 的表达受到 PTHrP的抑制,因为 PTH 受体与 Ihh 在肥大前软骨细胞中特异性表达是一致的。笔者研究也证实 rhGH 通过Ihh-PTHrP 信号通路延缓糖皮质激素所致生长板软骨细胞凋亡,促进了激素所致长骨生长畸形的恢复23。众所周知,Ihh-PTHrP 信号通路被认为是软骨细胞肥大的一个负反馈环路,而转录因子 Sox9 以及与 Gli2 结合的 Foxc1 均调节 PTHrP 的表达24。Hattori 等25通过在肥大的软骨细胞中错误表达Sox9,导致 VEGF 的表达降低,并抑制血管对软骨和软骨骨化的侵袭,表明 Sox9 是软骨血管化、骨髓形成和软骨内成骨的主要负调控因子。而 Foxc1 已经被确定为软骨中高表达的转录因子,并且也参与了Col10a1 分泌调节26。因此,Sox9 和 Gli2 结合的Foxc1 信号的合作诱导 PTHrP 可以防止软骨细胞的肥大,Sox9 抑制软骨血管化、骨髓形成和软骨内成骨。此外,PTHrP 和组蛋白去乙酰化酶 4(Histone deacetylase 4,HDAC4)也共同参与调节软骨细胞肥大的途径。激活 PTHrP/cAMP/蛋白激酶 A(protein kinase A,PKA)信号通路使 PKA 靶点磷酸化,从而增加了细胞核中 HDAC4 的含量,HDAC4 同时与肌细胞增强因子 2(myocyte enhancer factor 2,Mef2)、Runx2 结合,抑制软骨细胞肥大27。综上所述,Ihh-PTHrP 负反馈环路调控 EO 进程进而影响骨骼发育障碍,Ihh 基因可能作为生长板损伤治疗的重要靶点,但仍需进一步证实。3 FGFR3FGFR3 广泛分布于血管内皮细胞、成纤维细胞、T 及 B 淋巴细胞表面,是一种由胞外区、跨膜区、胞内区 3 部分组成的跨膜受体28。FGFR3 功能异常时常导致软骨发育不全等多种软骨发育性疾病。既往有大量研究证实,FGFR3 跨膜结构域功能位点突变会改变生长板软骨细胞终末分化潜能,导致软骨发育不全,从而减缓生长板 EO 过程29。值得注意的是,FGFR3 基因 ser365Cys 突变通过改变 Ihh-PTHrP 信号通路促使 Ihh、PTHrP 表达下调,抑制长骨骨骼生长30-31。研究发现,在条件性敲除 FGFR3的斑马鱼中 Wnt/-catenin 信号表达增强,而抑制Wnt/-catenin 信号通路可部分缓解 FGFR3 突变造成的骨骼畸形表型32。Zheng 等33研究发现,当sLC26A2 基因敲除后,可能激活了活化转录因子 6(activating transcription factor 6,ATF-6),进而触发蛋白折叠导致 FCFR3 信号过度激活,致使小鼠软骨发育异常,而抑制 FCFR3 及其下游效应基因的磷酸化后骨骼畸形情况得到改善。Chen 等34为了探讨成骨的关键调节因子 FGFR3 是否也影响稳定骨折的再生,意外发现 FGFR3 的功能获得性突变抑制了软骨形成的始动阶段和随后的骨形成。Balek 等35使用 AR0087(一种新型 FGFR 抑制剂)阻断 FGFR3 活性发现,软骨细胞增殖得到改善,软骨细胞的衰老以及 ECM 丢失明显减缓,表明 AR0087 可恢复正常的生长板结构并消除 FGFR3 对软骨细胞肥大分化的影响。此外,FGFR 抑制剂 AR0087 还能明显抑制FGFR1、FGFR2 突变体活性,防止生长板软骨过度分化。大量研究已经证实 FGFR3 在生长板发育、软骨内成骨过程中扮演重要作用,FGFR3 如何参与生长板损伤骨桥形成,仍需进一步研究。随着研究的深入,FGFR3 应该可以作为生长板损伤治疗的重要靶点。4 缝隙引导配体 3(slit guidance ligand 3,SLIT3)SLIT 家族是一类通过与(roundabout,ROBO)受体相互作用在多种生理和病理活动中发挥重要作用的分泌性蛋白家族,首次在果蝇胚胎的中枢神经系统中发现,在许多物种中高度保守,迄今为止在脊椎动物中发现并鉴定出了 3 个家族成员(SLIT1、SLIT2、SLIT3)36。