基于双波长等基线差示融合图谱的中药黄芩“质-量”双标质量分析方法研究.pdf

第42 卷 第 8 期2023 年8 月Vol.42 No.8968975分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO（Journal of Instrumental Analysis）基于双波长等基线差示融合图谱的中药黄芩“质量”双标质量分析方法研究张强1，罗曦1，李天娇1，2，3，王帅1，2，3，包永睿1，2，3，关欣4*，孟宪生1，2，3*（1辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2辽宁省中药多维分析专业创新技术中心，辽宁 大连 116600；3辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600；4中国人民解放军北部战区总医院 肾脏病科，辽宁 沈阳 110016）摘要：建立了以对照药材为基准物质的定性和不依赖多种对照品定量的黄芩药材“质量”双标控制方法。采用高效液相色谱（HPLC）技术，以对照药材为基准物质建立了黄芩特征图谱，通过鉴定特征峰的化学成分，共确定了11个共有特征峰，通过质谱鉴定出黄岑药材的8个成分，经对照品比对，指认出共有特征峰中的4个化学成分，分别为黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素以及汉黄芩素。通过对照药材和供试药材特征峰的相似度，可明确药材真伪，即“质”，结果显示各批次供试药材与黄芩对照药材的相似度均大于0.990；对内标成分“黄芩苷”进行准确定量，以内标成分计算不同批次供试品中各特征峰的相对含量，取“平均数标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限，依据特征峰相对含量下限明确黄芩药材优劣，即“量”。该方法不依赖多种对照品，能清晰、快速地判断药材的真伪优劣，可为黄芩的质量控制方法提供参考。关键词：黄芩；对照药材；质量控制；特征图谱；黄芩苷；双波长等基线差示融合中图分类号：O657.7；R284 文献标识码：A 文章编号：1004-4957（2023）08-0968-08Study on“QualityQuantity”Double Standards Quality Analysis Method for Traditional Chinese Medicine Scutellaria Baicalensis Georgi Based on Dual Wavelength Equal Baseline Differential Fusion SpectrumZHANG Qiang1，LUO Xi1，LI Tian-jiao1，2，3，WANG Shuai1，2，3，BAO Yong-rui1，2，3，GUAN Xin4*，MENG Xian-sheng1，2，3*（1School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；2Professional Innovation Technology Center for Multidimensional Analysis of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China；3Liaoning Province Modern Chinese Medicine Research Engineering Laboratory，Dalian 116600，China；4Nephrology Department，General Hospital of Northern Theater of the Chinese People s Liberation Army，Shenyang 110016，China）Abstract：A qualitative and quantitative double standards control method for Scutellaria baicalensis Georgi was established，which takes the reference traditional Chinese medicinal materials as the primary standard but does not rely on the quantification of multiple reference materialsThe characteristic chromatogram for Scutellaria baicalensis Georgi was established by using HPLC technique and the reference traditional Chinese medicinal materials as the primary standardThe chemical components of the characteristic peaks were identified by QTOF MSA total of 11 common characteristic peaks were indentified，and 8 components of Scutellaria Baicalensis Georgi were identified through MS identificationAfter comparison with reference materials，four chemical components were identified among the common characteristic peaks，namely baicalin，wogonoside，baicalein and wogoninBased on the similarity of characteristic peaks between the control and test medicinal materials，the authenticity of the medicinal materials，i.e.