双酚S对秀丽隐杆线虫精子生成相关基因表达的影响.pdf

1 8 3CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 5 月第 35 卷第 3 期双酚S对秀丽隐杆线虫精子生成相关基因表达的影响唐娇1，2，谭剑斌2，#，茅莉娜3，张紫虹2，李文立2，胡帅尔2，赵敏2，*(1广东省公共卫生研究院健康风险评估研究室，广东广州511430；2广东省疾病预防控制中心卫生毒理所，广东广州511430；3广东省生物制品与药物研究所药理研究室，广东广州510440)Effects of bisphenol S onexpression of spermiogenesisgenes in C.elegansTANG Jiao1,2,TAN Jianbin2,#,MAO Lina3,ZHANG Zihong2,LI Wenli2,HU Shuaier2,ZHAO Min2,*(1.Institute of Health Risk Assessment,Guangdong Provincial Instituteof Public Health,Guangzhou 511430;2.Institute of Toxicology,Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 511430;3.Department of Pharmacological Research,Guangdong Provincial Institute of Biological Products andMateria Medica,Guangzhou 510440,Guangdong,China)收稿日期：2022-11-03；修订日期：2023-04-17基金项目：广东省医学科学技术研究基金(A2019562，C2019055)；广东省中医药局科研项目(20201042，20202026，20212028)作者信息：唐娇，E-mail：；#并列第一作者，谭剑斌，E-mail：tan-。*通信作者，赵敏，E-mail：。【摘要】目的：探讨双酚S对模式生物秀丽隐杆线虫精子生成相关基因表达的影响。方法：根据双酚S的急性毒性试验结果确定本研究剂量为0、3、30、300 mol/L，对同步化至L4期的线虫进行24 h暴露，测定其子代数目并用实时荧光定量PCR(qPCR)检测akt-1、swm-1、try-5、spe-4、spe-6 基因表达水平。结果：秀丽隐杆线虫于双酚 S 中暴露 24 h 后，其半数致死浓度(LC50)为2 773.672 mol/L；与对照组相比，暴露后的L4期秀丽隐杆线虫在双酚S剂量为3、30、300 mol/L时子代数目均显著降低(P0.05或P0.01)；akt-1 mRNA在3 mol/L时的表达水平升高(P0.05)；swm-1、try-5、spe-4、spe-6 mRNA在30和300 mol/L时表达水平均升高(P0.05或P0.01)。结论：双酚S对秀丽隐杆线虫精子生成相关基因表达有影响。【关键词】秀丽隐杆线虫；双酚S；精子生成；模式生物中图分类号：R994.6文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)03-0183-04doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.004【ABSTRACT】OBJECTIVE：To investigate effects of bisphenol S on expression of spermiogenesis genes inCaenorhabditis elegans(C.elegans).METHODS：Nematodes at L4 stage were exposed to bisphenol S for 24 h(with the concentrations of 0，3，30，300 mol/L based on the acute toxicity test)，brood size and expressionlevels of akt-1，swm-1，try-5，spe-4 and spe-6 genes were detected by real-time fluorescence quantitativePCR.RESULTS：After the 24 h exposure to bisphenol S，the LC50was determined to be 2 773.672 mol/L.Compared to the control group，exposure with the concentrations of 3，30 and 300 mol/L significantlyreduced the brood