列车内部不同客体上接触性DNA检验方法的比较.pdf

收稿日期:;修回日期:;录用日期:基金项目:国家重点研发计划课题(N o Y F C )资助项目.E m a i l:f a n y o y o c o m列车内部不同客体上接触性D N A检验方法的比较范光耀a,Wu oN i x o nA u s t i na,张振清,b(a绍兴文理学院司法鉴定中心生命科学院,浙江 绍兴 )(b铁道警察学院刑事科学技术系,河南 郑州 )摘要:比较了用于高铁与地铁列车内影响列车运营安全及车厢内与犯罪相关的关键部件表面接触性D NA的不同检验方法之间的效果差异,为实际检案提供参考和借鉴.通过实验模拟,徒手接触十种高铁与地铁列车内不同部件,分别采用棉签擦拭法和脱落细胞黏取器提取各部件上潜在的接触性D NA,并比较了螯合离子交换树脂(C h e l e x 法)和C h e l e x 联合横膜式超滤管(M i c r o c o n 法)提取和纯化D NA的短串联重复序列(S T R)分型效果.高铁列车通用钥匙、高铁列车行李架边缘、高铁列车折叠桌旋转卡口上的接触性D NA使用脱落细胞黏取器效果较好,而该方法使用在高铁列车上紧急制动阀、高铁列车紧急开门按钮盖板、地铁列车屏蔽门紧急开门装置、地铁列车紧急开门装置上效果较差;C h e l e x 联合M i c r o c o n 法的等位基因总检出率()优于C h e l e x 法().棉签擦拭法和脱落细胞黏取器对于列车内接触性D NA的提取各具优势,C h e l e x联合M i c r o c o n法是一种简便有效地提高列车内部接触性D NA检验效果的方法.关键词:高铁;地铁;接触性D NA;采集方法;S T R分型中图分类号:D 文献标志码:AC o m p a r i s o no fC o n t a c tD N AE x t r a c t i o nM e t h o d so nD i f f e r e n tS u b j e c t s I n s i d e t h eT r a i nF a nG u a n g y a oa,Wu oN i x o nA u s t i na,Z h a n gZ h e n q i n g,b(aF o r e n s i cC e n t e r,C o l l e g e o fL i f eS c i e n c e s,S h a o x i n gU n i v e r s i t y,S h a o x i n g,Z h e j i a n g ,C h i n a)(bD e p a r t m e n t o fC r i m i n a lS c i e n c ea n dt e c h n o l o g y,R a i l w a yP o l i c eC o l l e g e,Z h e n g z h o u,H e n a n ,C h i n a)A b s t r a c t:T h er e s u l td i f f e r e n c eb e t w e e nd i f f e r e n tt e s t i n gm e t h o d so fc o n t a c tD NAo nt h es u r f a c eo fk e yc o m p o n e n t sw h i c ha f f e c tt h eo p e r a t i o ns a f e t yo ft h et r a i na n dr e l a t e dt ot h ec r i m ei nt h ec a r r i a g ew e r ec o m p a r e d,a n di tp r o v i d e dr e f e r e n c e sf o rt h ef o r e n s i ci n v e s t i g a t i o no fa c t u a lc r i m i n a lc a s e s C o n t a c tw a ss i m u l a t e dw i t ht h eb a r eh a n d so n d i f f e r e n to b j e c t s i n s i d et h eh i g hs p e e dt r a i na n ds u b w a y T h ec o n t a c tD NAo nt h es u r f a c eo fa l l t h eo b j e c t sw e r ec o l l e c t e db yc o t t o ns w a ba n ds h e d d i n gc e l lv i s c o s i s,a n dD