新型医用钛合金生物相容性评价.pdf

6 3 6 实用 口腔医学杂志( J P r a c t S t o m a t o 1 ) 2 0 1 0 S e p ， 2 6 ( 5 ) 新 型 医用钛 合金 生物相 容 性评 价 李军 魏建华 张玉梅周廉 李佐 臣 【 摘要】 目的： 评价新型医用钛合金T i l 2 5 Z r 2 5 N b 2 5 T a( T Z N T ) 的生物相容性 ， 并和3种标准医用钛材料 T i6 A I 4 V、 T i 6 A 1 7 N b 和 T A 2进行对 比。方法 ： 通过细胞毒性试验观察细胞在 T Z N T 、 T i 6 A 14 V和 T i 6 A 1 7 N b合金离子析 出培养 液中的生长情况 ， 计算 在不同时间组 的相对细胞增殖率 ， 评 价其毒性等级 ； 通过皮下埋植试验观察 4种材料植 入 白鼠体 内 4周和 8周 的组织变化情 况 ， 计算炎细胞密度和纤维膜厚 度的变化情况 ， 评 价其 引起的组织反应程度 。结果 ： T Z N T 、 T i 6 A 1 4 V和 T i 6 A 1 7 N b在 3个时 间组 ( 2 、 4 、 6 d ) 的相对细胞增殖率均不低于 1 0 0 ， 细胞毒性 等级评定为 0级 。和 T i 6 A I 4 V和 T i 6 A 1 7 N b相比 ， T Z N T和 T A 2 植入 白 鼠体内4周和8周后， 无论是炎细胞密度还是植入物周围的纤维膜厚度均有所降低， 引起的组织反应程度较低。结论：T Z N T 具有 良好的生物相容性 ， 是 一种理想 的生物医用钛合金 。 【 关键词】 钛合金 ；细胞毒性；皮下埋植 An e v a l u a t i on o n bi o c o mpa t i bi l i t y o f a ne w t i t a ni um a l l o y f o r s ur g i c a l i mpl a n t a ppl i c a t i o n L I J u n ， W E I J i a n h u a ， Z H A N G Y u m e i ， Z H O U L i a n ， L I Z u o c h e n 1 2 0 1 6 2 0 ， S c h o o l o fM a t e r i a l s E n g i n e e r i n g， S h a n g h a i U n i v e r s i t y o f E n g i n e e r i n g S c i e n c e ， C h i n a ； 2 S c h o o l o f S t o m a t o l o g y ， T h e F o u r t h Mi l i t a r y Me d i c a l U n i v e r s i t y ， X i & n ； 3 B i o m a t e r i a l s I n s t i t u t i o n ， N o r t h w e s t I n s t i t u t e f o r N o n f e r r o u s Me t a l R e s e a r c h ， X i i z n 【 A b s t r a c t 】0b j e c t i v e ： T o c o m p a r e t h e b i o c o m p a t i b i l i t y b e t w e e n a n e w t i t a n i u m a l l o y T i l 2 5 Z r 2 5 N b 2 5 T a( T Z N T )a n d t h r e e s t a n d a r d t i t a n i u m a l l o y s T i 6 A14V， T i 6 A1 7 Nb a n d T A 2 M e t h o d s ：G r o w t h o f t h e c e l l s i n t h e c u l t u r e s o l u t i o n s c o n s i s t i n g o f t h e me t a l i o n s r e l e a s e d f r o m T Z N T， T i 6 A 1 4 V a n d T