“quality”，was determinedThe similarities between each batch of test medicinal materials and the doi：10.19969/j.fxcsxb.23051402收稿日期：20230514；修回日期：20230611基金项目：辽宁省中医药现代化研究创新团队项目（LT2017015）通讯作者：孟宪生，博士，教授，研究方向：药效物质组学和作用机制整合研究，E-mail：关 欣，博士，副主任医师，研究方向：慢性肾病与难治性肾病基础与临床研究，E-mail：第 8 期张强等：基于双波长等基线差示融合图谱的中药黄芩“质量”双标质量分析方法研究control medicinal materials of Scutellaria baicalensis Georgi were greater than 0.990The internal standard component“baicalin”was accurately quantified，which was used to calculate the relative content of each characteristic peak in different batches of test samplesThe“value of subtracting the standard deviation from the mean”was taken as the lower limit for the relative content of the chemical components of the characteristic peak relative to the chemical components of the internal standard substanceThe advantages and disadvantages of Scutellaria baicalensis Georgi were determined according to the lower limit for the relative content of the characteristic peak，that is，the“quantity”This method could be used to clearly and quickly determine the authenticity of medicinal materials without any reliance on multiple reference materials，providing a reference for the quality control methods for scutellaria baicalensis.Key words：Scutellaria baicalensis Georgi；reference traditional Chinese medicinal materials；quality control；specific chromatogram；baicalin；dual wavelength equal baseline differential fusion黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，味苦、性寒，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效1。黄芩在我国分布广泛，遍及东北、华北、西南、华中等地区2。现代药理学研究发现黄芩具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、护肝、抑制-葡萄糖苷酶及神经保护等药理活性39，同时证明黄酮及其苷类是黄芩中含量最高的成分，也是其药效成分，包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等10。其中黄芩苷具有显著抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡的能力11；汉黄芩苷具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌等多种药理活性12；黄芩素的抗菌效力较强，抗菌谱广13；汉黄芩素也显示出良好的抗肿瘤效果14。上述化学成分被认为是黄芩中的主要活性成分，能全面科学地反映中药黄芩的内在质量。目前，中药的质量控制方法主要包括单指标含量测定法、多指标含量测定法、一测多评法和指纹图谱与含量测定结合法等15。