NAw e r ee x t r a c t e da n dp u r i f i e db yC h e l e x j o i n tM i c r o c o n m e t h o d,r e s p e c t i v e l y T h ee f f e c to fs h o r tt a n d e mr e p e a t(S T R)t y p i n gw a sc o m p a r e da n de v a l u a t e d C o m p a r e dt ot h ee m e r g e n c yb r a k ev a l v e,t h ec o v e rp l a t eo f e l e c t r i cm u l t i p l eu n i t(EMU)t r a i ne m e r g e n c yd o o rb u t t o n,e m e r g e n c yd o o r o p e n i n gd e v i c eo fm e t r op l a t f o r ma n dc o n t a c tD NAo nt h ee m e r g e n c yd o o ro p e n i n gd e v i c eo fm e t r ot r a i n,t h es h e d d i n gc e l la d h e s i v ed e v i c e i sb e t t e r t h a nt h ec o mm o nk e yo fEMUt r a i n,e d g eo f l u g g a g er a c ka n dr o t a r yb a y o n e to ff o l d i n gt a b l eo fEMUT h ed e t e c t i o nr a t eo fa l l e l e s(D R A)o fC h e l e x j o i n t M i c r o c o n m e t h o d C h e mW o r l d,(),化化学学世世界界C h e m i c a lW o r l dD O I:/j c n k i 应用与实践A P P L I C AT I ONC h e m i c a lW o r l dA P P L I C AT I ON()w a sb e t t e rt h a nt h a to fC h e l e x m e t h o d()C o t t o ns w a bm e t h o da n ds h e d d i n gc e l lv i s c o s i sh a v et h e i ro w na d v a n t a g e si nc o l l e c t i o no fc o n t a c tD NAi n s i d et h et r a i n s,T h eC h e l e x j o i n tM i c r o c o n m e t h o dc a nb eu s e da s a s i m p l ea n de f f e c t i v em e t h o d t o i m p r o v e t h ed e t e c t i o ne f f e c t o f c o n t a c tD NAi n s i d e t h e t r a i n s K e yw o r d s:h i g hs p e e dt r a i n;s u b w a y;c o n t a c tD NA;e x t r a c t i n gm e t h o d;s h o r t t a n d e mr e p e a tg e n o t y p i n g近年来,中国的高铁、地铁发展迅速,越来越多的人选择列车出行,巨大的人流量给列车安全运营提出了很大的挑战.高铁和地铁列车内部的诸多关键部件直接影响着列车的安全运行(例如高铁列车紧急制动阀、高铁列车紧急开门按钮、地铁列车屏蔽门紧急开门装置、地铁列车紧急开门装置等).不论是乘客蓄意或误操作擅自拉动列车装置及触发报警装置,将严重影响列车的正常运营并可导致严重的行车事故,对列车内乘客生命财产构成巨大威胁.此外,列车内盗窃案件流动性、隐蔽性较强,犯罪嫌疑人作案后难以在第一时间被抓获,因此可提取的证据十分有限,从而导致破案率不高.通过列车内视频监控或目击证人可还原嫌疑人活动轨迹,提示嫌疑人触碰过的物品(例如高铁列车上的行李架、座椅调节装置、折叠桌旋钮等).但是,要在此类物证上提取到完整指纹较为困难,而接触性D NA为此类案件侦破提供了可能的手段.然而,列车内关键部件均处于公共场所,存在被嫌疑人以外人群接触的机会,常无法用于指导实际案件 .