i 6 A 1 7 Nb w e r e o b s e r v e d b y c y t o t o x i c t e s t T h e c e l l p r o l i f e r a t i o n r a t e s we r e c a l c u l a t e d i n d i f f e r e n t c u l t i v a t i o n t i me p o i n t s Th e ma t e r i a l s w e r e a l s o o b s e r v e d f o r 4 a n d 8 we e k s b y t h e s u b c u t a n e o u s i mp l a n t a t i o n t e s t De n s i t y o f i n f l a mma t i o n c e l l s a n d t h e t h i c k n e s s o f fi b r o u s me mb r a n e we r e o b s e rve d T h e i n fl a mma t o r y r e a c t i o n d e g r e e w a s a s s e s s e d Re s u l t s ：T h e c e l l p r o l i f e r a t i o n r a t e s o f T Z N T， T i 6 A I 4 V a n d T i 6 A I 7 N b w e r e m o r e t h a n o r e q u a l t o 1 0 0 a t d i f f e r e n t c u h i v a t i o n t i me p o i n t s ( 2 ， 4 ， 6 d ) ， t h e c y t o t o x i c i t y wa s r a n k e d a s 0 g r a d e Gr o wt h o f t he c e l l s wa s g o o d i n t h e TZNT a l l o y g r o u pThe d e n s i t y o f i n fla mma t i o n c e l l s a n d t h e t hi c k H e s s o f fib r o u s me mb r a n e we r e de c r e a s e d i n t h e T ZNT a nd TA2 g r o u p s，wh e n c o mp a r e d wi t h t ha t i n t h e Ti 6Al dV a n d Ti 6AI 7Nb g r o u p s， a t d i f f e r e n t i m p l a n t a t i o n t i me p o i n t s ( 4 w e e k s ， 8 w e e k s ) ，a n d t h e i n d u c e d t i s s u e r e a c t i o n d e g r e e w a s c o m p a r a t i v e l y l o w C o n c l u s i o n ： T ZNT h a s g o o d bi o c o mp a t i bi l i t y a nd i s a n i d e a l bi o me d i c a l ma t e r i a 1 【 K e y w o r d s 】 T i t a n i u m a ll o y ； C y to t o x ic t e s t ； S u b c u t a n e o u s i m p l a n t a t i o n t e s t 中图分类号 ： R 7 8 3 1 文 献标识码 ： A d o i ： 1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 1 3 7 3 3 2 0 1 0 0 5 0 1 9 当前在医学界广泛使用生物相容性和耐蚀性优 良 的钛合金作为硬组织修复替代材料。T i 6 A 1 4 V被最先 用作生物材料 ， 但在使用过程 中会释放少量钒( V) ， 从 而引起细胞毒性反应和生理紊乱 。