size(P0.05 or P0.01).In addition，the mRNA level of akt-1 was increased at theconcentration of 3 mol/L(P0.05)；the expression level of swm-1，try-5，spe-4 and spe-6 mRNA wereincreased in the 30 and 300 mol/L treatment groups(P0.05 or P0.01).CONCLUSION：Expressions ofspermiogenesis genes in C.elegans were affected from exposure to bisphenol S.【KEY WORDS】Caenorhabditis elegans；bisphenol S；spermiogenesis；model organism双 酚 S 化 学 名 称 为 4,4-磺 酰 基 二 苯 酚(4,4-sulfonyldiphenol，BPS)，是双酚 A 的结构类似物。毒理学研究和人群流行病学调查证明双酚A具有雌激素作用，对生殖系统、肝脏具有一定损伤作用1，被禁止用于食品包装材料2-3，双酚S由于具有耐热、耐光、抗氧化等性能而成为双酚A最普遍的替代物用于食品包装材料4。然而，近年研究发现，在油脂、酸性或外界环境的影响下，包装材料中的双酚S极易迁移至食品中，导致人体生物样本中双酚S的检出率逐年上升，人群暴露水平呈递增趋势5。双酚S的安全性及人群暴露风险受到越来越多的关注。秀丽隐杆线虫由于遗传背景清晰，与人类基因同源性高，符合国际要求的“3R”原则等多种优点，成为评价食品毒理效应及机制探讨的理想模式生物6。因此，本实验以秀丽隐杆线虫为研究对象，探讨双酚S对线虫精子生成相关基因表达的影响，为双酚S的安全性研究资料提论著癌变畸变突变1 8 4CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 2023供有益补充。1材料与方法1.1主要材料和仪器设备双酚 S(CAS：80-09-1)购自阿拉丁公司，纯度99%；秀丽隐杆线虫N2野生型、大肠杆菌OP50由华南农业大学植物病理学教研室惠赠；Trizol 试剂、cDNA反转录试剂盒、SYBR Green半定量PCR试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；CFX96 Touch实时荧光 定 量 PCR(quantitativereal-time，qPCR)仪(Bio-Rad，美国)；生化培养箱(ZHUJIANG LRH-250A)购于广东泰宏君公司；电热恒温培养箱(DHP-9052)购于中仪国科(北京)科技有限公司；涡旋振荡器(IKA，德国)；高速离心机(Thermo Fisher Scientific，美国)；体视显微镜(Nikon SMZ745，日本)；细胞组织破碎仪(Bullet Blender Gold，Next Advance，美国)。1.2试验方法1.2.1剂 量 设 计将 双 酚 S 溶 解 于 二 甲 基 亚 砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，根据试验设计配置浓度分别为5 000、2 000、200、20、2 mol/L的双酚S溶液，溶液中DMSO的终浓度全部为0.2%，进行急性毒性试验，求得半数致死浓度(lethal concentration50%，LC50)后，以1/1 000、1/100和1/10的LC50浓度分别为约3、30和300 mol/L进行子代数目和精子生成相关基因表达的测定试验。1.2.2秀丽隐杆线虫同步化用S缓冲液将体内含有大量虫卵的成虫从线虫生长培养基(nematode growthmedium，NGM)冲洗至15 mL离心管中，反复冲洗两次以洗去线虫身上的大肠杆菌OP50，弃上清，将配置好的碱性裂解液(4%的NaClO、2 mol/L的NaOH、灭菌水体积比为111)按线虫体积等比例加入离心管中，边振荡边观察，至虫体全部裂解，离心去上清，将虫卵用S缓冲液反复冲洗3次，取100 L沉淀接种到涂布有大肠杆菌OP50的NGM培养基上，放入20 生化培养箱过夜得到L1期线虫，继续培养约48 h，得到L4期线虫。1.2.3急性毒性试验在96孔板上加入不同浓度双酚S溶液200 L，每个浓度设3个平行孔，然后用挑针在每孔中加入约 40 条 L4 期线虫，记录受试虫数(n总)。染毒24 h，用显微镜观察每孔线虫状态，记录线虫死亡数目(n24 h)。线虫死亡的判断标准：咽泵停止运动，用铂丝多次触碰虫体无反应。死亡率(%)=n24h/n总100%。1.2.4子代数目的测定挑取同步化培养至L4期的雌雄同体线虫到涂布有不同浓度双酚S的NGM培养基上，进行24 h暴露。