实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的构建.pdf

Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期273网络出版地址：https：/ doi：10.3969/j.issn.1674-2257.2023.03.001论著实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的构建*谢文娟1，2，赵雅妮1，2，龙雪麟1，2，李淑蓉1，3，苏炳银1，2，谭泓琳1，21.成都医学院 发育与再生四川省重点实验室（成都 610500）；2.成都医学院 组织学与胚胎学教研室（成都 610500）；3.成都医学院 病理与病理生理学教研室（成都 610500）【摘要】目的通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）多肽两次免疫C57BL/6J小鼠，构建实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型。方法 将 8周龄C57BL/6J雌性小鼠按随机数字表法分为EAE组和对照组，每组 10只。EAE组采用MOG35-55多肽与完全弗式佐剂混合后的抗原乳剂，于小鼠双侧腹股沟和后肢分 4点皮下注射，首次免疫后 6 d注射相同剂量的抗原乳剂加强免疫，并且于首次免疫后 0、48 h腹腔注射百日咳毒素；对照组采用不含MOG35-55多肽的CFA，其余方 法同EAE组。观察两组小鼠的行为学表现并进行神经功能评分；免疫后第 19天，取两组小鼠的脑和脊髓组织进行Black Gold髓鞘染色和髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫荧光染色，检测其脱髓鞘情况；小胶质细胞特异性标志物（Iba-1）免疫荧光染色检测两组脑和脊髓组织中小胶质细胞的增殖活化情况。结果EAE组小鼠在首次免疫后第 12天左右开始发病，第 19天症状达到高峰，随后开始缓解，发病率为 100，而对照组小鼠只在首次免疫后第 14天出现短暂的尾巴无力症状。Black Gold髓鞘染色和MBP免疫荧光染色显示，EAE组小鼠脑和脊髓均出现脱髓鞘；Iba-1免疫荧光染色显示，EAE组小鼠脑和脊髓均出现小胶质细胞增殖活化；而对照组小鼠脑和脊髓并未出现脱髓鞘和小胶质细胞的增殖活化。结论 MOG35-55两次免疫C57BL/6J小鼠，成功构建发病率高的EAE模型，为多发性硬化症的致病机制研究和药物开发奠定基础。【关键词】多发性硬化症；实验性自身免疫性脑脊髓炎；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白；脱髓鞘【中图分类号】R74【文献标志码】AEstablishment of a Mouse Model of Experimental Autoimmune EncephalomyelitisXie Wenjuan1，2，Zhao Yani1，2，Long Xuelin1，2，Li Shurong1，3，Su Bingyin1，2，Tan Honglin1，2.1.Key Laboratory of Development and Regeneration of Sichuan Province，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；2.Department of Histology and Embryology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China；3.Department of Pathology and Pathophysiology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China 【Abstract】ObjectiveTo establish an experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）model in C57BL/6J mice by twice immunizations with myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide（MOG35-55）.MethodsEight-week-old female C57BL/6J mice were divided into two groups by using a random number table，namely EAE group（n=10）and control group（n=10）.For EAE induction，mice were subcutaneously injected with MOG35-55 peptide emulsified in complete Freunds adjuvant（CFA）at four sites on each side of the inguinal groove and posterior limb.Six days after the initial immunization，mice were boosted with the same dose of antigen/adjuvant emulsions.Moreover，pertussis toxin was given intraperitoneally on the day of initial immunization and 48 hours afterwards.The control group received CFA without