目前,仍然缺乏对列车内关键部件物证检验方法的充分评估,阻碍了接触性D NA在此类案件中发挥的重要价值.本研究从实际需求出发,系统检验并评估了对高铁与地铁列车内影响列车运营安全及与车厢内犯罪相关的部件表面接触性D NA的检验方法,以期为刑事技术人员提供借鉴.实验部分 仪器与试剂生物物证提取棉签,中国博坤生物公司;脱落细胞黏取器,中国博坤生物公司;整合离子交换树脂(C h e l e x ),美国伯乐生命医学产品有限公司;M i c r o c o n横膜式超滤管,美国密理博有限公司;P r o F l e xTMP C R扩增仪,美国应用生物系统公司;G l o b a l F i l e rTMS T R试剂盒,美国应用生物系统公司;A B I G e n e t i cA n a l y z e r遗传分析仪,美国应用生物系统公司.实验 高铁和地铁列车内D NA样本采集实验选 取 运 营 中 的 某 市 铁 路 局C RH B LG 次正常行驶的高铁列车中的种不同部位(紧急制动阀、安全锤、紧急开门按钮盖板、通用钥匙、行李架、折叠桌旋转卡口、座椅调节按钮、厕所门把手)和正常运营中的某市轨道交通一号线地铁列车中正常使用的紧急开门装置和屏蔽门紧急开门装置个部位.抓握及触压实验:实验者洁净双手h,随机模拟抓握、触压实验部件 s,每个部件重复次,共应进行 次,但安全锤、厕所门把手、座椅调节按钮由于三者表面形状特殊,未能用黏取法采集D NA参与比对,实际共进行 次采样.样本 提 取:()采 用 棉 签 两 次 转 移 法(擦 拭法).在生物物证提取棉签上,滴加 L纯水,用该棉签在遗留有抓握痕迹处反复擦拭,用干棉签擦拭相同部位,充分转移剩余细胞,常温干燥环境中保存;()脱落细胞黏取器采集法(黏取法).取出脱落细胞黏取器,小心揭开黏面保护层,用黏面在有抓握处反复粘取多次,然后放回封存盒,常温干燥环境中保存.D NA提取与纯化C h e l e x 法:用洁净的剪刀将棉签尖部剪至 m L离心管中,加入质量分数为 C h e l e x L,m g/m L蛋白酶K L,孵育 h,m i n.r/m i n离心m i n,保存待扩增.C h e l e x 联合M i c r o c o n纯 化 柱 提 取 法:重复C h e l e x 法操作步骤,取C h e l e x 法离心后的上清液约 L转入M i c r o c o n超滤离心管中,离心m i n(r/m i n),反转离心m i n(r/m i n)收集浓缩液 L,保存待扩增.D NA扩增和检验D NA扩增按照G l o b a l F i l e rTMS T R试剂盒说明书进行,其中反应体系缩小至 L,模板D NA用 C h e mW o r l d,(),化学世界应用与实践量L.所有扩增反应在P r o F l e xTMP C R扩增仪上进行,扩增产物在A B I G e n e t i cA n a l y z e r遗传分析仪上使用P O P 凝胶进行毛细管电泳检验.进样 参 数:s,k V.用G e n e M a p p e rI D Xv 软件对收集到的数据进行分析.D NA分型结果分类将短串联重复序列(S T R)分型结果按各等位基因检 出 率 分 为()、()、()、()类.等位基因检出的标准界定 为 该 基 因 座 等 位 基 因 峰 值 在 检 测 阈 值(R F U)以上;计算方法:检出率(实际检出受试者等位基因个数/期望检出全部受试者等位基因个数).单独检测受试者口腔卡拭子D NA以获取其完整S T R分型数据.经计数,在受试者(模拟抓握者)G l o b a l F i l e rTMS T R分型结果中,全部等位基因个数为 个.结果与讨论 样本采集方法比较采用擦拭法采集 节所述的高铁列车内种不同部件与地铁列车屏蔽门及地铁列车紧急开门装置表面上的接触性D NA样本,分别用C h e l e x 及C h e l e x 联合M i c r o c o n纯化柱提取法获取了全部样本的S T R分型结果.以地铁列车的屏蔽门和紧急开门装置为例,使用C h e l e x 提取法,其接触性D NA分型图谱如图所示.从图中能够观察到,清晰的等位基因各峰的数量大于 个,但达到检出限(R F U)的等位基因共计 个,其中来自实施模拟触压的实验人员的等位基因共 个(向上箭头),等位基因检出率达 ,来自外来未知D NA污染的等位基因多达个(向下箭头),样本混杂现象较为明显.统计每个样本的等位基因检出个数,种样本中,平均等位基因检出率介于 (高铁列车折叠桌旋转卡口)(地铁列车的屏蔽门和紧急开门装置).