暴露结束后，在每个平板中挑取1只待测的线虫，放入20 生化培养箱培养。在产卵期内每天将线虫转移到一个新的平板上，含有虫卵的旧平板继续放置在20 生化培养箱培养24 h，然后对每个平板上的线虫数目进行统计，待线虫排卵期结束，将每个平板线虫数目相加，计算每条线虫总的子代数目。1.2.5精子生成相关基因测定使用qPCR检测精子生成相关基因的表达。将同步化培养至L4期线虫分别在涂布有不同浓度双酚S的NGM培养基上，进行24 h暴露后，采用Trizol法提取线虫的总RNA，然后逆转录成cDNA进行qPCR。引物根据线虫数据库的序列以及美国国家生物技术信息中心进行设计，具体引物序列 见 表 1。反 应 体 系 为：SYBR Green qPCR Mix(2，High ROX)10 L，上、下游引物(3 mol/L)各1 L，去离子水7 L，cDNA 1 L，组成20 L反应体系。扩增步骤为：95 预变性 2 min，95、15 s，60 退火 30 s，采集荧光信号，40 个循环，72、30 s延伸，act-1作为参考基因，使用2-CT法分析比较akt-1、swm-1、try-5、spe-4、spe-6基因的mRNA相对表达水平。1.3统计方法所有实验均重复3次，采用SPSS 18.0软件对数据进行统计学分析，急性毒性试验采用概率分析(probitanalysis-Spearman)，计算线虫双酚 S 染毒 24 h 后的LC50；计量资料用x s表示，采用单因素方差分析，两两比较选择Dunnett-t检验，P0.05为差异有统计学意义。表1精子生成相关基因的引物序列(5-3)基因akt-1swm-1try-5spe-4spe-6act-1上游序列GTGGGGAGTTGGAGTTGTGGAAAATGCGTCGAAGTATCTGACTTCATTTGGATGGGGTTCATTTCTGCCGCTCTTGGTATGAAGGAGTCCCGAAGCAATATGTGTGACGACGAGGTT下游序列CTTGCTTGGGAACCTTAGACGAACGAAACCTTTGGAGCCACCACTGTCACCAGAGCAATCATCCGTAAAGTTGCTCCCCTGAGACAGCAAATCACCGAGAAGCACTTGCGGTGAAC论著癌变畸变突变1 8 5CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS2023 年 5 月第 35 卷第 3 期2结果2.1双酚S对秀丽隐杆线虫的急性毒性试验经24 h暴露得到不同浓度双酚S对秀丽线虫的致死数据，如表2所示。利用SPSS软件中的PROBIT模块进行计算，根据 3 次毒性试验结果，取 3 次平均死亡率进行分析，可得到双酚 S 暴露 24 h 的 LC50为2 773.672 mol/L，故后续以 1/1 000、1/100 和 1/10的LC50浓度分别为约3、30和300 mol/L进行子代数目和精子生成相关基因表达的测定。2.2双酚 S 暴露 24 h 对秀丽隐杆线虫子代数目的影响3、30和300 mol/L双酚S作用24 h后秀丽隐杆线虫子代数目分别为197.632.4、184.539.5和180.442.9，与阴性对照组的(226.134.6)相比，各剂量组子代数目均明显下降，差异均有统计学意义(P0.05或0.01)。2.3双酚S暴露24 h对秀丽隐杆线虫精子生成相关基因mRNA表达的影响将数值标准化，阴性对照组的基因表达水平定义为1。如表3所示，与阴性对照组相比，当双酚S浓度为 3 mol/L 时，akt-1 基因 mRNA 表达水平上调(P0.05)；当双酚 S 浓度为 30、300 mol/L 时，swm-1、try-5、spe-4、spe-6 基因的 mRNA 表达水平上调(P0.05或0.01)。3讨论双酚S由于成为双酚A的替代物在食品包装中广泛使用，使其安全性得到广泛关注。目前研究表明，双酚S具有内分泌干扰活性、遗传毒性，对哺乳动物及斑马鱼有生殖毒性和发育毒性7-8。生殖毒性方面，文献报道双酚S可以通过氧化应激途径介导生精细胞凋亡和类固醇激素合成障碍，从而导致生殖系统功能障碍9。本文以秀丽隐杆线虫作为模式生物，研究双酚S对精子生成相关基因的影响。本研究经过急性暴露试验得到双酚 S 的 LC50为2 773.672 mol/L(换算后为694 mg/L)，与之前文献报道的545.59 mg/L在一个数量级10。在评价生殖能力方面，子代数目是 N2 野生型秀丽隐杆线虫的经典指标，主要考察的是秀丽隐杆线虫的繁殖能力。本研究表明双酚S在3、30、300 mol/L剂量时均可引起子代数目降低，并与对照组相比差异有统计学意义。之前也有文献报道当双酚S剂量为0.01 mol/L时，秀丽隐杆线虫的子代数目显著降低10-11，提示双酚S暴露后可能导致秀丽隐杆线虫的生殖细胞受损而引起繁殖能力下降。生殖细胞生成精细胞，精细胞成为有活力可以受精的精子，这些过程受多种信号通路的调控。