以上方法具有灵敏度高、重复性好、指标明确的优点，能够为黄芩药材质量控制提供量化数据，但也存在单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣等不足，同时，中药复杂体系质量评控技术的难度大、成本高，给中药企业带来了巨大压力，导致对中药临床合理用药和临床疗效提升的指导和支持作用一直难以体现。针对上述问题，本文提出了一种基于“质量”双标的黄芩质量分析方法，不需要购买大量对照品，以能够反映黄芩药效的化学成分为指标，采用其自身参照物对特征峰化学成分进行相对定量，最大程度地控制供试药材有效化学成分的含量。同时，针对单一波长部分成分响应值低以及不同波长主成分响应值过高，导致图谱反映药材成分信息不全的情况，采用双波长等基线差示融合法对两个波长下的图谱进行融合。在满足中药化学成分“整体性”与“清晰性”的同时减轻了中药复杂体系的质量评控成本。本方法以对照药材为基准物质构建特征图谱，并以可代表黄芩药效的有限个代表性成分作为特征峰，评价对照药材和供试药材特征峰的相似度，可用于黄芩的真伪判断；选用保留时间稳定且价格低廉易获得的内标物质作为定量评价指标，开展基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究，通过内标物质化学成分的准确定量计算供试药材特征峰化学成分的相对含量。基于“质量”双标的黄芩质量分析方法，可有效解决黄芩有效成分同时快速测定和中药复杂体系质量评控成本高的问题。1 实验部分 1.1仪器Agilent1260高效液相色谱仪（HPLC）、Agilent 6550 QTOF MS质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）。1.2材料10批黄芩供试药材产地分别为内蒙古、山西、甘肃、陕北、黑龙江、辽宁、吉林、陕西、内蒙古、河北，编号为S1 S10，经辽宁中医药大学张慧教授鉴定均为唇形科植物黄芩的干燥根；黄芩对照药材（批号：120955201810，中国药品生物制品检定所）；黄芩苷（批号：110715201821）、黄芩素（批号：111595201607）、汉黄芩素（批号：111514201706）对照品均由中国食品药品检定研究所提供，质量分数不低于98%；汉黄芩苷对照品（批号：O0903AS）由大连美仑生物技术有限公司提供，质量分数不低于98%；甲醇、乙腈（质谱级，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；水（纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司）。969第 42 卷分析测试学报1.3溶液配制及特征图谱建立1.3.1对照品溶液的制备取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，加甲醇溶解，分别配制成质量浓度为0.251 0、0.108 0、0.112 0、0.150 0 mg/mL的单一对照品母液，备用；再分别各取适量配成质量浓度为0.179 0、0.034 10、0.015 60、0.021 30 mg/mL的混合对照品溶液。1.3.2对照药材溶液的制备精密称取黄芩对照药材粉末0.3 g，加70%乙醇40 mL，加热回流3 h，放冷，滤至100 mL量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，以70%乙醇定容，摇匀。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，过0.22 m微孔滤膜，即得。1.3.3供试品溶液的制备精密称取黄芩药材中粉（过四号筛）0.3 g，按“1.3.2”方法制成供试品溶液，即得。1.3.4色谱条件色谱柱：Agilent Poroshell 120 SBC18（4.6 mm 100 mm，2.7 m）；流动相：0.1%甲酸水（A）乙腈（B），梯度洗脱，0 10 min：20%B，10 12 min：20%23%B，12 28 min：23%B，28 30 min：23%40%B，30 40 min：40%B，40 45 min：40%100%B，45 48 min：100%B；流速为0.8 mL/min；柱温为30；DAD检测器波长为280、300 nm；进样量为10 L。1.3.5特征图谱的建立取黄芩对照药材和10批供试药材，按上述方法制备对照药材溶液和供试品溶液，并按“1.3.4”色谱条件进样检测，每份样品双样双针。参照实验室前期方法并加以改进16，分别从工作站中导出280、300 nm下CSV和AIA格式的数据，选取两个波长下CSV数据的最大响应值进行全时段等基线融合，同时为使图谱更全面清晰地反映药材质量，将10 14 min处响应较高的数据替换为300 nm下响应稍低的数据，最终得到差示融合数据。AIA格式数据经“中药指纹图谱相似度评价软件”转换为TXT数据，以差示融合数据替换AIA格式中的响应数据，保存TXT数据，建立10批供试药材的HPLC指纹图谱。以黄芩对照药材的图谱为参照谱图，使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，标定特征峰。