采用黏取法采集高铁列车内种不同部件(紧急制动阀、紧急开门按钮盖板、通用钥匙、行李架、折叠桌旋转卡口)与地铁列车的屏蔽门和紧急开门装置表面上的接触性D NA,分别用C h e l e x 及C h e l e x 联合M i c r o c o n纯化柱提取法获取了全部样本的S T R分型结果.种样本中,平均等位基因检出率分别为 (高铁列车紧急制动阀)和 (地铁列车紧急开门装置).计算在同一部件检出受试者等位基因个数重复次的总和,如图(a)所示.从图(a)可知,对于编号、号样本,擦拭法的分型效果优于黏取法,但二者差别并不明显,而对于编号、号样本,擦拭法的分型效果明显不如黏取法.统计各部件检出受试者等位基因的峰面积平均值,结果如图(b)所示.从图(b)可知,在可比较范围内,使用擦拭法编号号样本较其他部件具有更高的平均峰面积,而当使用黏取法时,编号号和号样本较其他部件具有更高的平均峰面积,黏取法采集的编号号样本D NA具有最为明显的优势.综合等位基因检出个数与平均峰面积两种参数统计结果,不难看出黏取法与擦拭法在采集列车内不同部件表面接触性D NA的检测效果方面存在较大差异.接触性D N A提取方法的比较对由擦试法采集的D NA,分别用C h e l e x 法及C h e l e x联合M i c r o c o n法提取并纯化D NA,个部件(高铁列车个和地铁列车个),每个部位重复次,二种方法共采集 份(n)待检D NA模板(C h e l e x 法离心后的上清液直接用于下游C h e l e x联合M i c r o c o n法),比较两种提取方法的S T R分型图谱中总体样本等位基因检出率,结果见表.表两种不同D N A提取方法的等位基因检出率比较采集法()()()()C h e l e x 法nnn nC h e l e x联合M i c r o c o n法nnn n每种提取方法提取的 份检材,期望检出全部受试者等位基因数应为 个,采用C h e l e x 法,实 际 检 出 个,总 检 出 率 为 ;采 用C h e l e x联合M i c r o c o n法,实际检出 个,总检出率为 ,由此可知采用C h e l e x联合M i c r o c o n法,相比于C h e l e x 法,等位基因检出率较高,同时,其混 杂 外 源 性D NA分 型 的 情 况 较 轻.使 用C h e l e x联合M i c r o c o n的样本中有个在 区间,而使用C h e l e x 的样本中仅有个.表明要获得较高质量的分型结果应尽量采用C h e l e x联合M i c r o c o n法.C h e mW o r l d,(),C h e m i c a lW o r l dA P P L I C AT I ON图地铁列车的屏蔽门和紧急开门装置上接触性D N A分型图谱虚线标识 R F U的等位 基因检测阈值、向上箭头 所示为来自 受 试 者 的 等 位 基 因、向 下 箭 头 所 示 为 来 自 非 受 试 者 的 混 杂 等 位 基 因(a)D ,VWA,D ,G S F P O,T P O X;(b)D S ,D S ,D S ,D Y S ;(c)D ,D S ,TH ,F GA;(d)D S ,D ,D ,D S ,S E ;(e)D S ,D S ,D S ,D S C h e mW o r l d,(),化学世界应用与实践图(a)种客体的分型结果中来自受试者的等位基因峰个数;(b)擦试法与黏取法的峰面积比较样品:高铁列车紧急制动阀;样品:高铁列车紧急开门按钮盖板;样品:高铁列车通用钥匙;样品:高铁列车行李架边缘;样品:高铁列车桌旋转卡口;样品:地铁列车屏蔽门装置;样品:地铁列车紧急开门装置;样品:高铁列车内安全锤;样品:高铁列车厕所门把手;样品:高铁列车座椅调节按钮.结论不同客体表面接触性D NA检验方法是法医物证领域的研究热点和难点之一 .鉴于接触性D NA在各类案件中发挥着越来越重要的实际作用,结合其自身微量、易降解、易污染的特点,为提高接触性D NA的一次检验成功率,有必要明确首次检验时所采用的方法并归纳总结其可能的影响因素,以扩展应对更多的疑难检材.本研究通过分析高铁与城轨列车内影响列车运营安全及与车厢内犯罪相关的部件表面接触性D NA检验方法,使一线刑侦技术人员在进行生物物证提取时,能够对检验效果有合理预判,为铁路公安在案件现场快速提取生物物证固定证据提供参考与借鉴.建议对于动车组列车通用钥匙、动车组列车行李架边缘、动车组列车折叠桌旋转卡口等部位接触性D NA的提取应当采用黏取法,而应对动车组列车紧急制动阀、动车组列车紧急开门按钮盖板、地铁列车紧急开门装置、地铁屏蔽门紧急开门装置时,擦拭法也有实用价值.考虑到现场操作性,对于列车内安全锤、列车内门把手、动车组列车座椅调节按钮等建议使用擦拭法提取.近年来开发了许多应对接触性D NA的提取方法(例如,磁珠法、m i n i S T R法、直扩法等).