随后 T i 6 A 1 7 N b 在瑞士被开发 ， 该合金用无 毒元素铌 ( N b ) 取代 了钒 ( V) ， 具有更好的生物相容性 ， 但是元素铝( A 1 ) 的存在 基金项 目： 上海市青年科技启 明星计划( A类)( 编号 ： 0 8 Q At 4 0 3 5 ) 作者单位 ： 2 0 1 6 2 0， 一 海工程技术大学材料工程学院( 李 军) ； 第四军医 大学口腔 医学院( 魏 建华 张玉梅 ) ；西安西北有 色金属研 究院生物材料研究所( 周廉李佐 臣) 通讯作者 ：李军0 2 1 6 7 7 9 1 2 0 3 E m a i l ： j a c o b l i j u n s i n a e o n l 可能引起骨质溶解和神经紊乱 。这 2种合金存在 的另一个不足就是弹性模量高， 和人体骨骼的弹性模 量严重不匹配。这会导致承受应力的金属和骨骼产生 不同的应变， 在界面出现相对位移 ， 从而造成界面处松 动 ； 另外由于应力不能完全从人体关节传递到其邻近 的骨组织 ， 可能导致骨吸收和功能退化 ， 产生应力 一 屏 蔽现象 。 本研究开发 了一种新型医用钛合金 T i l 2 5 Z r 2 5 一 N b 2 5 T a ( T Z N T) 。该合金具有 比 T i 6 A 1 4 V和 T i 6 A 1 7 N b 低的弹性模量 J ， 因而具有更优 异的生物力 学相容 性。作为一种医用材料 ， 评价其生物相容性是非常必 实用 口腔 医学杂 志( J P r a c t S t o m a t o 1 ) 2 0 1 0 S e p ， 2 6 ( 5 ) 要的。如王诗美等 采用大体标本 、 x线片 、 组织学 、 扫描电镜及计算机图像分析的方法评价骨质羟基磷灰 石( O HA) 的生物相容性 ， 探讨类骨质 羟基磷灰石作为 骨替代材料 的可行性。康 非吾等 - o 通 过体外 培养 的 方法 ， 将人骨髓问充质干细胞( MS C s ) 与制备的骨生物 衍生材料在体外联合培养 ， 观察材料对细胞在其 表面 黏附 、 增殖及表达功能的影响 ， 评价骨生物衍生材料的 细胞相容性 ， 为其用作骨组织工程支架材料提供实验 依据。由此可知 ， 对生物 医用材料进行生物相容性评 价是其能否进入I 临床研究的关键环节。本研究采用细 胞毒性试验和皮下埋植试验对 T Z N T合金生物安 全性 进行系统评价 ， 并 和其他 3种 国际标 准 医用钛 材料 T i 6 A 1 4 V、 T i 6 A 1 7 N b和 T A 2进行对比。由于文献 7 已 经采用与本试验相 同的方 法对 T A 2进行 了细胞毒性 试验 ， 因此该部分试验结果 ， 本文直接引用进行对 比。 1 实验 1 1 细胞毒 性试 验 将 T Z N T、 T i 6 A 1 4 V和 T i 6 A 1 7 N b制备成 9 m i l l 9 n q _ m1 n i l 1 的薄片， 并抛光成镜面， 用丙酮 2 0 m i n ， 三氯 乙烯 1 0 rai n ， 酒精 1 0 m i n ， 蒸馏水 1 0 mi n依次超声清洗。 经 1 2 1 o C高压灭菌 2 0 mi n后 ， 按以下步骤试验。 1 1 1 浸提液制备试验组( 各合金组 ) 浸提介质用 体积分数为 1 0 的小牛血清 D M E M培养液 ， 按试件表 面积( C il l ) 与浸提介质体积 ( m1 ) 之 比为 3 ： 2加入培养 液，置于 3 7培养箱 内2 4 h使金属离子尽可能多的 析出， 0 2 2 Ix m微孔滤膜过滤除菌 ， 制备 出材料 浸提 液。阳性( 对照 ) 组 ： 铅浓 度为 31 0 g ml 的培养 液， 阴性( 对照 ) 组 ：1 0 ( 体积分数) 小牛血清 D ME M 空白培养液。 1 1 2 细胞接种 、 培养将传代一次的原代培养家兔 成骨细胞( 图 1 ) 用细胞培养液配制 1 1 0 个 m l 细胞 悬液 ， 分注于 9 6孔培养板 ， 每孑 L 3 0 0 IX l ， 共种 3板 ， 每 观察期每种材料接种 8孑 L ， 置于细胞培养箱 ( 3 7 2 、 C O ， 的体积分数为 5 ) 培 养。2 4 h后 ， 弃去原培 养液 ， 用磷酸盐缓冲液洗涤 2次 ， 试验组分别加入 1 0 0 l 的浸提液， 对照组分别加入 1 0 0 I x l 相应的对照液 ， 继续培养 2、 4、 6 d 。 