1.4特征峰化学成分解析采用Agilent1260高效液相色谱仪以相对保留时间与对照品进行比对，利用Agilent 6550 QTOF MS质谱仪进行质谱分析，运用Agilent MassHunter Qualitative Analysis软件，通过对照品比对的方法对正离子模式下的化学成分进行解析，进一步明确共有峰的准确化学成分。1.4.1色谱条件色谱柱：Agilent Poroshell 120 SBC18（2.1 mm 100 mm，2.7 m）；流动相及洗脱程序同“1.3.4”；流速为0.3 mL/min；柱温为30；进样量为2 L。1.4.2质谱条件电喷雾离子源（ESI），正离子模式，毛细管电压3 500 V，干燥气与鞘气均为高纯氮气；干燥气：流速11 L/min，温度150；雾化器压力172.4 kPa；鞘气：流速10 L/min，温度350；质量扫描范围100 1 000 m/z。采用auto MS/MS模式，通过对照品比对及数据库查询等方法对特征峰化学成分进行解析。1.5基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究取黄芩供试品溶液，按“1.3.4”色谱条件进样分析。选取一个内标物对特征峰进行相对定量，供试品中特征峰化学成分的相对含量计算方法为：特征峰化学成分相对含量（%）=特征峰峰面积 （内标物含量（%）/内标物峰面积）。2 结果与讨论 2.1方法学考察2.1.1专属性分别取混合对照品溶液、供试品溶液，按“1.3.4”色谱条件进样分析，结果显示各主峰与杂质峰分离度良好，专属性强，见图1。2.1.2线性范围取“1.3.1”的黄芩苷对照品母液，逐级稀释，制备成质量浓度分别为0.251 0、0.125 5、0.062 75、0.031 38、0.015 69、0.007 844 mg/mL的黄芩苷系列溶液，分别按“1.3.4”色谱条件进样分析，以质量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=579.96X-27.552，r=0.999 9。结果表明，黄芩苷在0.007 844 2.510 g范围内呈良好的线性。2.1.3精密度取S1批次样品制备供试品溶液，在“1.3.4”条件下连续进样6次，各色谱峰保留时间、峰面积的相对标准偏差（RSD）均小于0.92%，表明仪器精密度良好。970第 8 期张强等：基于双波长等基线差示融合图谱的中药黄芩“质量”双标质量分析方法研究2.1.4稳定性取S1批次样品制备供试品溶液，在“1.3.4”条件下分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样，各色谱峰保留时间、峰面积的RSD值均小于1.6%，表明供试品溶液在24 h内稳定。2.1.5重复性取S1批次样品平行制备6份供试品溶液，在“1.3.4”条件下进样检测，得到黄芩苷的平均含量为12.34%，RSD为1.3%。各色谱峰保留时间、峰面积的RSD值均小于2.0%，表明方法重复性良好。2.1.6加标回收率精密称定供试黄芩粉末6份，每份0.15 g，分别精密加入相当于0.15 g药材含量的黄芩苷，按“1.3.3”方法制备供试品溶液，在“1.3.4”条件下进样检测，计算得到黄芩苷的平均加标回收率为99.5%（n=6），RSD为1.1%。2.2基于黄芩对照药材的特征图谱建立2.2.1特征峰标定针对单一波长部分成分响应值低以及不同波长主成分响应值过高，导致图谱反应药材成分信息不全的情况，采用双波长等基线差示融合法对两个波长下的图谱进行融合。与传统全时段融合法比较（图2），本方法可更清晰全面地反映黄芩药材的化学成分。通过对比10批供试药材共标定11个共有特征峰（见图3），共有峰面积占图谱的87%以上，其中2号峰的稳定性、重复性、分离度良好，故以其为参照峰S；将供试药材共有模式图谱与对照药材指纹图谱进行比对，得到图4。进行黄岑药材质量鉴定时，供试品色谱中应呈现11个共有峰，其保留时间应与对照药材色谱图中11个共有峰的保留时间相对应。由表1可知，供试药材中各特征峰的保留时间与对照药材一致，且各批次之间相对稳定，标准差小。图1专属性色谱图Fig.1Specificity chromatogramsA.test solution，B.mixed reference solution；2.baicalin，7.wogonoside，8.baicalein，9.wogonin图2传统全时段融合图谱（A）与差示融合图谱（B）Fig.2Traditional full time fusion spectrum（A）and differential fusion spectrum（B）971第 42 卷分析测试学报2.2.2相似度评价采用中国药典委员会“中药指纹图谱相似度评价软件”（2012.130723版本）进行数据处理，该软件利用夹角余弦法计算每个色谱图与对照药材图谱相比较的相似度。以黄芩对照药材和供试药材特征峰的相似度明确黄芩药材真伪（相似度应不低于0.900）。结果显示黄芩供试药材与对照药材的相似度均大于0.990（表2），说明所收集的黄芩供试药材质量相对稳定。