MOG35-55 and pertussis toxin.All mice were observed and scored daily based on their behavioral changes.On day 19 post-immunization，the brain and spinal cord were removed and examined for demyelination by Black Gold II staining and myelin basic protein（MBP）immunofluorescent staining.The microglial proliferation and activation in the brain and spinal cord were detected by microglia-specific marker（Iba-1）immunofluorescent staining.ResultsIn mice of EAE group，clinical signs of EAE started on day 12 and peaked on day 19 post-immunization，and then subsided *基金项目：国家自然科学基金青年项目（No：32200958）；四川省自然科学基金青年项目（No：2022NSFSC1575）；发育与再生四川省重点实验室开放基金（No：SYS20-0152）；成都医学院科研基金（No：CYZYB20-01）通信作者：苏炳银，谭泓琳 Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期274多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病，常累及脑、脊髓和视神经，其主要病理特征包括脱髓鞘、轴突损伤及神经炎症1。MS发病年龄在 2040岁，是青壮年致残的主要疾病之一2。目前，MS的病因和发病机理尚未明确，由于MS患者的脑组织标本不易获取，限制了对该疾病的基础和临床研究，因此构建合适的动物模型十分必要。目前常用的MS模型包括实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）、铜螯合剂-新铜试剂等毒素诱导的脱髓鞘模型和小鼠脑脊髓炎病毒模型，其中EAE模型与人类疾病十分相似，因此在科研中应用广泛，其原理是给动物体内注射某些抗原物质，引起机体免疫系统识别异常，从而导致髓鞘、轴突等结构的免疫性损伤。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）虽然只占髓鞘总蛋白的 0.05左右，但由于其在少突胶质细胞膜上表达，因此具有很强的免疫原性3。MOG35-55是MOG细胞膜表面致脑炎的抗原决定簇之一，其敏感小鼠品系为C57BL/6J小鼠4，该品系在国内常见且遗传背景清晰。本研究以MOG35-55作为抗原两次免疫C57BL/6J小鼠，同时注射百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）制备EAE模型，通过临床症状评分和组织病理学检测分析模型是否构建成功，以期为进一步研究MS的发病机制、病理过程及药物开发提供实验基础。1材料与方法1.1实验动物 SPF级 8周龄C57BL/6J雌性小鼠，体重 1820 g，20只，购于成都达硕实验动物有限公司，按随机数字表法分为EAE组和对照组，每组 10只。所有小鼠按照SPF级标准饲养，环境要求如下：室内温度 18 29，相对湿度 4070，气流速度 0.18 m/s，新鲜空气换气次数 10次/h，洁净度 10 000级，氨浓度 15 mg/m3，光照度 150300 Lux，噪声 60 dB。实验小鼠正常进食、饮水，定期更换垫料、饮水等。1.2试剂与仪器MOG35-55多肽由上海生物工程有限公司合成（货号：T510219），经质谱分析纯度 97；卡介苗灭活冻干粉购自上海晶诺生物科技有限公司（货号：GOMY0147）；不完全弗氏佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）购自 上 海sigma-Aldrich公 司（货 号：F5506）；PTX购 自 上海sigma-Aldrich公 司（货 号：P7208）；髓 鞘 碱 性 蛋 白抗 体（anti-myelin basic protein，Anti-MBP）购 自 美 国Millipore公司（货号：NE1019）；小胶质细胞特异性标志物抗体（Anti-Iba1）购于上海Abcam公司（货号：ab178847）；Anti-Mouse IgG（货 号：31160）、Anti-Rabbit IgG（货 号：31210）购自美国Invitrogen公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）购自安徽biosharp生物科技有限公司（货号：BS114）；曲拉通X-100（Triton X-100）购自上海生工生物工程股份有限公司（货号：A600198）；Black-Gold 染色试剂盒购自上海sigma-Aldrich公司（货号：AG105）。倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司（型号：BX-63）；脱色摇床购自太仓市华利达实验设备有限公司（型号：ZD-9556）；冰冻切片机购自美国Thermo公司（型号：CM1950）。