1 1 3 活细胞观察和毒性测定取一块培养 4 d的 培养板 ， 在倒置相差显微镜下观察活细胞形态并摄影 。 2 、 4、 6 d各取 一块培 养板 ， 每孑 L 加入 2 0 l Mr r r液 ( S i g m a ， U S A， 使用浓度 为 51 0 g ml ， 溶解于磷 酸 盐缓 冲液) ， 继续培养 6 h ， 吸取原液 ， 每孔加 1 5 0 l 二 甲基亚砜 ( A m r e s c o ，U S A) ， 置振荡器上振荡 1 0 m i n ， 使结 晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪测定各孑 L 吸收 值 ， 所选波长为 5 0 0 n m。计算细胞相对增殖率 相对 增殖率 =( 试验 组平 均吸光度值 阴性 对照组平均 吸 光度值)1 0 0 ， 并根据表 1 评定细胞毒性。 1 2皮 下埋 植 试验 选用健康 、 卫生情况 良好 的雄性 S D大白鼠， 分 4 图 1 成骨家兔细胞形 态 ( 2 0 0 ) F i g 1 B o n e c e l l mo r p h o l o g y o f d o me s t i c r a b b i t s (2 0 0) 表 1 评级标 准 T a b 1 S t a n d a r d o f r a n k e v a l u a t i o n 周 ， 8周 2个时间组 ， 每组 1 0只。将 T Z N T、 T i 6 A 1 4 V、 T i 6 A 1 7 N b和 T A 2加工 成 D 2 i n n1 m m 的 圆柱 体。 用丙酮 2 0 m i n 、酒精 2 0 rai n、蒸馏水 1 0 rai n依次超 声清洗。1 2 1 q C高压灭菌 2 0 mi n后 ，按 以下步骤 试 验 ：浓度为 1 戊 巴比妥钠 ，按 4 0 5 0 m g k g 体重 的剂量 ，采用腹腔注射麻醉大 白鼠。沿脊柱长轴作 左右各 2点的长切 口，分别将试样平行 于脊柱植 人， 植入体之间距离大于 1 1 2 1 1 1 ，缝合皮肤。术 后 4、 8 周分别麻醉动物后切开皮肤 ，切取种植材料及周 围组 织 ，用 4 甲醛液固定 ，从试样 中心垂直试样将组织 切成 2份 ，去除试样 ，常规石蜡包埋 ，沿其长轴进行 切片，H E染色。光学显微镜下检查试样 与结缔组织 界面区域有无炎症 、组织坏死等，并进行炎细胞记数 和膜 厚度 测 量 。 实用 口腔医学杂志 ( J P r a c t S t o n mt o 1 ) 2 0 1 0 S e p ， 2 6 ( 5 ) 6 3 9 表 4不 同植入材料 4周 和 8周 的炎细胞密度 和纤 维膜 厚度 Ta b 4 De ns i t y o f i nfl a mma t i o n c e l l s a nd t hi c kn e s s o f f i br o u s me mb r a n e f o r di f f e r e n t ma t e r i a l s a t 4 we e k s a n d 8 we ek s A： 4周组 ( 2 0 0 ) ； B： 4周组 ( 4 0 0 ) ；C： 8周组 ( 2 0 0 ) ； D： 8周组 ( 4 0 0) 图 3 T Z N T合金植 入 4周和 8周 的组 织形貌 A：F o r 4 w e e k s ( 2 0 0 ) ； B： F o r 4 w e e k s ( 4 0 0 ) ；C ：F o r 8 w e e k s ( 2 0 0 ) ； D：F o r 8 w e e k s( 4 0 0 ) F i g 3 T i s s u e mo r p h o l o g y o f t h e T Z N T g r o u p i mp l a n t e d f o r 4 a n d 8 w e e k s 3 讨论 根据国际标准化组织 ( I S O)和 中国卫生部的规 定 ，安全性评价方 法 主要 有两类 ：一是 动物体 内实 验 ，即将材料植入动物体 内，然后分阶段将植入物连 同周围组织 取 出，做组织学 检查 ；另一类 是体外实 验 ，即将材料或其浸提液与体外培养细胞直接接触 ， 观察其对细胞生长及增殖 的影响。