考虑到提取成本,目前大多数实验室的首次D NA提取仍然倾向于采取C h e l e x 法,而对接触性D NA而言,检材量十分有限,因而往往没有二次检材D NA提取的机会,在此类特殊检材无法通过常规C h e l e x 法获得满意的分型效果时,应积极采用C h e l e x 联合M i c r o c o n法进行再次检验.参考文献张践,李建明高速铁路调度应急指挥系统研究J中国铁路,:郑秀芬,纪贵金,刘超,等二组分混合D NA样品S T R图谱解释J中国法医学杂志,():Q u i n o n e sI,D a n i e lBC e l lF r e eD NAa saC o m p o n e n to fF o r e n s i cE v i d e n c eR e c o v e r e df r o m T o u c h e dS u r f a c e sJF o r e n s i cS c i I n t:G e n e t,():黄艳梅,王萌鸽,赵兴春接触D NA在法医实践中的应 用 研 究 进 展 J中 国 法 医 学 杂 志,():夏雷,段紫英,陈立彰,富渭鑫外衣兜内接触性D NA的检验J刑事技术,():P a n gBC M,C h e u n gB K KD o u b l eS w a bT e c h n i q u ef o r C o l l e c t i n g T o u c h e d E v i d e n c eJL e gM e d,():吴翟灵,罗亚平,王颖希,焦章平渗透性客体表面手印接触D NA提取研究进展J化学研究与应用,():F a nGY,L iW,L i ST,e t a l A nE v a l u a t i o no f t h eP e r f o r m a n c eo fD NA R e c o v e r yf r o m F i r e dF i r e a r m sa n d C a r t r i d g e C a s e s U s i n g M i c r o d i a l y s i s F i l t r a t i o nJF o r e n s i cS c iI n t:G e n e tS u p p lS e r,:e e 董正志,韩清顺,郭科建,等触摸痕中接触D NA检验概述J中国法医学杂志,:H e d m a nJ,J a n s s o nL,A k e lY,e ta lT h eD o u b l e s w a b T e c h n i q u e V e r s u s S i n g l e S w a b sf o r H u m a nD NA R e c o v e r yf r o m V a r i o u sS u r f a c e sJ F o r e n s i cS c i I n t:G e n e t,:L o w eA,M u r r a yC,Wh i t a k e r J,e t a l T h eP r o p e n s i t yo fI n d i v i d u a l st o D e p o s i tD NA a n d S e c o n d a r yT r a n s f e ro fL o wL e v e lD NAf r o mI n d i v i d u a l s t o I n e r tS u r f a c e sJ F o r e n s i cS c i I n t,():W a n g C Z,S t a n c i u C E,E h r h a r d t C J,e ta lN a n o s c a l eC h a r a c t e r i z a t i o no fF o r e n s i c a l l y R e l e v a n tE p i t h e l i a lC e l l sa n dS u r f a c eA s s o c i a t e dE x t r a c e l l u l a rD NAJ F o r e n s i cS c i I n t,:B u r r i l l J,D a n i e l B,F r a s c i o n e,N AR e v i e wo fT r a c eT o u c hD NAD e p o s i t sV a r i a b i l i t yF a c t o r sa n da nE x p l o r a t i o no fC e l l u l a rC o m p o s i t i o nJF o r e n s i cS c iI n tG e n e t,:C h e mW o r l d,(),