SLIT1 在骨组织中的表达量最低,而 SLIT2 和 SLIT3 在成骨细胞和破骨细胞中均有表达,但其表达水平可能因细胞的状态而不同37。在哺乳动物中有 4 种 ROBO 受体(ROBO1-4),ROBO1 和 ROBO3 在破骨细胞中表达,ROBO1和 ROBO2 在成骨细胞中表达,而 ROBO4 在成骨细胞中几乎不表达,值得注意的是,ROBO1、ROBO2 和ROBO4 在所有类型的血管内皮细胞中均有表达37-38。Kim 等39使用了分级分泌组学方法,发现 SLIT3 可以通过激活-catenin 刺激成骨细胞迁移和增殖,SLIT3 还通过以自分泌的方式抑制破骨细胞的分化来抑制骨吸收,并表明 SLIT3 是代谢性骨病的潜在治疗靶点。Kim 等40进一步实验发现SLIT3 刺激了软骨细胞分化标志物 COL2A1、Sox9、COL10A1、VEGF 和 MMP13 在细胞中的表达以及抑664创伤外科杂志 2023 年第 25 卷第 6 期 J Trauma Surg,2023,Vol.25,No.6制了细胞中的-catenin 活性,表明 SLIT3/ROBO2通过抑制-catenin 信号通路促进软骨细胞成熟,但并不调控软骨细胞数量的增殖。SLIT3 是一个由成骨细胞衍生的促血管生成因子,而血管也可以通过分泌信号分子来调节骨形成,血管生成与骨形成在时间和空间上的这种密切联系被称为“血管生成-成骨耦合”41。CD31hiEMCNhi 型血管是一种在血管内皮细胞上高表达 CD31 和 EMCN 的血管亚型,其位于干骺端,周围有致密的骨祖细胞,可以通过产生刺激骨祖细胞增殖与分化的因子引导骨的形成42。SLIT3的 遗 传 性 缺 失 会 减 少 骨 骼CD31hiEMCNhi 型血管内皮细胞,导致骨形成受损而产生低骨量,部分逆转 Shn3-/-小鼠的高骨量表型,而成骨细胞和 CD31hiEMCNhi 血管内皮细胞之间的这种耦合对骨愈合至关重要43。综上所述,在软骨细胞中 SLIT3/ROBO2 可以通过抑制-catenin 信号通路促进软骨细胞成熟。而在干骺端中,SLIT3 可以促进 CD31hiEMCNhi 型血管的生成,从而引导骨形成。因此,SLIT3 可能会为生长板损伤后骨桥的形成治疗和预防提供治疗靶点。5 其他炎症相关调控因子生长板损伤后,炎症反应常常破坏软骨细胞的合成代谢和分解代谢平衡。有文献指出,在大鼠生长板损伤模型中的损伤反应有 4 个不同阶段 分别在第 13、37、714、1025 天发生的炎症、纤维化、成骨和骨桥成熟重构反应44。生长板损伤后的炎症期阶段,中性粒细胞、巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞等炎症细胞流入生长板损伤部位,并分泌大量细胞因子调节下游事件,导致生长板损伤部位的骨桥形成。如白细胞介素-1(interleukin-1beta,IL-1)、一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和 肿 瘤 坏 死 因 子-(tumor necrosis factor-alpha,TNF-)等迅速上调会导致 MMP1 和 MMP13 过表达,导致生长板软骨损伤后的软骨细胞、ECM 细胞凋亡45。Zhou 等46证实了 IL-1、TNF-、TGF-1 和 IGF-I 的表达可能在早期急性炎症事件以及期骨桥的形成和重塑中发挥作用。此外,有研究证实环加氧酶-2(cyclooxygen-ase-2,COX-2)对骨折部位初始炎症反应的下游过程至关重要,COX-2 表达后蛋白多糖(proteoglycan,PG)水平的增加并上调了各种炎症介质的产生,这些介质与 PG 增加炎症反应,促进损伤愈合;而直接抑制 COX-导致骨形成和骨折愈合的延迟,这说明损伤诱导的炎症反应和 COX-2 酶在组织修复过程中的重要性47。