本试验通过以上两 类试验对 T Z N T生物相容性进行了系统 的评价 。 细胞毒性试验结果测得吸光度值和细胞相对增殖 率的大小反映 了活 细胞数量及材料 对细胞生 长的影 响。从表 2可以看出 ，阳性组培养 2 d时，吸光度值 为 0 1 8 7 7 5，时间延长到 4 d ，增加到 0 2 8 5 7 5，进 一 步延长至 6 d时 ，减少至 0 2 3 5 l 3 ，表明随时间的 延长 ，细胞生长受到抑制。该组在不 同培养时间的相 对增殖率 明显低 于 1 0 0 ，毒性 等级为 2级或 3级 ， 表明该组 具有潜在 的毒 性。孟金萍 等 的研 究结果 表明铅会使 细胞 的生长 活性 、集落 形成能 力逐渐降 低 ，显示铅对细胞生长的强抑作用。本试验结果也证 实 了这一点。钛合金组 的吸光度值显著高于 阳性组 ， 并随时间延长呈递增趋势 ， 表 明该组有利于细胞的繁 殖生长 。尽管各合金组在相同培养时间吸光度值无显 著差异 ， 但还是有规律可循 ， 即在相同培养时间 ， 吸光 度值由大到小的次序为 T Z N T、 T i 6 A 1 7 N b 、 T i 6 A 1 4 V，说 明 T Z N T组更有利于细胞的繁殖 生长。钛合金组相对 增殖率均等于或高于 1 0 0 ，毒性等级均为 0级 ，表 明合金组不具有细胞毒性 。已有 的研究结果表明 T A 2 在培养 2 、 4、 6 d的相对增殖率分别 为 1 0 3 ，1 0 5 实用 口腔 医学杂志 ( J P r a c t S t o m a t o 1 ) 2 0 1 0 S e p ， 2 6 ( 5 ) 和 1 0 7 ，毒性 等级均 为 0级 J 。这 说 明 T Z N T和 纯 钛一样具有优异的细胞相容性 ，这可能是由于新型合 金中 r r i 、Z r 、N b和 T a 4种元素在培养液作用下形成 外层富含羟基的氧化膜所致。在氧化膜介导之下，细 胞移行 、贴 附到合金表 面，进而细胞有丝分裂 、增 殖，合成大量细胞外基质 ，最终利于细胞分化及功能 表达 ，达到 良好、稳定合金 一 组织界面 。 皮下埋植试验结果表明 T Z N T和 T A 2比 T i 6 A 1 4 V、 T i 6 A 1 7 N b引起的组织反应要轻，因而具有更好的组织 相容性。影响组织与材料反应程度的主要因素是材料 本身性质。材料性质不同 ，材料在使用环境中的耐蚀 性能就存在差异 ，进而影响到其生物相容性。这是因 为材料的使用环境为约含 1 氯化钠及少量其他盐类 和有机物的人体体液 ，温度保持在 3 7左右。这种 环境极易对金属材料产生腐蚀 ，析出的金属离子和腐 蚀产物与邻近的组织接触 ，甚至渗入正常的组织或整 个生物系统，对正常组织产生影响和刺激 ，引起包括 组织非正常生长 、畸变或炎症 、感染 等不 良生物反 应 ，甚至诱发癌变。文献 1 0提 出了金 属和组织 相互 反应的判据 ：如果一种金 属腐 蚀产 物 的 P k值 ( P k=l g k ， k为溶解度 ， m o l L ) 大于 l 4， 那么该产物 可以稳定存在 ， 进而阻止金属和组织相互反应 ； 反之 ， 腐蚀产物就发生溶解 ， 以离子形式进入人体并被传送 到不同器 官， 细 胞毒性 反应就 可能 出现。根 据文献 1 1 1 2 给出的一些钛合金组 成元素基本腐蚀产物 化学性质数据， 可知元素 V的基本腐蚀产物 V ： 0 的 P k值为 l 0， 小于 l 4 ， 易发生水解进人 体液 ， V本身还 具有毒性 ， 因此很容易对组织造成伤害。元素 A l 的基 本腐蚀产物 A 1 O 的 P k 值为 1 5 ， 大于 1 4 ， 可以稳定存 在， 但是该元素存在引起骨疽的潜在危险。而 T i 、 z r 、 N b 、 T a这 4种元素基本腐蚀产物 T i O 、 Z r O 、N b ： O 、 T a ， O 的 P k值分别为 1 8 、1 7 、 2 0、 2 0 ，均大于 1 4 ，能 够稳定存在 ，并且这4种元素本身呈惰性 ，对组织不 产生毒性 。基于以上分析，不难得出如下结论 ，即以 Z r 、N b 、T a作 为强化 元素 的新 型医用钛 合金 T Z N T 比 T i 6 A 1 7 N b和 T i 6 M4 V具有更好的生物相容性。 