在观察影响的基因时，本文选取了精子发生相关基因akt-1 和精子形成相关基因 swm-1、try-5、spe-4、spe-612。因为akt-1属于Insulin/IGF通路，该通路是精子发生过程中关键的调控通路之一13。实验表明尽管线虫暴露在3 mol/L双酚S时，可以使akt-1 mRNA的表达量增加(P0.05)，但随着双酚 S 剂量的增加，mRNA的表达量开始下调，但与对照组相比差异并无统计学意义。说明双酚S对秀丽隐杆线虫的精子生成影响并不是通过基因akt-1的表达进而影响Insulin/IGF通路导致的，在后续试验中还需要验证该通路中的其他受体基因，进一步确定双酚S是否介导该通路而影响精子发生引起子代数目降低。swm-1信号通路是调节精子形成过程的关键通路之一14-15；try-5使秀丽隐杆线虫的精子在合适的时间活化16；spe-6是类酪蛋白激酶1蛋白，在精子发生过程中影响精细胞的分裂，精子形成的发动需要下调spe-6蛋白的表达，同时也在精子活化方面发挥作用17-19；spe-4可以抑制精子的活化20。实验结果表明，与对照组相比，双酚S暴露后精子形成相关基因swm-1、try-5、spe-4、spe-6表达量均上升，导致精子活化异常，从而导致生殖能力降低。在后期研究中，将利用雄性突变体秀丽隐杆线虫进一步验证。表2双酚S经24 h暴露后秀丽隐杆线虫死亡率分组阴性对照组双酚S 2 mol/L20 mol/L200 mol/L2 000 mol/L5 000 mol/L第1次试验3.3%7.5%5.8%9.0%16.7%79.6%第2次试验2.4%3.3%5.5%3.2%15.1%59.7%第3次试验4.0%2.1%4.4%4.0%16.5%57.4%平均死亡率3.2%4.3%5.2%5.4%16.1%65.6%分组阴性对照组双酚S 3 mol/L30 mol/L300 mol/Lakt-11.0000.0401.5940.312*1.1160.2330.8430.014swm-11.0000.1300.7430.1697.5362.013*10.6881.792*try-51.0000.1200.6200.29858.26711.491*143.86940.029*spe-41.0000.6701.7860.29612.3601.733*24.6482.857*spe-61.0000.3601.3280.3772.5870.274*5.3290.908*表3不同浓度双酚S暴露24 h后秀丽隐杆线虫精子生成相关基因mRNA的相对表达水平与阴性对照组比较，*P0.05；*P0.01.论著癌变畸变突变1 8 6CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 2023参考文献1HUANG Y Q,WONG C K,ZHENG J S,et al.Bisphenol A(BPA)in China:a review of sources,environmental levels,andpotential human health impactsJ.Environ Int,2012,42:91-99.2FISCHNALLER M,BAKRY R,BONN G K.A simple methodfor the enrichment of bisphenols using boron nitrideJ.FoodChem,2016,194:149-155.3Emily A,Lise R R.Bisphenol A in January 2015:Frenchprohibition and EFSA study J.Eur Food Feed Law Rev,2015,10(2):138.4ROCHESTER J R,BOLDEN A L.Bisphenol S and F:asystematic review and comparison of the hormonal activity ofbisphenol A substitutesJ.Environ Health Perspect,2015,123(7):643-650.5YEXY,WONGLY,KRAMERJ,etal.Urinaryconcentrations of bisphenol A and three other bisphenols inconvenience samples of U.S.adults during 2000-2014J.Environ Sci Technol,2015,49(19):11834-11839.6CORSI A K,WIGHTMAN B,CHALFIE M.A Transparentwindow into biology:a primer on Caenorhabditis 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