1.3试剂配制抗原乳剂：将 100 mg卡介苗灭活冻干粉加入到 10 mL IFA中，使之成为完全弗式佐剂（complete Freund s adjuvant，CFA）；4 mg MOG35-55多肽溶于 1.33 mL 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS），即配制浓度为 3 g/L的多肽液；MOG35-55多肽液（3 g/L）与CFA按 11比例混合，用注射器反复推拉乳化，制成“油包水”的抗原乳剂。PTX溶液：50 g PTX溶于 1 mL PBS，配制成 50 mg/L的PTX储备液，使用浓度为 1 mg/L。1.4EAE 的构建EAE组小鼠在双侧腹股沟及后肢分 4点皮下注gradually，with the incidence of 100.However，mice of control group only displayed temporary symptoms of tail atony on day 14 post-immunization.Black Gold II staining and MBP immunofluorescence staining showed both brain and spinal cord demyelination in mice of EAE group.Iba-1 immunofluorescence staining showed that microglial proliferation and activation also occurred in the brain and spinal cord of EAE mice.However，no demyelination or microglial proliferation and activation were found in either brain or spinal cord of control group.ConclusionThe EAE model with high incidence is successfully established in C57BL/6J mice by twice immunizations with MOG35-55，which lays a foundation for future pathogenesis research and drug discovery of multiple sclerosis（MS）.【Key Words】Multiple sclerosis；Experimental autoimmune encephalomyelitis；Myelin oligodendrocyteglycoprotein；DemyelinationJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期275射，每点注射 50 L乳剂。于首次免疫后 0、48 h腹腔注射PTX（1 mg/L）200 L，6 d后在相同部位注射相同剂量抗原乳剂加强免疫。对照组小鼠在双侧腹股沟及后肢分 4点皮下注射不含MOG35-55多肽的CFA，其余实验方法均与EAE组相同。1.5 神经功能评分建模后，根据Kelero等5提出的神经功能评分标准，课题组成员每天观察两组小鼠行为学变化，并对小鼠的神经功能进行评分（表 1）。（1200），室 温 孵 育 1.5 h；PBS清 洗 3次 后，使 用 含DAPI的抗荧光淬灭剂进行封片，荧光显微镜下观察及拍照。3）Black Gold染色：切片复水后放入 60 Black Gold 染色液染色到合适深浅的颜色，染色时间 1520 min，采用 95、75酒精进行梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。2结果2.1两组小鼠神经功能评分比较EAE组小鼠在首次免疫后第 12天开始发病，在第19天症状最为显著，随后病情有所缓解，发病率为 100。EAE组小鼠首先出现尾部张力下降，接着出现尾部瘫痪拖垂、步态摇摆、后肢无力、后肢瘫痪等症状。对照组小鼠在首次免疫后第 14天左右出现短暂的尾巴无力症状（图 1）。2.2两组小鼠脱髓鞘情况比较Black Gold髓鞘染色结果显示，EAE组小鼠脊髓白质着色比对照组浅，脊髓灰质的丝状着色明显减少（图 2AB），同时EAE组小鼠大脑胼胝体区域着色相比对照组更浅（图 2CD）。MBP的免疫荧光染色结果显示，EAE组小鼠脊髓和大脑的MBP着色较对照组浅（图 3），提示EAE组小鼠脊髓和脑组织发生了脱髓鞘。表 1小鼠神经功能评分（分）评分标准评分无临床症状0.0尾巴无力1.0尾巴瘫痪2.0单侧后肢轻度无力2.5单侧后肢显著无力3.0单侧后肢瘫痪4.0单侧后肢瘫痪伴随对侧后肢无力或同侧前肢轻度无力4.5双侧后肢瘫痪5.0双侧后肢瘫痪伴随单侧前肢瘫痪6.01.6 组织取材与检测1）取材：在EAE组小鼠症状较严重时（免疫后第19天），腹腔注射 4水合氯醛对小鼠进行麻醉，使用消毒灭菌后的手术器械，快速打开小鼠胸腔，充分暴露心脏，经左心室灌注 1PBS充分洗净组织中的血液，观察肝脏颜色变白后改用 4多聚甲醛灌注，充分固定后立即取出小鼠的大脑和脊髓组织，放入 4多聚甲醛液中进行后固定，固定好的组织进行梯度脱水，OCT包埋并冰冻切片（20 m）。2）免疫组织化学染色：切片置于PBS复水，随后滴加封闭液（5 BSA+1.5 Triton X-100+1PBS）于 37孵育 60 min；滴加Anti-MBP、Anti-Iba1抗 体（1500），4 孵 育 过 夜；PBS清洗 3次 后，滴 加DyLight 488标 记 的 山 羊 抗 兔 二 抗 图 1两组小鼠神经功能评分比较510?d?EAE?00.51.01.52.02.53.03.54.0152025图 2两组小鼠脊髓组织Black Gold染色注：A、C：对照组；B、D：EAE组。?100 m 100 m 100 m 100 m ABCDJournal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期2762.3两组小鼠小胶质细胞增殖情况比较免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，EAE组小鼠脊髓和大脑皮层区域的小胶质细胞数量明显增多，同时伴随小胶质细胞胞体增大、突起增多等形态学改变（图 4），提示EAE组小鼠脊髓和脑组织的小胶质细胞处于增殖活化状态。