参 考 文 献 1 K a r a y a n A I ，P a r k S W，L e e K MC o r r o s i o n b e h a v i o r o f T i T a N b a l l o y s i n s i m u l a t e d p h y s i o l o g i c a l m e d i a J Ma t e r L e t t ， 2 0 0 8 ， 6 2 ( I 2一l 3 ) ： 1 8 4 31 8 4 5 2 G o r d i n a D M，G l o r i a n t a T，N e m t o i b G，e t a 1 S y n t h e s i s ， s t r uc t u r e a n d e l e c t r o c h e mi c a l b e h a v i o r o f a be t a Ti 1 2Mo 一 5 T a a l l o y a s n e w b i o m a t e r i a l J M a t e r L e t t ，2 0 0 5 ，5 9 ( 2 3) ：2 9 3 62 9 4 1 3 G e e t h a M， K a m a c h i M，G o g i a A K， e t a 1 I n fl u e n c e o f m i c r o s t r u c t ur e a n d a l l o y i n g e l e men t s O il c o r r o s i o n b e h a v i o r o f T i 一 1 3 N b 一 1 3 Z r a l l o y J C o r r o s S c i ， 2 0 0 4， 4 6 ( 4 ) ： 8 7 7 8 9 2 4 李军 ，周 廉 ，李佐 臣 ，等新 型 医用钛 合金 T i 一 1 2 5 Z r 一 2 5 N b 一 2 5 T a的研 究 J 稀 有金属材料 与工程 ， 2 0 0 3 ， 3 2 ( 5 ) ： 3 9 8 4 0 0 5 王诗美， 鲜苏琴，廖运茂类骨质羟基磷灰石修复骨缺 损的实验研究 J 实用 E l 腔医学杂志， 2 0 0 6 ， 2 2 ( 5 ) ： 7 0 0 7 03 6 康非吾，唐休发，温玉明，等人骨生物衍生材料细胞 相容性的实验研究 J 实用口腔医学杂志， 2 0 0 6 ， 2 2 ( 6 ) ： 7 8 7 7 8 9 7 李佐 臣， 李常亮 ， 裘松波 ， 等外壳植 入 T A M Z合金生物 学评价 J 稀有金属材 料 与工 程 ，1 9 9 8 ，2 7 ( 1 ) ： 5 9 6 2 8 孟金萍， 孙淑华，王艳蓉等不同浓度铅暴露对细胞 生长活性的影响 J 毒理学杂志 ， 2 0 0 7 ，1 0 ( 2 1 ) ： 4 0 5 4 06 9 魏艳 萍 ， 赵彦涛 ， 许智轩 ， 等2种新型骨植入钛合 金的 细胞 生物相容性研 究 J 实用 口腔 医学杂志 ， 2 0 0 7 ， 2 3 ( 1 )： 5 45 6 f 1 0 1 S t e i n e ma n n S G， P e r r e n S MT i t a n i m n S c i e n e e a n d T e c h n o l o g y C P r o c e e d i n g s o f t h e fi ft h i n t e r n a t i o n a l c o lff e r e n c e o n t i t a n i u m ，Mu n i c h： FRG，1 9 8 4 1 1 梁英教物理化学 M 北京 ： 冶金工业出版社 ， 1 9 9 5 ： 3 6 93 7 7 1 2 J o n s s o n A K， N i k l a s s o n G A，V e s z e l e i ME l e c t r i c a l p r o p e r - t i e s o f Z r O 2 t h i n f i l ms J T h i n S o l i d F i l m s ， 2 0 0 2 ， 4 0 2 ( 1 2)： 2 4 22 4 7 ( 收稿 ： 2 0 0 9 1 1 - 0 2 修 回： 2 0 1 0 -02 1 0 )