图310批供试药材的HPLC叠加图谱Fig.3HPLC overlay spectra of 10 batches of tested medicinal materials1-11 were the same as those in Table 1图4对照药材图谱及供试药材共有模式图谱Fig.4Chromatograms of reference medicinal materials and common model of tested medicinal materials1-11 were the same as those in Table 1表1特征峰的保留时间及相对保留时间（x s，n=10）Table 1Characteristic peak retention time and relative retention time（x s，n=10）No.1234567891011Retention time of reference medicinal materials/min3.278 112.344 714.651 515.891 516.771 518.638 121.658 131.724 836.038 144.771 545.931 5Retention time of tested medicinal materials/min3.279 3 0.003 112.358 7 0.009 414.663 3 0.007 215.903 3 0.009 116.777 3 0.007 710.959 6 0.001 021.685 3 0.012 031.732 0 0.004 936.050 7 0.004 344.774 7 0.002 345.934 0 0.002 5Relative retention time0.265 3 0.000 3-1.186 5 0.000 61.286 8 0.000 61.357 5 0.000 71.509 4 0.000 91.754 7 0.000 92.567 6 0.001 72.917 0 0.002 03.622 9 0.002 63.716 7 0.002 8972第 8 期张强等：基于双波长等基线差示融合图谱的中药黄芩“质量”双标质量分析方法研究2.3特征峰化学成分解析利用对照品比对及数据库查询等方法对特征峰化学成分进行解析。正离子模式下鉴定出8个化学成分，其总离子流图见图5，鉴定结果见表3。经对照品比对，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素以及汉黄芩素分别对应图5中的2、7、8、9号峰；另外4种化学成分因无对照品，无法准确定位，根据二级碎片并与文献比较，鉴定为千层纸素苷、芹菜素、黄芩黄酮以及千层纸素A。表2供试药材相似度评价结果Table 2Evaluation of similarity for tested medicinal materialsBatchS1S2S3S4S5Similarity0.9980.9970.9980.9970.999BatchS6S7S8S9S10Similarity0.9950.9950.9990.9980.998图5黄芩正离子模式下的总离子流图Fig.5Total ion flow chart of Scutellaria baicalensis Georgi in positive modepeak numbers were explained in Table 3表3特征峰化学成分解析Table 3Analysis of characteristic peaks chemical compositionNo.2789MolecularformulaC21H18O11C22H20O11C22H20O11C15H10O5C15H10O5C16H12O5C19H18O8C16H12O5Retentiontime/min13.79220.59124.18832.29532.54437.10138.39338.739IontypeM+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+M+H+Detectedvalue（m/z）447.091 1461.108 8461.106 4271.059 3271.059 3285.074 8375.106 1285.074 5Calculatedvalue（m/z）447.092 2461.107 8461.107 8271.060 1271.060 1285.075 7375.107 4285.075 7Error/ppm-2.462.17-3.04-2.95-2.95-3.16-3.47-4.21Second orderfragment ion271.059 9253.048 5113.022 9285.075 0270.051 4259.906 4285.075 0270.051 5259.912 2253.047 6190.942 9123.007 1253.048 2169.011 0123.007 4270.051 4252.037 0241.046 9360.081 4345.059 4327.048 1270.0510183.027 5168.004 9CompoundBaicalin（黄芩苷）Oroxyloside（千层纸素苷）Wogonoside（汉黄芩苷）Apigenin（芹菜素）Baicalein（黄芩素）Wogonin（汉黄芩素）Scutellaria flavone（黄芩黄酮）Oroxylin A（千层纸素A）peak numbers were the same as those in Fig.5973第 42 卷分析测试学报2.4基于内标物质的相对定量结果各批次药材中黄芩苷的测定结果显示（表4），所有供试品中“黄芩苷”的含量均不低于9.0%，符合 中国药典 规定，同时该峰分离效果好、保留时间稳定居中、标准品价格低廉，故以其作为内标物质，开展基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究。