生长板损伤诱导关键炎症介质 COX-2 和 iNOS 在生长板损伤的炎症阶段显著上调,表明生长板损伤刺激大量 COX-2、iNOS 释放,进而促使骨桥在损伤生长板间隙的形成48。研究表明,在生长板损伤后的纤维化阶段,损伤生长板中生长因子 FGF-2 的 mRNA 水平显著上调46。而 FGF-2 不仅能抑制软骨细胞分化、增强碱性磷酸酶活性以及刺激骨体外吸收,还能够通过抑制来自 IGF-I 和 TGF-的关键信号传导来增加间充质细胞的成骨和软骨分化潜能49。也有研究发现,在纤维化阶段抑制血小板源生长因子受体信号传导可降低损伤后第 4 天间充质细胞的增殖和浸润水平,并且在生长板损伤后第 14 天,损伤部位的骨或软骨组织的数量也减少50。纤维化期之后,在骨桥的重塑和成熟过程中,骨小梁被骨髓细胞分隔,在静息期被扁平的纺锤状非活性成骨细胞包围,标志着非活性骨形成44。研究表明,在生长板损伤部位新生的骨小梁的某些区域可见破骨细胞,且损伤生长板上 TNF-、IGF-I 和BMP-7 的上调41。TNF-已被证明通过促进骨吸收细胞、破骨细胞的分化,在调节骨重塑中发挥重要作用,而一些细胞因子如 IL-1、TGF1 也能增强TNF 诱导破骨细胞分化,但需要进一步研究调控生长板损伤部位骨桥成熟和重塑的分子及细胞机制51。综上所述,阐明生长板损伤炎症反应的具体机制,将有助于明确炎症反应如何参与生长板损伤后生长板软骨细胞的肥大矿化以及如何维持生长板软骨细胞功能代谢,这将为生长板损伤提供新思路。6 总结与展望生长板损伤是由创伤、感染、药物、肿瘤等引起的长骨干骺端软骨损伤,是儿童及青少年常见的骨骼系统损伤类型之一,损伤常导致肢体短缩与后遗畸形。生长板损伤后骨桥形成所导致的畸形的治疗是小儿骨科医师亟待解决的热点问题。随着不断深入对生长板软骨内成骨、损伤炎症反应、损伤后血管的侵入以及损伤后生长板软骨细胞肥大分化等具体分子机制的研究发现,促进损伤生长板再生成为具备正确极性层次和发育能力的生长板软骨组织,并在此基础上抑制软骨细胞进一步快速分化为骨桥连接是恢复损伤生长板正常结构与功能的关键。因此,明确生长板损伤早期骨桥形成的具体机制,将为早期预防骨桥形成和生长板损伤的临床治疗提供新764创伤外科杂志 2023 年第 25 卷第 6 期 J Trauma Surg,2023,Vol.25,No.6的策略。作者贡献声明:任廷果:文献检索及整理、论文撰写及修改;彭国璇:研究指导、论文修改、经费支持;孙红:研究指导;林廉洋、彭洪成:文献检索;黄明智、姜华:研究指导;邓进:研究指导、论文修改及审校、经费支持 参考文献:1 Newton PT,Li L,Zhou B,et al.A radical switch in clonali-ty reveals a stem cell niche in the epiphyseal growth plateJ.Nature,2019,567(7747):234-238.DOI:10.1038/s41586-019-0989-6.2 Allas L,Boumdiene K,Baug C.Epigenetic dynamic dur-ing endochondral ossification and articular cartilage devel-opmentJ.Bone,2019,120:523-532.DOI:10.1016/j.bone.2018.10.004.3 Geiger B,Bershadsky A,Pankov R,et al.Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix-cytoskeleton crosstalkJ.Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(11):793-805.DOI:10.1038/35099066.4 Haimov 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