图 3两组小鼠MBP免疫荧光染色注：A、C：对照组；B、D：EAE组。?100 m 100 m25 m25 mABCD图 4两组小鼠Iba-1染色注：A、C：对照组；B、D：EAE组。?100 m100 m50 m50 mABCD3讨论MS的病因和发病机制目前尚未明确，认可度较高的理论是由于病毒或某些抗原物质触发了机体自身免疫反应，从而损害髓鞘及其包裹的神经元轴突，基于该理论建立了不同的EAE模型，目前所制备的动物模型还不稳定，需要进一步探索。本研究采用的抗原物质是MOG35-55多肽，与其他髓鞘蛋白相比，如MBP、髓鞘蛋白脂质蛋白（myelin proteolipid protein，PLP）等，MOG因在少突胶质细胞膜表面表达而具有很强的免疫原性，并且MBP的敏感小鼠品系是B10.PL和PL小鼠6，PLP的敏感小鼠品系是SJL和SWXJ小鼠7-8，这些品系在国内不易获得，而MOG的敏感小鼠品系C57BL/6J，是常见的实验小鼠品系。在构建EAE模型时，通常会加入强效佐剂CFA，增强抗原的免疫反应强度并延长免疫反应时间9，刺激大量吞噬细胞摄取和呈递抗原以及CD4+T细胞的增殖活化10，提高模型成功率。而PTX具有破坏血脑屏障的作用，使外周反应性T细胞得以进入中枢神经系统分泌相关细胞因子，促进炎症反应发生10-11。目前大多数EAE模型构建只进行 1次免疫诱导，本研究采用MOG35-55和CFA的混合乳剂两次加强诱导C57BL/6J小鼠，并对注射部位进行了调整，在小鼠双侧腹股沟和下Journal of Chengdu Medical College,2023,Vol.18,No.3成都医学院学报 2023 年第 18 卷第 3 期277肢分 4点进行皮下注射，于首次免疫后 0、48 h腹腔注射PTX破坏血脑屏障，然后根据小鼠的行为学表现进行神经功能评分，并进行组织病理学检测，发现EAE组小鼠在免疫后第 12天开始发病，第 19天症状最为严重（神经功能评分3.5分），表明该方法构建的EAE模型稳定，且发病率为 100。本研究中对照组小鼠在免疫后第 14天左右出现短暂的尾巴无力症状，推测是由CFA中的结核分枝杆菌及注射的PTX引发的炎症所造成的。脱髓鞘是MS主要的病理特征。本研究中Black Gold髓鞘染色和MBP免疫荧光染色结果表明，EAE组小鼠的脊髓和大脑胼胝体均出现脱髓鞘，并且大脑胼胝体的脱髓鞘要迟于脊髓，原因可能与免疫部位位于腹股沟和后肢有关。胶质细胞活化是MS常见的一个病理学特征，与中枢神经系统炎性损伤密切相关12。本研究发现，EAE组小鼠脊髓和大脑的小胶质细胞增殖活化，提示小胶质细胞参与了脱髓鞘和神经变性。活化的小胶质细胞在EAE发病过程中扮演着双重角色：一方面，小胶质细胞活化会增强抗MOG的自身免疫反应，参与炎症级联反应，加重髓鞘脱失和轴突损伤；另一方面，小胶质细胞能吞噬、清除崩解的髓鞘碎片，并招募少突胶质细胞前体细胞到达脱髓鞘部位进行髓鞘修复，促进髓鞘再生13-14。综上所述，本研究建立的EAE模型发病率为 100，EAE组小鼠表现为平衡失调及运动功能障碍，脊髓和脑组织均发生髓鞘脱失及小胶质细胞活化，符合MS的临床表现及病理特征，因此本研究采用MOG35-55两次免疫C57BL/6J小鼠成功构建了EAE模型。该方法的优点在于易于诱导，能模拟出MS的典型特征（脱髓鞘和炎症损伤），且发病率高、病程稳定，但该模型也存在一定的局限性。EAE模型是人工诱导的免疫应答，以CD4+T细胞反应为主，而MS患者发生的免疫反应以CD8+T细胞和B细胞介导为主。此外，EAE诱导的脱髓鞘主要是轴突损伤后的继发性脱髓鞘，原发性脱髓鞘较少，故该模型与人类MS存在一定差异，仍需进行大量研究以建立更好的MS模型，为后续药物开发奠定基础。参考文献1 Hauser S L，Cree B A C.Treatment of multiple sclerosis：a reviewJ.Am J Med，2020，133（12）：1380-1390.2 Compston A，Coles A.Multiple sclerosisJ.Lancet，2008，372（9648）：1502-1517.3 Bernard C C，Johns T G，Slavin A，et al.Myelin oligodendrocyte glycoprotein：a novel candidate autoantigen in multiple sclerosis J.J Mol Med（Berl），1997，75（2）：77-88.4 Kuerten S，Javeri S，Tary-Lehmann M，et al.Fundamental differences in the dynamics of CNS lesion development and composition in MP4-and MOG peptide 35-55-induced experimental autoimmune encephalomyelitisJ.Clin Immunol，2008，129（2）：256-267.5 Kerlero de Rosbo N，Bernard C C，Simmons R D，et al.Concomitant detection of changes in myelin basic protein and 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