每个供试品中特征峰化学成分的相对含量见表5。按照“1.5”方法计算，取“平均数标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限，供试药材根据此方法测得的特征峰相对含量不低于该含量下限为优质黄芩。结果表明，10个批次黄岑药材质量稳定，11个特征峰相对含量均在0.3%以上。说明所选指标合理，该方法可用于黄岑药材优劣的判断。2.5讨论中药是我国传统医药的重要组成部分，现行 中国药典 中，已对上百种中药品种进行了多指标含量测定，但部分对照品价格昂贵，提高了企业生产的成本。本研究创新研究思路，不依赖对照品，建立了以价格低廉易获得的对照药材为基准物质进行定性和不依赖多种对照品进行相对定量的黄芩药材“质量”双标控制方法，通过构建黄芩对照药材及10个不同产地黄芩供试药材的特征图谱，以对照药材为基准物质，评价对照药材和供试药材特征峰的相似度，用于判断黄芩药材的真伪，即“质”；同时通过准确定量一种内标物质化学成分，计算黄芩药材其余各特征峰的相对含量，确定的各特征峰相对含量的下限可对黄芩药材优劣进行区分，即“量”。本研究建立的“质量”双标方法能够有效判断黄芩的真伪以及优劣，形成科学、可控的中药质量控制体系，为中药质量控制和中药产业持续发展提供了探索性解决方案。传统一测多评法利用中药有效成分的内在函数关系和比例关系，通过测定一个主成分实现多个成分的同步测定，减少了对照品用量，降低了实验成本，提高了检测效率。但一测多评法依赖于同类多成分的同时测定，具有一定局限性。本文提出的“质量”双标法可对同一药材中的多种成分进行相对定量，相比一测多评法更加省时、方便。本研究选取响应值较高，分离度符合要求的化合物作为特征峰，共确定了11个特征峰。采用质谱技术指认出黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种黄酮类成分1718。3 结 论 本文通过收集不同产地的供试品，建立了基于“质量”双标的黄芩质量分析方法，所收集的黄表4内标物质黄芩苷的准确定量结果Table 4Accurate quantitative results of baicalin as an internal standard materialBatchS1S2S3S4S5Content/%12.3712.299.97611.7210.79BatchS6S7S8S9S10Content/%12.9612.5211.7411.7313.03表5基于内标物质的特征峰相对定量结果Table 5Relative quantitative results of characteristic peaks based on internal standardNo.12（S）34567891011Compound-Baicalin-WogonosideBaicaleinWogonin-Peak area（x s，n=10）18.958 1 1.291 0202.686 8 15.399 27.764 6 1.467 644.284 3 3.808 59.831 2 0.445 851.702 2 5.770 4128.864 9 11.663 131.113 0 6.917 113.970 8 3.825 26.518 4 0.187 46.713 7 0.431 4Relative content（x s，n=10）1.105 0 0.078 4-0.451 9 0.082 62.580 0 0.215 30.572 9 0.026 53.013 9 0.343 97.512 5 0.713 31.812 9 0.403 00.813 3 0.219 40.379 9 0.012 20.391 2 0.024 1Lower limit ofrelative content/%1.026 6-0.369 32.364 70.546 52.670 06.799 21.409 90.593 90.367 70.367 1the peak numbers were the same as those in Table 1974第 8 期张强等：基于双波长等基线差示融合图谱的中药黄芩“质量”双标质量分析方法研究芩供试药材与黄芩对照药材的相似度均大于0.990，说明所收集的黄芩供试药材的特征峰化学成分基本一致。但仅采用10批不同产地的药材对黄芩的优劣做出判断缺乏全面性。因此，为完善黄芩“质量”双标方法，还需收集更多产地药材形成科学、可控的中药质量控制体系，以满足对药材多项质量控制的要求，同时减轻企业购买对照品的经济压力，推动中医药事业可持续发展。参考文献：1Chinese Pharmacopoeia Commission.Pharmacopoeia of the People s Republic of China.Beijing：China Medical Science and Technology Press（中国药典委员会.中华人民共和国药典北京：中国医药科技出版社），2020：314315.2Wang H Y，Yang L，Wang D Y，Li L H，Wang X，An J，Zhang G，Peng L，Gao J，Yan Y G，Liu JJ.Shaanxi 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